この研究は、ドイツ連邦教育研究省（BMBF）（助成金＃13GW0043C）と欧州航空宇宙研究開発局（EOARD、助成金＃FA9550-15-1-0443）

1.RPE細胞培養<ol><li> ブタの眼からのRPE細胞の単離 <ol><li>地元の屠殺場から新しく除核されたブタの目を入手する。冷暗所に保管してください（4℃）。 </li><li>はさみで細胞外組織を除去し、5分間消毒液に目を浸します。 </li><li>使用するまでカルシウムとマグネシウムを含まない滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS（ - ））に眼を入れます。 </li><li>メスを使用して、角膜輪部の約5mm後に強膜に浸透する。はさみで角膜輪部に平行に切開して、眼の前部全体を切除する。 </li><li>眼の前部（ すなわち、角膜およびレンズ）および硝子体を除去する。 1mLのPBS（ - ）を加え、穏やかに神経網膜を除去する。 注：強膜、脈絡膜およびRPEからなるこの「眼球カップ」は、今すぐ準備ができています。 </li><li> Pで予熱した（37℃）0.25％トリプシンを添加する。BS（ - ）をアイカップに送る。アイカップの約80％がこのトリプシン溶液で満たされるように容量を調整する。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃で10分間、トリプシン溶液とアイカップをインキュベートする。 </li><li>インキュベーターからアイカップを取り出し、0.05％トリプシン+ 0.2％エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（EDTA・4N）を含むPBS（ - ）溶液で0.25％トリプシン溶液を交換する。アイカップをインキュベーター内で45分間インキュベートする。 注：45分後、RPE細胞はブルッフ膜にちょうど緩く付着しているか、またはすでに剥離してトリプシン-EDTA溶液に浮遊しているかのいずれかである。 </li><li>穏やかなピペッティングでRPE細胞を集める。 10％ブタ血清、抗生物質/抗真菌剤、およびピルビン酸ナトリウム（1mM）を含む10mLの培養培地（L-グルタミンを含むDMEM高グルコース）で満たされたコニカルチューブに細胞および溶液を集める。 注：血清はトリプシンの作用を中和することがあります。 </li><li>遠心分離機室温で5分間、400×gでの細胞懸濁液。 </li><li>上清を除去し、新鮮な培地10 mLを加える。同じ条件で再度5分間遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、細胞濃度が5×10 5細胞/ mL（血球計数器を用いて細胞を計数することによって決定される）になるように、新しい培地を加える。穏やかなピペッティングでよく混合する。 </li><li>細胞懸濁液を細胞培養皿に分配する。直径60 mmの培養皿あたり3 mLを使用する。 注：この培養は継代ゼロ（P0）と呼ばれます。 </li><li> 37℃で5％CO 2インキュベーター内で細胞を維持する。条件培地の半分を2日ごとに新鮮な培地に交換する。 </li><li>コンフルエントになる場合は継代培養（ステップ1.2）。 </li></ol></li><li> RPE細胞培養の継代培養 <ol><li>培地を除去し、細胞をPBS（ - ）で2回リンスします。 </li><li> 0.05％トリプシン+ 0.2％EDTAを含むPBS（ - ）溶液と細胞をインキュベートするi5％CO 2インキュベーター中、37℃で5分間インキュベートした。 </li><li>穏やかなピペッティングによりRPE細胞を分離し、10％ブタ血清を含む10mLの培養培地で満たした円錐管内で細胞懸濁液を収集する。 </li><li>室温で5分間400xgで細胞懸濁液を遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、細胞濃度を5×10 5細胞/ mL（血球計数器で細胞数を数えることによって決定）とする新しい培地を加える。ステップ1.1.13に記載されているように、直径60mmの新しい培養皿に細胞を分配する。 注：細胞培養は現在、継代1（P1）です。 </li><li>コンフルエントに達した後、ステップ1.2.1〜1.2.5に記載したのと同じ手順を用いて、P1培養物をP2に継代培養する。 P2培養物から、直径60mmの培養皿の代わりに、より小さい培養皿（内径30mm）上に細胞を播種する。 </li><li>実験のために、P2またはP3培養物を使用する。 </li></ol></li></ol> 2. Thuliumレーザー照射<ol><li> 照射ステーションの構造 <ol><li>ツリウムレーザー装置（1.94μm、出力範囲：0-20 W）を0.22 NA、365μmのコア径のファイバーに接続します。 </li><li>照射ステーションの垂直金属ポストに水平に固定された金属アームにファイバ先端を機械的に固定する。照射中にレーザーファイバーの先端が細胞培養皿が置かれるホットプレートの上に位置するように垂直ポストを置く。 </li><li>ホットプレート上に白い紙を置き、エイミングビームをオンにします（λ= 635 nm、最大= 1 mW、紙面の直径≈30 mm）。白い紙にエイミングビームの周囲をマークし、照射中に培養皿を置く位置がわかるようにします。 注：ファイバチップのz面は変更可能です。追加の結像光学系がなければ、ファイバー先端より12cm下に置かれた細胞培養面上のレーザースポット直径、i約30mmであり、これは細胞培養皿の内径とほぼ同等である。セットアップの概略図を図1に示します 。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" /> 図1：ツリウムレーザー照射ステーションの模式図培養プレートを加熱プレート上に置く。ビームサイズが培養皿の内径（約30mm）とほぼ同じになるように細胞をツリウムレーザーファイバーチップの12cm下に置く。レーザー照射手順は、カスタムメイドのシステム設計プラットフォームの時間制御ルーチンによって制御されます。照射プログラムを開始する前に、出力設定を決定する必要があります。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <olstart = &quot;2&quot;&gt; <li> 細胞培養のレーザー照射 <ol><li>照射の1時間前に、1.2mLの新鮮な培地で完全に培地を交換する。 注：これは重要なステップであり、厳密に従わなければなりません。 </li><li>クリーンベンチに照射ステーション（ すなわち、ホットプレートとレーザーファイバーを固定するポスト）を置きます。 </li><li>インキュベーターから細胞培養皿を取り出し、ホットプレート上のマークされた位置に置く（ステップ2.1.3）。 </li><li>保護眼鏡を着用してください。ツリウムレーザーをオンにします。レーザー装置に必要に応じてパワーを設定します（0〜20 W調整可能）。エミッションをオンにします。 </li><li>レーザー照射とタイミングプロトコル（補足ファイル）を制御するシステム設計プラットフォームを開始します。 </li><li>培養プレートをホットプレート上に置いた直後に、「予熱時間」をクリックして140秒間タイマーを開始する（「予熱時間1」）。これは培地の温度を3℃に保つ照射前7℃。 注：140秒後、ビープ音が鳴り、次のタイマー（「予熱時間2」）が自動的に8秒カウントを開始します。この8秒間に、審査官は培養皿を開けることができる。 148秒の予熱後、細胞培養上で10秒間のレーザー照射が自動的に行われる。緊急時にはレーザー装置を強制停止ボタンで操作してレーザーを直ちに停止させてください。これは重要なステップであり、厳密に従わなければなりません。注意の特別な点は、8秒の予熱時間の開始時に、照射の直前に皿のカバーを開くことに関する。カバーを開くと、メディア表面が非常に急速に冷却されることがあります。 </li><li>照射後、直ちにカバーを培養皿の上に置き、培養皿をホットプレート上にさらに7秒間放置し、37℃、5％CO 2インキュベーターに戻す。 </li></ol></li><li> その際の温度分布の測定細胞レベル（温度較正） <ol><li>直径30mmの培養皿（細胞なし）の4辺（90°ごと）の底に近い小さな穴（直径約300μm）を作る。ブンゼンバーナーで加熱したニードル（20G）の先端を使用してください。外部から電気絶縁テープで穴を塞ぎ、細い針で小さな穴を作って、水密状態でこの穴に微細な熱電対（直径200μm）のみを挿入できるようにします。 </li><li>培養皿の底の外側で、2つの垂直直径を描き、交差点（ すなわち、底辺の中央）を座標ゼロ（0）として設定する。線に沿って各方向にディッシュ（ すなわち、 0、3、6、9、12、および15 mm）を外側に放射状に3 mmごとに印を付ける（ 図2の青い点）。ポイント数は合計で21でなければなりません。 </li><li> 1.2 mLの新しい培地で細胞培養皿を満たします。文化dを置く37℃でホットプレート上に置いて、細い熱電対（直径200μm）を側面の穴に挿入し、感知先端を測定すべきマークされた位置に置きます。 </li><li>保護眼鏡を着用してください。ツリウムレーザーをオンにして、レーザー装置のパワー（0.1W単位で0Wと20Wの間）を手動で設定します。 注記：温度校正の場合、電力を3 W単位で測定するだけで十分です。 </li><li>システム設計プラットフォームの電源を入れ、 &quot;Start Temp。Acquisition&quot;ボタン（補足ファイル）をクリックして温度測定を開始します。 </li><li>手順2.2.6と同じ手順を実行します。 注記：制御プログラムは、挿入された熱電対の温度を100 msごとに測定し、GUIでの照射中の温度の変化を示します。 </li><li>これらの手順は21の測定点すべてと異なる電力設定で実施してください。すべてのポイントとすべてのパワーセッティングについて、手順全体を3回繰り返します信頼性の高いデータを得ることができます。 </li><li>温度データをcsvデータとしてエクスポートし、最終的にスプレッドシートに変換することができます。すべての点で3回測定した場合の照射終了時の最高温度の平均値。同じ円上の点からの値を平均します（中心点を除いて合計4点）。 </li><li>得られた平均最高温度をグラフ上にプロットし、ディッシュの中心からの距離（mm）をx軸、温度上昇（ΔT、℃）をy軸とする。数学的ソフトウェアプログラムのフィット関数を使用して、ガウスモデルを生データに適合させます。ガウス適合温度分布を作成します。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" /> 図2：1つの細胞培養プレートにおける温度較正のポイント。温度データを中央で測定し、5℃で測定した。4つの異なる角度（青い点）上の放射状の点。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 異なる熱照射後の細胞応答の生物学的評価<ol><li> 異なるパワー設定および細胞死閾値の決定後の細胞生存度（ すなわち、生存、アポトーシスおよび死亡）の評価 <ol><li>示された時点（ すなわち、照射後3時間、24時間および48時間）で、細胞をPBS（ - ）で洗浄し、市販のキットを使用して、細胞生存度（ すなわち生存、アポトーシス、プロトコル。 </li><li> 5μLのフルオレセインイソチオシアネート（FITC） - アネキシンV、5μLのエチジウムホモダイマーIII、および5μLのHoechst 33342を100μLの1×結合緩衝液に添加することによって染色溶液を調製する（全てキットコンポーネント）。細胞を覆うのに十分な染色溶液を調製する。細胞を15分間インキュベートする。 </li><li>結合緩衝液で細胞培養液を2回洗浄し、結合緩衝液をPBS（ - ）で置換し、蛍光顕微鏡の段階で培養物をセットする。 </li><li>光路を接眼レンズに切り替え、4 &#39;、6-Diamidin-2-phenylindol（DAPI）フィルターを選択し、照明灯を点灯させ、4倍の対物レンズで焦点面を見つけます。 </li><li>カメラへの光路を変更し、顕微鏡イメージングソフトウェアでコンピュータ画面上の画像を見つけて、焦点を調整します。 </li><li>細胞培養皿全体の蛍光画像を得るために、顕微鏡特有のソフトウェアのステッチ機能（ すなわち、ディッシュ全体に複数の画像を記録し、次いで単一の大きな画像を作成する機能）を使用する。 DAPI、FITC、およびテトラメチルローダミン（TRITC）の3種類のフィルターセットを使用して、Hoechst 33342陽性細胞（すべての細胞核）、FITCアネキシンV陽性細胞ve細胞（アポトーシス）、およびエチジウムホモダイマーIII-陽性細胞（死滅）を示した。 </li><li>染色された細胞培養物中の死んだ（エチジウムホモダイマーIII陽性）領域の半径（mm）およびアポトーシス（アネキシンV陽性）バンド形態領域の外側/内側半径を測定する。これらの半径を、対応する出力設定の温度分布のフィットしたガウス関数に適用します。細胞死およびアポトーシス変化の閾値温度を明らかにするために、死んだまたはアポトーシス領域の縁の正確な温度を計算する。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

温度に関連する生物学的細胞応答を議論する際には、ほとんどの生化学的過程が時間依存的であるので、温度だけでなく、温度の上昇時間も重要である。特に、眼科におけるレーザー誘発高熱症の分野では、ミリ秒から秒までの短い時間範囲のため、正確な温度制御による細胞熱作用を調べることは困難である。したがって、厳密な温度および時間制御を可能にする操作システムを有する細?...

温度依存性の細胞生物学的応答を理解することは、温熱治療を成功させるために非常に重要である。眼科で使用される熱レーザーによる網膜レーザー光凝固は、医学において最も確立されたレーザー治療の1つである。主に緑色から黄色の波長の可視光線が、網膜レーザー治療に使用されます。光は、網膜の最も外側の細胞単層を形成する網膜色素上皮（RPE）細胞のメラニンによって高度に吸収される。様々な種類の網膜障害に対する新しい治療戦略として、非常に軽度の熱照射（目に見える光凝固）の医師および研究者の間で最近の関心があった1,2 。この傾向に続いて、私たちの関心は、温度制御型光熱治療（TC-PTT）と呼ばれる技術である正確な温度制御下でRPE細胞を致死的に加熱することにあります。 最近のオプト我々の研究所の音響技術は、網膜の照射部位における温度上昇のリアルタイム測定を可能にしている。これにより、照射中の温度上昇を制御することができます3 。しかし、網膜上の致死量以下の温熱療法は、温度を測定し制御することが不可能であることから以前は考慮されていなかったため、熱レーザー照射後のRPE細胞の温度依存性細胞応答は、今日までほとんど研究されていない。さらに、温度差は詳細に議論されていないだけでなく、致死量以下の照射後の生き残った細胞の細胞挙動の差異も有する。したがって、TC-PTTに基づく治療法に関する科学的証拠を収集するために、温度依存性RPE細胞の生物学的応答およびそれらのメカニズムをin vitro実験装置を用いて解明することを目的とする。 t彼の目的は、1）迅速な温度上昇の可能性、2）正確に制御された時間および温度、および3）生物学的実験のための検査細胞の比較的高い数の条件を満たす細胞加熱装置を確立することが必要である。加熱方法に関しては、周波数が倍増されたNd.YAGレーザー（532nm）のような臨床レーザーは、残念なことに、細胞培養加熱には不適当である。これは、培養されたRPE細胞におけるメラノソームの数が著しく減少したためである。レーザ光の吸収は不均質であり、細胞レベルでの温度上昇は、同じ放射能を照射した場合であっても、実験の間に可変である。いくつかの以前の研究では、照射4の間の皿の底の下の黒い紙の使用、または実験5,6の前に培養細胞によって貪食された追加のメラノソームの使用が報告されている。たくさんの温熱プレート、水浴、または温度設定7の CO 2インキュベーターを使用して、温熱療法によって誘発された細胞応答を評価するためのin vitro生物学的研究を行った。これらの方法は、所望の温度に到達するまでにある時間（ すなわち、数分）を要するため、長い加熱期間を必要とする。さらに、これらの方法を使用すると、細胞レベルでの詳細な熱履歴（ すなわち、時間を掛けた温度）を得ることは困難である。さらに、1つの培養ディッシュ内の異なる位置にある細胞間の温度は、可変温度拡散によって異なる場合がある。大部分の場合、生物学的細胞応答は、温度の上昇および温度の持続時間によって致命的な影響を受ける可能性があるが、温熱療法中のこの時間的および空間的温度情報は、生物学的分析のため考慮されていない。 これらの問題を克服するために、contiここでは、セルを加熱するために裸波ツリウムレーザーを使用した。ツリウムレーザー放射（λ=1.94μm）は水8に強く吸収され、培養皿の底の細胞は熱拡散のみによって熱刺激される。直径365μmのレーザーファイバーは培養皿の約12cm上に置かれ、その間に光学機器はありません。レーザービームの直径は、培地の表面で培養ディッシュ（30mm）の内径とほぼ等しくなるように発散する。一定量の培養培地を用いて、温度上昇を細胞に照射することが可能である高い再現性があります。可変出力設定では最大20Wの照射が可能で、細胞レベルでの媒体温度は10秒でΔT≈26℃まで上昇する可能性があります。 照射条件を変更することにより、レーザビームプロファイルを変更して温度分布を変化させることも可能である文化皿で。例えば、現在の研究のように、ガウス様の温度分布で、または均一な温度分布で調べることが可能である。後者は、温度依存性細胞応答の影響を、より具体的には致死量以下の温度上昇について調べるのに有利であり得るが、細胞死ストレスまたは創傷治癒応答についてはそうではない。 総合的には、ツリウムレーザー照射は、異なる熱曝露の後に、遺伝子/タンパク質発現、細胞死速度論、細胞増殖、および細胞機能発現などの異なる種類の生物学的因子の調査を可能にすることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

生物学的評価のために1.94μmの連続波ツリウムレーザーを用いて培養細胞を加熱する独自の方法をここに導入する。ツリウムレーザー放射は水に強く吸収され、培養皿の底の細胞は熱拡散によって加熱される。直径365μmのレーザーファイバーは培養ディッシュの約12cm上に置かれ、レーザービーム直径は培養ディッシュの内径（30mm）とほぼ等しくなるように光学的には設定されていない。各実験において培地の量を一定に保つことにより、再現性の高い温度上昇を細胞に照射することが可能である。 1つの細胞培養皿中の各パワー設定についての温度上昇およびその分布を較正するために、異なる位置および細胞レベルで10秒の照射中に温度を測定した。温度分布は、数学的グラフィックスソフトウェアプログラムであり、文化皿全体のパターンはガウス型であった。レーザー照射後、異なる生物学的実験を行って、温度依存性細胞応答を評価することができた。この原稿では、異なる時点後の細胞アポトーシスおよび死亡の閾値温度を決定するのを助けるために、生存率染色（ すなわち 、生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞の区別）を導入する。 この方法の利点は、温度および加熱時間の正確さ、ならびに細胞培養皿全体における加熱細胞におけるその高い効率である。さらに、コンピュータ化されたオペレーティングシステムによって十分に制御され得る、多種多様な温度および時間間隔での学習が可能になる。

異なる電源設定後の温度分布温度較正では、各単一照射のすべての温度の変化を監視した。このデータから、測定された点における最大温度が得られ、T max （℃）として定義された。 図3Aに示すように、培養皿を加熱プレート上に置いた時点でプログラムを実行した。安定した培地温度を37℃?...

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Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

1.94μmの連続波レーザー放射を用いた培養皿内の細胞を加熱するための元の実験装置をここに導入する。この方法を用いて、異なる熱暴露後の網膜色素上皮（RPE）細胞の生物学的応答を調べることができる。

培養細胞を加熱して細胞の熱作用を調べるための連続波型ツリウムレーザー

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

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JoVE Journal

Biology

7.7K ビュー.  University of Luebeck.  1.94μmの連続波レーザー放射を用いた培養皿内の細胞を加熱するための元の実験装置をここに導入する。この方法を用いて、異なる熱暴露後の網膜色素上皮（RPE）細胞の生物学的応答を調べることができる。 

ビデオ: Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

生物学

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

培養細胞からの染色体の準備

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

培養中の細胞小器官輸送<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...