私たちは、動物実験でのサポートのためにオーストラリアのバイオ資源（ガーヴァン研究所、オーストラリア）、生物資源センター（UNSWオーストラリア）とアニマルケア＆倫理委員会に感謝します。この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（プロジェクト無償APP1062720）によってサポートされていました。博士セザールP.カナレスはCONICYT-Becasチリの奨学金（＃72101076）の受取人です。氏Bassem AkladiosはUNSWオーストラリアによって大学国際大学院賞を受賞です。

倫理文：動物を対象とするすべての手順は、承認されたACECプロト​​コル13 / 64Bの下UNSWオーストラリアでの動物管理倫理委員会（ACEC）のガイドラインに従ってください。 透明なマウスの皮膚組織の作製注：この研究で使用した全てのマウスは、C57BL / 6遺伝的背景にありました<ol><li>マウスの皮膚組織のコレクション。 <ol><li>人道的に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 </li><li>慎重に肌を巻かないように注意しながらトリマーに関連する皮膚領域から毛を取り除きます。 </li><li>洗浄皮膚は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の70％エタノールで除染します。 </li><li>鉗子で背首の皮膚を持ち上げ、ハサミで切開を行います。 </li><li>背側マウスの皮膚（約1.5×4センチ）の大面積を解剖。 </li><li>ろ紙上の皮膚真皮側を下に平らにし、サンプルの前後の向きをメモします。 </li><li>トライPBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で満たされた15mlチューブ内のM個のフィルタ切開皮膚の周りに紙、および場所。 </li><li> 4℃で冷蔵庫で一晩、室温で1時間、修正、または。 </li><li> 15ミリリットルチューブ内のPBSで洗浄皮膚2×5分。 注：以下の（1.1.10 - 1.1.12）は、組織の長期保存のためのオプションのステップです。 </li><li>室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール（25％、50％、70％）の濃度の増加に伴って、PBS中の切開皮膚を脱水。 </li><li>さらに使用するまで4℃で15 mlのチューブで、PBS中の70％エタノール中で脱水肌を保管してください。 </li><li> 4時間クリアする前に、室温で1時間の洗浄工程の間に15mlチューブ中のエタノール濃度（70％、50％、25％、0％）に減少してPBSで皮膚組織を再水和します。 </li></ol></li><li>マウスの皮膚生検をクリア<ol><li> 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N &#39;、N&#39;を溶解させることによってCUBIC1クリア溶液を調製70°C - 60に設定されたヒータに蒸留水を5.38ミリリットル中-tetrakis（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン。ホットスターラーを使用してください。 </li><li>それがクリアされ、室温まで冷却した後、溶液にポリエチレングリコールモノPイソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100 2.31グラム加えます。 </li><li>概略寸法0.2×0.5センチ生検に鋭利なカミソリの刃を持つマウスの皮膚をカットし、15mlチューブ内CUBIC1クリア溶液5mlに水没。毛包の可視化を最適化するために、生検の長辺は、サンプルの前後方向に沿って切断されていることを確認してください。 </li><li> 37℃でのハイブリダイゼーションオーブンで回転台に置きます。 </li><li> 7日後に決済ソリューションを変更します。使用前に、新鮮なCUBIC1溶液を調製します。 </li><li> 7日後の組織の透明性を確認してください。必要に応じて組織が完全に透明になるまで、CUBIC1クリア溶液中で生検を残します。 </li><li>皮膚生検が透明になったら、CUBIC1溶液を除去し、37℃で6時間、組織を4回洗浄するために1×PBSの4ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃で4時間、15ミリリットルチューブにPBS中/ vスクロースワット20％に皮膚組織を洗浄します。 </li><li> -80℃の冷凍庫で一晩15mlチューブに培地最適な切削温度（OCT）化合物を取り付ける際に組織を凍結します。 注：この手順は以降の抗体の浸透のための生検の透過性を増加します。 </li></ol></li></ol> 2.免疫蛍光染色<ol><li> 3時間 - 2室温まで）1.2.9から組織を解凍します。 </li><li> 10月の化合物を除去するため、室温で8時間、5mlのPBSで15ミリリットルチューブ内を洗浄する組織。 </li><li> 37でシェーカー上で3日間PBST（PBS + 0.1％トリトンX100）で100：2 mlチューブに移し生検、および両方が1に希釈し、1ミリリットルのウサギ抗Keratin14またはウサギ抗Ki67抗体で組織をインキュベートCオーブンを°。 </li><li> 15mlチューブに移し生検、AND 37℃のオーブン中でシェーカー上PBST 5ml中に6時間、組織を4回洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルチューブに移し生検は、1希釈した二次抗体をAlexa594抗ウサギ1ミリリットルを追加します。PBSTで100を、37℃のオーブンでシェーカー上で3日間インキュベートします。 </li><li> 15mlチューブに移し生検、および、37℃のオーブンでシェーカー上PBSTの5ミリリットルで6時間、組織4回洗浄します。 </li><li> PBST中で、37℃のオーブン中でシェーカー上で一晩インキュベート。2 mlチューブに移し生検を1mlの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、核対比染色溶液（千1）を加えます。 </li><li> DAPIの対比溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上で6時間、組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。 注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。 </li></ol> 3.ナイルレッド染色<ol><li> 1M最終濃度にジメチルスルホキシド（DMSO）中のナイルレッド粉末を溶解しますグラム/ミリリットル</li><li> 1μg/ mlの最終濃度に1mlのPBSに1μlのナイルレッド溶液を加えます。 </li><li> 2室温まで）1.2.9から組織を解凍 - 3時間、室温で8時間、5ミリリットルのPBSで洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルチューブに生検を移し、室温で2.5時間、1ミリリットルナイルレッド染色液に組織を浸します。 </li><li>室温で30分間、1ミリリットルPBSTで4回を2ミリリットルチューブ内の皮膚生検を洗ってください。 </li><li> 2ミリリットルチューブからPBST溶液を除去し、DAPI核対比染色溶液（1：1,000）の1ミリリットルを追加PBST中、室温で一晩インキュベートします。 </li><li> DAPIの対比溶液を除去し、室温で6時間、皮膚組織を4回洗浄するために2ミリリットルチューブにPBSTの1ミリリットルを追加します。 注：オプションのステップ：生検は、少なくとも3週間、0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS中で暗所に保存することができます。 </li></ol> 4.イメージング<ol><li> 50が含まれているCUBIC2決済ソリューションを、準備％スクロース、25％（w / v）の尿素、10％（w / v）の（w / v）の2,2 &#39;、2&#39; &#39; - nitrilotriethanol、および0.1％（v / v）のトリトンX-100。 </li><li> 37℃のオーブンで24時間シェーカーで2ミリリットルチューブで1ミリリットルCUBIC2溶液中の皮膚組織をインキュベートします。このステップでは、組織の屈折率を均等になります。 </li><li>組織の透明性を確認してください。それが明確になったら、カバーガラス上にその長辺全体の皮膚生検（0.2×0.5センチ）の位置、毛包の長さ方向がカバーガラス面に平行なものであること（＃1 24×60 mm）の 注：オプションのステップ：抗体染色された生検材料は、約7日間CUBIC2溶液中で保存することができます。ナイルレッド染色生検は最大1日のCUBIC2溶液中に保存することができ、できるだけ早く画像化されるべきです。 </li><li>イメージング室を準備し（ 図1） F（ブルータック、生地を再生したり、類似の、および2カバースリップ（24×50 mm）の：イメージングチャンバーの製造のために必要な消耗品は次のとおりです。注意してくださいigureの1A）。 <ol><li>ブルータックの2つの薄いストリップ（直径約1ミリメートル×2センチ）、および2つのカバースリップ（ 図1B）を準備します。 </li><li>皮膚生検（ 図1C）のための十分なスペースを可能にする、1つのカバースリップ上にブルータックストリップを配置します。 4.4.3） </li><li> CUBIC2溶液の液滴（ 図1C）でカバースリップ上のストリップ間に皮膚生検を置きます。 </li><li>第二のカバーガラス（ 図1D）との皮膚生検をカバーしています。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡のステージ上に取り付けられた皮膚生検とイメージング室を配置し、光経路に組織を動かします。 </li><li>関心の蛍光染色された領域を同定するために、水銀やハロゲン光源と、標準的な落射蛍光フィルターを用いて、試料（ 例えば、DAPI / GFP / CY3 / CY5）をスキャンします。 </li><li> 10X及び20X対物レンズを使用して目的の画像領域（NA 0.75）および標準共焦点蛍光イメージング技術（ 例えば 、DAと）620 nmの - PI染色したサンプルを、405nmレーザーを照射し、425の間の蛍光シグナルを収集 - 475 nmのを、およびAlexaフルーア594またはナイルレッド染色したサンプルを用いて561 nmのレーザーを照射し、570との間に蛍光信号を収集します。 </li><li>顕微鏡Zスタック画像収集ソフトウェアを使用して関心のある各領域の画像のZスタックを生成する（ 例えば 、下記のようにソフトウェア4.13を撮像NIS要素を使用して）。 <ol><li>最適なレーザーパワーとPMT HVを確認/オフセット設定は、サンプルの蛍光を収集するために選択されています。 </li><li> 「取得コントロール」から「ND取得」ツールバーを開きます。 </li><li> （他のすべてのタブが選択されていないであることを確認） &quot;Zシリーズの設定」タブを選択します。 </li><li>ライブスキャン中、サンプルの上部に焦点を当て、「トップ」ボタンを押してください。 </li><li>サンプルの底に焦点を当て、「下」ボタンを押してください。 </li><li>入力に必要なステップサイズ（またはプレスに最適化ステップサイズボタン）。 </li><li>プレssの「今すぐ実行」ボタンを押します。 </li><li>個々のTIFF画像スタック（画像Z-スタックあたり1蛍光色素）として得られたZ-スタックを保存します。 </li></ol></li><li> 3D解析ソフトウェアを使用して、目的の3Dボリュームの領域を再構成する画像のZスタックを使用する（ 例えば 、下記のようにIMARIS x64の7.2.3を使用して）。 <ol><li>解析ソフトウェアを起動します。 </li><li> 3Dボリューム生成のためのツールバーのボタンを「サーパス」を選択します。 </li><li>最初の色画像Zスタックを開きます（ 例えば 、DAPI）。 </li><li>追加のカラーチャンネル、蛍光色素ごとに一つのチャネルを追加するには、「チャンネルを追加」ツールを使用します。したがって、DAPIおよびアレクサフルオロ594蛍光色素の両方を含む試料は、2つのチャネルを必要とします。 </li><li>上記4.7で決定されるように、正しいピクセル（ボクセル）の寸法（XYZ）を設定するには、「画像のプロパティ」ツールを使用してください。 </li><li> （ 例えば、赤、青、アレクサフルオロ594チャンネルにDAPIチャネルを設定する）必要に応じて、チャネルの色を変更するには、「表示調整」ツールを使用してください。 </li><li> POへ画像ウィンドウ内の3Dボリュームをジション、必要に応じてクリックしてドラッグボリュームするコンピュータのマウスを使用します。 </li><li> 3D画像のスクリーンショットを生成するために、ツールバーの「スナップショット」ツールを使用してください。 </li><li> 3Dの試料回転の映画を生成するために、ツールバーの「アニメーション」ツールを使用してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li><li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li><li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secret+life+of+the+hair+follicle.">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li><li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+skin+development,+homeostasis,+and+disease.">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li><li>Susaki, E. 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F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+controls+stem/progenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis.">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment:+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis.">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li><li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer.">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li><li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen.">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li><li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis.">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749 (2014).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

皮膚の発達および恒常性を制御する調節機構は、最も一般的には、皮膚の形態、細胞集団またはタンパク質発現の唯一の制限認識を可能にする、抗体を用いて組織切片、組織学的染色又はラベリングを用いて2次元で研究されています。多くの方法は、表皮全体マウント10-13で3次元的に単細胞解像度における細胞およびタンパク質の空間的組織の視覚化を改善するために開発されてき?...

皮膚は私たちの生存に必須です。それは3つの主要な層の外側表皮、真皮および皮下組織で構成されています。表皮は非常に再生組織です。それは主にケラチノサイトからなる扁平重層上皮です。ケラチノサイトは基底層で生まれ、差別化しながら、基底上層を通って上方に移動し、最終的に彼らは彼らの出生後約一ヶ月外側角質層に流されているされています。表皮は、毛包や皮脂腺などの付属の数を開発しています。毛包はまた、人生1を通して循環方式で再生します。表皮の再生能力は、毛包間表皮と毛包2の基底層に位置している幹細胞および前駆細胞の存在によって有効になっています。 多くのシグナル伝達経路は、表皮の開発と再生に関与しています。これらのいくつかは、内に発生しますこのようなヘッジホッグ経路などの表皮のみ、。他のシグナル伝達事象は、真皮と表皮3との間で行われます。例えば、真皮からのWntシグナルは、毛包の発達のために重要であると考えられ、それらは毛包バルジ幹/前駆細胞の増殖および毛包の成長4を活性化する成長期の開始時に真皮乳頭によって分泌されます。より良い彼らは、皮膚癌などの再生皮膚病に撹乱することができる方法を理解するために、表皮の開発と再生を制御する細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。 この記事では、Cのリアを説明し、Uは、 私はカクテルやC omputational分析全体の皮膚の準備をマウントし、共焦点顕微鏡により単一細胞の解像度で3次元でのタンパク質発現パターンを可視化明確にする（CUBIC）プロトコル5-7を maging Bの雨をnobstructed。キュービック法は、皮膚を浸漬することを含みます2アミノアルコールベースの​​化学カクテルで組織。これらのソリューションは、単一細胞の解像度で免疫検出を可能にする、透明およびタンパク質が無傷組織を残して、皮膚試料の屈折率を調整します。 このCUBICプロトコルを使用して、毛包間表皮および毛包における基礎および増殖性ケラチノサイト集団は完全な抗Keratin14を使用して、野生型マウスの厚さの皮膚生検（K14）および抗Ki67の抗体で画像化しました。野生型皮膚生検における皮脂腺も、ナイルレッド染色を用いて可視化しました。最後に、野生型および過形成YAP2-5SA-ΔCの皮膚生検における基底ケラチノサイト集団が8を比較しました。 このCUBICプロトコルは、単一細胞の解像度で全層皮膚生検におけるタンパク質発現の視覚的評価を可能にし、遺伝的に改変されたの皮膚における表皮解剖学と形態学的欠陥を理解する重要なツールですマウスは、表皮の発達と再生の基礎となる細胞および分子機構を調査します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">P6418</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethanol 96% (undenaturated)</td>
			<td style="width:195px;">Chem-supply</td>
			<td style="width:229px;">UN1170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nile Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">821940</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">648462</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">S0389</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td style="width:195px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:229px;">4583</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Keratin14 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Covance</td>
			<td style="width:229px;">PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">anti-Ki67 antibody&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Abcam</td>
			<td style="width:229px;">ab16667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:423px;">Donkey anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:229px;">A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Urea</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">66612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol</td>
			<td style="width:195px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:229px;">137002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:423px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments Inc</td>
			<td style="width:229px;">Nikon A1 - Confocal Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">cruZer6 Face Trimmer</td>
			<td style="width:195px;">Braun</td>
			<td style="width:229px;">Braun cruZer6 Face</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:229px;">438456</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations

皮膚は私たちの生存に必須です。外側の表皮層は、毛包と汗腺のように私たちの体、および表皮付属のほとんどをカバーする重層扁平上皮である毛包間表皮、から構成されています。表皮は、生涯を通じておよび傷害に応答して再生を受けます。これは、しっかりと、表皮内および表皮と真皮の間の積極的な複数の調節機構によって調節されているK14発現基底表皮幹細胞/前駆細胞集団で有効になっています。この記事では、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、K14のタンパク質発現パターンを可視化するための簡単​​な方法を説明し、Ki67には増殖細胞を標識し、ナイルレッドは、3Dでの単一細胞の解像度で皮脂細胞、およびDAPI核の標識標識。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価と定量化を可能にします。 CUBICプロトコルは番目です単一細胞の解像度で全層皮膚生検における分子と細胞の相互作用を調査する日付に利用可能な電子最良の方法。

大人の野生型マウスの全層背部皮膚生検を基底ケラチノサイトマーカーKeratin14（K14）に結合する抗体で染色し、明らかにした、そして核はDAPI染色溶液（ 図2およびムービー1）で対比染色しました。 DAPI陽性の核は、サンプル（ 図2A、C）を通して見えた、とK14染色は、毛包間表皮の1セル厚の基底層に独占的に見えた、と皮脂腺（黒ア...

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.4K ビュー.  University of New South Wales Australia. このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。 

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...