この研究はミネルバ財団、HFSP組織、および欧州研究評議会助成金（グラント338265を開始する）によってサポートされていました。

「化学トランスデューサー」の1合成<ol><li>予備の準備<ol><li> 2 M酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA）バッファは、超純水の酢酸の114ミリリットルと400ミリリットルとトリエチルアミン278ミリリットルを混合して準備します。暗いボトルに保管してpHを7に調整し、1 Lの最終体積に水を追加します。 注：このソリューションは、年間安定です。 </li><li>超純水20ml中にアスコルビン酸の18ミリグラムを溶解することにより5mMのアスコルビン酸溶液を調製します。新鮮な溶液を使用してください。溶液を1日間安定です。 </li><li>超純水の10ミリリットルと11ミリリットル中TBTA 58mgのジメチルスルホキシド（DMSO）で銅25mgの（II）五水和物を溶解することにより10mMの銅（II）/トリス（benzyltriazolylmethyl）アミン（TBTA）溶液を調製します。二つの溶液を混ぜます。室温でそれを維持し、光から保護します。 </li></ol></li><li>結合手順<ol><li> 80μlの修飾オリゴヌクレオチドの100ナノモル（ODN-1）を溶解新鮮な超純水。 2 M TEAA20μlのはpH = 7は、アスコルビン酸の新たに作られた溶液（水中5 mM）の80μlのを追加。 </li><li> DMSOの180μlのアジド修飾されたエタクリン酸の1.5マイクロモル（574.5μgの）を溶解し、溶液に追加します。ドガ60秒間アルゴンを使用し、迅速にCu（II）/ TBTA溶液（55％中の10mM（v / v）のDMSO /水）から40μlを添加するソリューション。 </li><li>近くにしっかりと、アルゴンで再びパージし、そして一晩攪拌します。 </li><li>反応の進行状況を監視し、RP-HPLC（移動相：A）によって結合体を精製し、5％アセトニトリル、5％TEAA、90％の超純水; B）65％アセトニトリル、5％TEAA、30％超純水）24 </li></ol></li></ol> 2. PDGFによってGST活性を制御します<ol><li>予備の準備<ol><li> 8mMの最終リン酸塩濃度および広告を達成するために、超純水16.1 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBSx1）33.9 mlと混合することによってアッセイ緩​​衝液を50mlの調製DのMgCl 2の23.8 mgを5mMの最終濃度を達成します。 </li><li> 50mMトリスpH7.5の、50mMのNaClを含む緩衝液中でタンパク質を溶解することによりGST M1-1のストック溶液を調製し、1mMジチオスレイトール（DTT）、30μMの最終濃度5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 -80℃で小分けし、ストアにこのソリューションを割ります。アッセイ緩​​衝液中で、セクション2.1.5.1によると、新鮮に希釈し、氷上に保ちます。 注：溶液を、約5時間、安定であるか、または酵素活性の減少があるまで。 </li><li>以下の手順に従って基板を準備します。 <ol><li> 100mMのストック溶液の最終濃度になるように超純水325μlの還元グルタチオン（GSH）10mgを溶解します。 2.1 mMのワーキング溶液の最終濃度のためにアッセイ緩​​衝液の979μlのこのストック溶液から21μLを希釈します。 </li><li> Eの492μlの2,4-ジニトロクロロベンゼン（CDNB）10mgを溶解させます100mMのストック溶液の最終濃度までthanol。 4.32 mMのワーキング溶液の最終濃度のためにアッセイ緩​​衝液の956.8μlの原液から43.2μLを希釈します。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートでは、別の行（12ウエル）の各基板を置きます。ソリューションの迅速かつ簡単に撤退を可能にするために、各ウェルに少なくとも60μLを挿入します。光保護のためにアルミシートでプレートをカバーしています。 </li><li>アッセイ緩​​衝液中で、次のストック溶液を準備します。 <ol><li>二量体の0.6μMの最終濃度に50によってGST M1-1を希釈します。 </li><li> 30μMの原液に「化学変換器 &#39;を希釈します。 </li><li> 40μMの最終濃度にPDGFを希釈します。 </li><li> 250μMの最終濃度にPDGFアプタマーを希釈します。 </li></ol></li></ol></li><li> 「化学変換器」とPDGFの存在下でのGST活性を測定します。 <ol><li>実験手順を設定する私動態測定のためにプレートリーダーをNです。 <ol><li> 「標準プロトコル」などの新しい実験を作成します。 </li><li> 「手順」を押して、手順の設定ウィンドウを開きます。 </li><li>ウィンドウの上側のポップアップリストでは、プレートのメーカーによると「384プレート」タイプを選択します。 </li><li>左側のメニューを押し「読みます」。 </li><li>検出方法については「吸光度」を選択します。 </li><li>読み取りタイプについて「エンドポイント」を選択します。 </li><li>波長ウィンドウ上に340nmを書きます。 </li><li>右上側の「フル板」底を押して、測定されるべき十分を選択します。 </li><li>押して「OK」「読む」ウィンドウを閉じます。 </li><li>選択し、左メニューの「運動を開始」。 </li><li>実行時間10分を行います。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>私は、「読む」の行をドラッグします反応速度測定Ntoを。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「プレイ」ボタンを押してください。ダイアログボックスが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li></ol></li><li>三連の実験を行うためには、4つのサンプルに「化学変換器」とGST M1-1の3.25μlの各含む3.25μLを準備します。それぞれ、各サンプル0、1.2、2.4、またはPDGFおよび123.5、122.3、121.1の4.9μlの、またはアッセイ緩​​衝液の118.6μlに加えます。 </li><li> 10分間室温で溶液をインキュベートします。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルにサンプルの40μlのを挿入します。基質添加のためのマルチピペットの使用を可能にするためにのみ、奇数ウェル中や、同じ行にあっても、ウェル内のサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルマルチピペッターを使用して、すぐにTのそれぞれから10μLを加えます96ウェルプレート（セクション2.1.4）に予め用意した彼の基板。泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜます。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 GST速度が非常に高速であるため、基質添加および反応速度測定の開始との間の時間を最小限に抑えるようにしてください。 </li></ol></li><li> 「化学変換器」によって媒介されるGST活性化/阻害サイクル。 <ol><li> 、三連の実験を行う5つのサンプルのアッセイ緩​​衝液84.5μlを、「化学変換器」の3.25マイクロリットル、およびGST M1-1の3.25μLを含むそれぞれを調製するために。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプル2-5にPDGFの1と3.65μLをサンプリングするアッセイ緩​​衝液の3.65μLを加えます。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプル3-5に、サンプル1-2とPDGFアプタマーの3.12μlにアッセイ緩​​衝液の3.12μLを加えます。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li>サンプルにアッセイ緩​​衝液の24.4μlを添加しますサンプル4-5のPDGFの1-3と24.4μlの。 3分間、室温でインキュベートします。 </li><li> 5分間、室温で5インキュベートをサンプリングするPDGFアプタマーのサンプル1-4と7.8μlにアッセイ緩​​衝液の7.8μlを添加します。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルにサンプルを40μlを挿入します。のみ奇数または、同じ行にあってもウェルににサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルマルチピペッターを使用して、すぐにそれぞれの基板からの10μLを加える（96ウェルプレート中に予め調製しました）。泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜます。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li> tにおいて340nmで測定したODを差し引くことにより、各条件でV 0 [MOD /分]を算出= ODから0.5分、Tで340 nmで測定し= 1.5分活性化/阻害リサイクル性を評価すること。25 </li></ol></li><li>環境の変化に「化学変換器」のリアルタイム応答を評価します。 <ol> &lt;LI&gt; PDGFの添加のリアルタイム効果<ol><li>反応速度測定用のプレートリーダーでの実験手順を設定します。 </li><li>繰り返しは2.2.1.1-2.2.1.10を繰り返します。 </li><li>実行時間を3.5分にします。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>運動の測定に「読む」の行をドラッグします。 </li><li>左側のメニュー/上にプレートアウトを選択します。 </li><li>オプション &#39;プレートアウト（ダイアログなし）」を選択します。 </li><li>左メニューの「遅延」オプションを選択し、30秒を入力します。 </li><li>左側のメニュー/上にプレートアウトを選択します。 </li><li>オプション &#39;（なしダイアログ）でプレート]を選択します。 </li><li> 2.2.1.14をしかし、セクション2.2.1.11で25分の代わりに10分であることが運動を設定する - 手順2.2.1.4を繰り返すことにより、第2の運動の測定を作成します。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「ナンプラーを押してくださいY &#39;ボタンをクリックします。ダイアログボックスが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li><li> GST M1-1の1μlのとアッセイ緩​​衝液の38μlの中で「化学変換器」の1μLを混合することにより、二つのサンプルを準備します。これらの2つのウェル間の空井戸を残し、384透明ウェルプレートの2ウェルにサンプルを挿入します。 </li><li>すぐに、各基板から10μLを追加穏やかに混合し、すばやく泡を避けるために、リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始し、12チャンネルのマルチピペッターを使用しました。 </li><li>プレートは、（3.5分後）まで開いたら、すぐに、ウェルの1にPDGFの1.125μlを添加穏やかに混合し、そしてプレートは、残りの反応速度測定のためにクローズアップすることができます。 </li></ol></li><li> PDGFアプタマーを追加のリアルタイム効果<ol><li>繰り返しは2.4.1.1-2.4.1.15を繰り返します。 </li><li> GST M1-1の1μlを、1μLを混合することにより、二つのサンプルを準備します」化学変換器」、およびアッセイ緩​​衝液の36.9μlの中のPDGFの1.125μlの。これらの2つのウェル間の空井戸を残し、384透明ウェルプレートの2ウェルにサンプルを挿入します。 </li><li> 12チャンネルのマルチピペッターを使用して、迅速に、各基板から10μlを添加する気泡を避けるために、静かにかつ迅速に混ぜて、リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li>プレートは、（1.5分後）まで開いたら、すぐに、ウェルの1にPDGFアプタマーの1.2μlを添加穏やかに混合し、プレートを残りの反応速度測定のためにクローズアップすることができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 「化学変換器」とPDGFの存在下でGSTによってJS-Kプロドラッグ活性化を測定します。 <ol><li>反応速度測定用のプレートリーダーでの実験手順を設定します。 <ol><li> 「標準プロトコル」などの新しい実験を作成します。 </li><li> 「手順」を押して、手順の設定ウィンドウを開きます。</li><li>ウィンドウの上側のポップアップリストでプレートメーカーによると「384プレート」タイプを選択します。 </li><li>左側のメニューを押し「読みます」。 </li><li>検出方法については「吸光度」を選択しました。 </li><li>読み取りタイプについて「エンドポイント」を選択します。 </li><li>波長窓に305 nmのを書きます。 </li><li>右上側の「フル板」ボタンを押して、測定されるべき十分を選択します。 </li><li>押して「OK」「読む」ウィンドウを閉じます。 </li><li>選択し、左メニューの「運動を開始」。 </li><li>実行時間10分を行います。 </li><li>最小間隔オプションを選択します。 </li><li>プレス運動ウインドウを閉じるには「OK」。 </li><li>運動の測定に「読む」の行をドラッグします。 </li><li> 「検証」ボタンを押して「OK」ボタンを押してください。 </li><li>実験を保存します。 </li><li> 「プレイ」ボタンを押してください。ダイアログBOXが表示されます - 測定を開始しなければならない場合にのみ、「OK」ボタンを押してください。 </li></ol></li><li> NO産生の測定のために亜硝酸/硝酸熱量測定キットを使用します。 96ウェルプレートでは、1行に私は3番目の行に2行目に試薬、およびグリースII試薬70μlのグリースの70μLをアッセイ緩​​衝液50μlを挿入します。 </li><li>三連の実験を行うためには、4つのサンプルに「化学変換器」のそれぞれを含む4.8μLを準備します。 1をサンプリングするために、アッセイ緩​​衝液の155.2μlを添加します。 2をサンプリングするために、GST-M1-1およびアッセイ緩​​衝液の152μlに3.2μlを添加します。 3をサンプリングするために、PDGFの9.6μlのとアッセイ緩​​衝液の145.6μlを添加します。そして、4をサンプリングするために、GST-M1-1の3.2μlを、PDGFの9.6μlを、およびアッセイ緩​​衝液の142.4μlを添加します。 </li><li> 10分間室温で溶液をインキュベートします。 </li><li> 384透明ウェルプレートで、各ウェルに50μlのサンプルを挿入します。のみ奇数またはだけででサンプルを挿入同じ行であってもウェルは、基質添加のためのマルチピペットの使用を可能にします。 </li><li>各ウェルにJS-Kの0.54μlの（DMSO中の5mM）を追加します。 </li><li>すぐに気泡を避けるために迅速に（96ウェルプレート中に予め調製した）を、穏やかに混合GSH溶液10μLを加えると、12チャンネルマルチピペッターを使用して。リーダーにプレートを挿入し、反応速度測定を開始します。 </li><li>すぐに運動測定後、12チャンネルのマルチピペッターを使用して、事前に用意した96ウェルプレートでアッセイバッファー行に各試料から50μLを取り、すぐにそれにグリースI試薬を50μl及び50μlのを追加グリースII試薬。 RTで10分間、光から保護しながらインキュベートし、550 nmの吸光度を測定します。 注意：アッセイ緩​​衝液および試薬のボリュームがキット」プロトコルに依存しています。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling—2000+and+Beyond.">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li><li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+therapy+of+cancer.">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li><li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+signal+transduction+therapy:+a+futuristic+approach+to+disease+treatment.">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li><li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer.">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li><li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules:+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One.">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li><li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Tango:+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners.">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li><li>Meyer, C., K&#246;hn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Molecular+T&#234;te-&#224;-T&#234;te+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein.">A Molecular T&#234;te-&#224;-T&#234;te Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li><li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction.">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li><li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+signaling+at+will:+chemically-inducible+dimerization+(CID)+techniques+resolve+problems+in+cell+biology.">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li><li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+over+protein-protein+interactions:+beyond+inhibitors.">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li><li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding.">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li><li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology.">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li><li>R&#246;glin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity.">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li><li>R&#246;glin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity.">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li><li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability.">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li><li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins.">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li><li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor.">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions.">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li><li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures.">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li><li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vall&#233;e-B&#233;lisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins.">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li><li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library.">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li><li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+recognition+by+bivalent,+'turn-on'+fluorescent+molecular+probes.">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li><li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors.">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li><li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers.">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li><li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors.">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li><li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding.">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We presented a method for designing and testing of a 'chemical transducer' that can induce artificial communication between two naturally unrelated proteins, GST and PDGF, without modifying the native proteins. The unnatural GST-PDGF communications could be detected in real time by using enzymatic assays that follow the changes in the activity of GST in the presence of the 'chemical transducer' and increasing the concentrations of PDGF. In addition to detecting the activation of GST by PDGF, these assays were used to fol...

シグナル伝達経路は、事実上すべての細胞プロセスにおいて重要な役割を果たし、細胞が急速に環境シグナルに応答することができます。1これらの経路は、多くの場合、細胞内酵素の活性化をもたらす細胞外受容体へのシグナル伝達分子の結合によってトリガされます。細胞内でこの信号の増幅及び伝播は酵素が可逆的に高い特異性で活性化されたタンパク質 - タンパク質相互作用のネットワークを形成するタンパク質のシグナル伝達機能によって媒介されます。これらのネットワークの調節不全は、しばしば癌の発生につながるので、薬は悪性のシグナル伝達経路を破壊するように設計されていることにより、2 &#39;癌のシグナル伝達療法」を確立する上で多くの関心が集まっています。我々は最近、不自然なシグナル伝達経路を生成する薬物の能力に依存している形質導入療法をシグナリングするための代替的なアプローチを提案しています。 <su特に、P&gt;図3は、我々は、シグナル伝達タンパク質の機能を模倣する合成薬剤を設計することによって、間接的に、細胞の機能を調節することが可能であると考えています。例えば、これらの人工的なネットワークは、プロドラッグを切断する酵素を活性化するタンパク質バイオマーカーを使用可能にすることができます。あるいは、これらのシグナル伝達タンパク質の模倣物は、治療効果が得られ、不自然な細胞シグナル伝達経路を活性化することができるかもしれません。 このアプローチの実現可能性を実証するために、我々は最近であるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を、活性化することによって抗癌プロドラッグの切断を誘発する血小板由来増殖因子（PDGF）を可能にする合成「化学変換器4 &#39; を作成しましたない、その天然の結合パートナー。この「トランスデューサー」の構造は、GSTのための二価阻害剤で修飾されている抗PDGFのDNAアプタマーで構成されています。したがって、この合成剤は、への結合部位を有する分子のファミリーに属し異なるタンパク質、二量体化の5-7のような化学誘導物質（のCID）8-10と、オリゴヌクレオチド合成分子複合体に基づいてタンパク質-結合剤のグループに。11月21日 そのようなシステムの設計の基礎となる一般的な原理は、本明細書に記載されており、合成及び従来の酵素アッセイを使用してこの「変換器」の機能を試験するための詳細なプロトコルが提供されます。この作業は、細胞内のタンパク質 - タンパク質の通信を仲介し、その結果として、人工的な細胞シグナル伝達経路を誘導するために使用することができるこのクラスの追加の「変換器」を、開発を促進することを意図しています。 図1は、不自然なタンパク質-タンパク質の通信を媒介することができる合成「化学変換器」の動作原理を説明しています。 protのための合成バインダーを統合し、この図では、「化学変換器」では、アインスIおよびII（バインダーIおよびII）は、その天然の結合相手ではないタンパク質の触媒活性Iを、トリガするタンパク質IIを可能にします。タンパク質IIの非存在下では、トランスデューサは、酵素（タンパク質I）の触媒部位に結合した （ 図1、状態II）の活性を阻害します。タンパク質IIに「トランスデューサ」の結合が、その結果の有効濃度をタンパク質I.向かってその親和性を低下させるバインダーIおよびIIタンパク質の表面（ 図1、状態III）の間の相互作用を促進します」溶液中の遊離」トランスデューサは、私は複雑で、タンパク質I（ 図1、状態IV）の再活性化にトランスデューサタンパク質の解離につながる、減少します。 （1）「トランスデューサー」はタンパク質標的のそれぞれについて具体的なバインダーを持っている必要があり、（2）相互作用betwe：まとめると、これらの手順は、効率的な「変換器」の設計の基礎となる3つの基本的な原則を強調表示しましたバインダーIIおよびタンパク質II専用私はタンパク質IIの表面と相互作用することができなければならないIおよびタンパク質I、および（3）バインダーバインダーとの間の相互作用よりも強いでなければなりません。この最後の原則は必ずしもバインダーは、単独で私はタンパク質IIに対して高い親和性と選択性を有することは必要ありません。その代わりに、それは、タンパク質の近傍に合成分子をもたらすことは、この分子とタンパク質表面との間の相互作用を促進する可能性があることを示した我々の最近の研究に基づいている。19,22,23 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> 図1：「化学トランスデューサは&#39;I（状態I）活性タンパク質に付加されている場合「化学変換器」の動作原理は 、それがバインダーIを介して、その活性部位に結合し、その活性（状態II）を阻害します。タンパク質II、但し、結合していない「化学Tの存在下でransducerは「バインダーI及びタンパク質IIの表面との間の相互作用を促進するバインダーIIを通じてタンパク質IIと相互作用します。この誘導された結合剤I-タンパク質IIの相互作用は、私は、複雑な「transducer&#39;タンパク質の解離につながるバインダーの有効濃度Iを、減少させ、タンパク質に私が再活性化（状態IV）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。</a>

<table><tbody><tr><td>1-chloro-2,4-dinitrobenzene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetnitrile</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate pentahydrate</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione-s-transferase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathione reduced</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>nitrate/nitrite colorimetric assay kit</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University</td><td></td><td>custom order</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Columns</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>2695 separation module</td><td></td></tr><tr><td>HPLC column</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 column (2.5 &amp;mu;M, 4.6 mm &amp;times; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC column</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 column (2.5&amp;nbsp;&amp;mu;M, 10 mm &amp;times; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

mimicking the function of signaling proteins: toward artificial signal transduction therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins that interact with each other and activate one other with high specificity. Synthetic agents that mimic the function of these proteins might therefore be used to generate unnatural signal transduction steps and consequently, alter the cell's function. We present guidelines for designing 'chemical transducers' that can induce artificial communication between native proteins. In addition, we present detailed protocols for synthesizing and testing a specific 'transducer', which can induce communication between two unrelated proteins: platelet-derived growth-factor (PDGF) and glutathione-S-transferase (GST). The way by which this unnatural PDGF-GST communication could be used to control the cleavage of an anticancer prodrug is also presented, indicating the potential for using such systems in 'artificial signal transduction therapy'. This work is intended to facilitate developing additional 'transducers' of this class, which may be used to mediate intracellular protein-protein communication and consequently, to induce artificial cell signaling pathways.

設計、合成、およびPDGFとGSTとの間に人工的な通信を誘導することができる「化学変換器」の作用の機構は、図2に示されている。「変換器」の構造は、PDGF DNAアプタマー及びビスエタクリンアミドを統合（BEA ）、これは既知のGST阻害剤（ 図2A）である。19これらのバインダーは、それぞれ、26 nmおよび144 nMでの解離定数（K dの?...

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Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

We present guidelines for developing synthetic 'chemical transducers' that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific 'transducer' that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug.

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.9K ビュー.  Weizmann Institute of Science. We present guidelines for developing synthetic 'chemical transducers' that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific 'transducer' that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug. 

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical challenges, it remains difficult to assess the activity of this signaling pathway and interpret it within a biological context. The existing literature on large tumor suppressor (LATS) relies on methods that are qualitative and cannot easily be scaled-up for screening. Recently, we have developed a bioluminescence-based biosensor to monitor the kinase activity of LATS-a core component of the Hippo kinase cascade. Here, we describe procedures for how this LATS biosensor (LATS-BS) can be used to characterize Hippo pathway regulators. First, we provide a detailed protocol for investigating the effect of an overexpressed protein candidate (e.g., VEGFR2) on LATS activity using the LATS-BS. Then, we show how the LATS-BS can be used for a small-scale kinase inhibitor screen. This protocol can feasibly be scaled-up to perform larger screens, which undoubtedly will identify novel regulators of the Hippo pathway.

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Here we present a luciferase-based biosensor to quantify the kinase activity of large tumor suppressor (LATS)-a central kinase in the Hippo signaling pathway. This biosensor has diverse applications in basic and translational research aimed at investigating Hippo pathway regulators in vitro and in vivo.

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

がん研究

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options. We seek to define how neural immune signaling modulates the susceptibility to migraine, modeled in vitro using spreading depression (SD), as a means to develop novel therapeutic targets for episodic and chronic migraine. SD is the likely cause of migraine aura and migraine pain. It is a paroxysmal loss of neuronal function triggered by initially increased neuronal activity, which slowly propagates within susceptible brain regions. Normal brain function is exquisitely sensitive to, and relies on, coincident low-level immune signaling. Thus, neural immune signaling likely affects electrical activity of SD, and therefore migraine. Pain perception studies of SD in whole animals are fraught with difficulties, but whole animals are well suited to examine systems biology aspects of migraine since SD activates trigeminal nociceptive pathways. However, whole animal studies alone cannot be used to decipher the cellular and neural circuit mechanisms of SD. Instead, in vitro preparations where environmental conditions can be controlled are necessary. Here, it is important to recognize limitations of acute slices and distinct advantages of hippocampal slice cultures. Acute brain slices cannot reveal subtle changes in immune signaling since preparing the slices alone triggers: pro-inflammatory changes that last days, epileptiform behavior due to high levels of oxygen tension needed to vitalize the slices, and irreversible cell injury at anoxic slice centers. 
In contrast, we examine immune signaling in mature hippocampal slice cultures since the cultures closely parallel their in vivo counterpart with mature trisynaptic function; show quiescent astrocytes, microglia, and cytokine levels; and SD is easily induced in an unanesthetized preparation. Furthermore, the slices are long-lived and SD can be induced on consecutive days without injury, making this preparation the sole means to-date capable of modeling the neuroimmune consequences of chronic SD, and thus perhaps chronic migraine. We use electrophysiological techniques and non-invasive imaging to measure neuronal cell and circuit functions coincident with SD. Neural immune gene expression variables are measured with qPCR screening, qPCR arrays, and, importantly, use of cDNA preamplification for detection of ultra-low level targets such as interferon-gamma using whole, regional, or specific cell enhanced (via laser dissection microscopy) sampling. Cytokine cascade signaling is further assessed with multiplexed phosphoprotein related targets with gene expression and phosphoprotein changes confirmed via cell-specific immunostaining. Pharmacological and siRNA strategies are used to mimic and modulate SD immune signaling.

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Migraine and its transformation to chronic migraine are immense healthcare burdens in need of improved treatment options. We seek to define how neural immune signaling modulates the susceptibility to migraine, modeled in vitro using spreading depression in hippocampal slice cultures, as a means to develop novel therapeutic targets.

拡散うつ病を使用してエピソードと慢性片頭痛の神経免疫シグナルのモデリングインビトロ</em

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

神経科学

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

発生生物学

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

遺伝学

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

生化学

ゼブラフィッシュにおける光遺伝学的シグナル操作による発生の検討

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュ胚におけるシグナル伝達の操作による細胞運命決定の解読 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Signal Transduction: Overview

Cells respond to many types of information, often through receptor proteins positioned on the membrane. They respond to chemical signals, such as hormones, neurotransmitters, and other signaling molecules, initiating a series of molecular reactions to produce an appropriate response. This is called signal transduction. Cells also coordinate different responses elicited by the same signaling molecule via mediators, allowing molecular cross-talk.
Typically, signal transduction involves three steps: (1) reception, (2) transduction, and (3)&#160; response. In most signal reception, a membrane-impermeable molecule, or ligand, causes a change in a membrane receptor; however, some signaling molecules, such as hormones, can cross the membrane to reach their internal receptors. The membrane receptor then sends this signal to other cellular molecules, typically intracellular messengers, which convert the message into a cellular response. Commonly known receptors on the cell surface or inside the cell include G protein&#8211;coupled receptors (GPCRs), ligand-gated ion channels, enzyme-linked receptors, and nuclear receptors. GPCRs are membrane-spanning proteins with an extracellular binding ligand binding site. Most drugs target GPCR and activate or block its activity. Once activated, these receptors couple with heterotrimeric G proteins and activate them. The activated heterotrimeric G proteins then move across the membrane to stimulate various downstream effectors to generate second messengers. The second messengers, such as cyclic AMP, carry the signal to target proteins and elicit a cellular response.
Another group of receptors, ligand-gated ion channels, are involved in fast synaptic neurotransmission by rapidly changing the ion flow across the cell. Various drugs bind at the ligand binding site, allosteric site, or channel pore to regulate the opening and closing of the ion channel. This leads to membrane potential changes affecting cellular processes such as neurotransmission, muscle contraction, and muscle relaxation.
On the other hand, the enzyme-linked receptors are unique transmembrane receptors that either have an intracellular enzymatic domain or are attached to an enzyme to start a phosphorylation cascade, phosphorylating downstream protein substrates and activating them.. These receptors are involved in cell proliferation, growth, differentiation, repair, and immune responses.
Lastly, various lipophilic ligands and drugs diffuse through the membrane to bind and activate nuclear receptors in the cytosol or directly bind to DNA inside the nucleus. They are ligand-activated transcription factors that regulate the transcription of genes involved in reproduction and metabolic pathways.
The intracellular response generated through these different types of receptors includes changes at both gene and protein levels. The receptors also bind to a variety of ligands, ranging from neurotransmitters, hormones, vitamins, lipids, or lipoproteins. Pharmaceutical companies exploit this to design drugs of different structural and chemical properties, targeting specific signaling pathways involved in a particular disease.

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

要約

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信号経路活性ルシフェラーゼベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオセンサーを用いたカバを監視

拡散うつ病を使用してエピソードと慢性片頭痛の神経免疫シグナルのモデリングインビトロ

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

シグナル伝達:概要

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

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