Name: measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay
Uploaded: 2016-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

鳥のコンポーネントを持つすべてのライブ再集合体ウイルスは、バイオセーフティーレベル2（BSL2）を使用して処理しなければならない米国農務省（USDA）と制度バイオセーフティ委員会によって使用が承認実験室での実践を-enhanced。 試薬および出発材料の作製注：すべての試薬 ​​の供給源を得るために、 材料表を参照してください。 <ol><li>フェチュインでコーティングされたプレート<ol><li>脱イオンH 2 Oで90 mlので10ml 10×コーティング緩衝液を混合することにより、コーティング緩衝液を調製</li><li> -20℃で500μlのアリコートで1×コーティングバッファーとストア内の25ミリグラム/ mlのフェチュインのストック溶液を準備します。 </li><li>すぐに原液を1×コーティングバッファーを1,000倍希釈してプレートをコーティングする前に、フェチュインの作業溶液（25μg/ ml）を準備します。 </li><li>アルへフェチュインのワーキング溶液100μlを分配するためにマルチチャンネルピペットを使用して、高タンパク質結合能を有する96ウェルプレートのLウェル。 </li><li>その後、10のグループにプレートをスタックし、ホイルでラッププレートシーラーで各プレートをカバーしています。 </li><li>アッセイを行う前に、少なくとも18時間、冷蔵庫（2〜8℃）でプレートを置きます。 注意：プレートを、事前にコーティングされ、最大2ヶ月間2-8℃で塗布液を記憶することができます。 </li></ol></li><li>希釈剤<ol><li>ウイルスサンプルの希釈（2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、pH6.5の、20mMのCaCl 2を、1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.5％のTween 20）を、94.2 mlと混合するために希釈剤を調製するために1X MES、2ミリリットルのCaCl 2（10 mg / mlで）3.3 mlの30％BSAおよび0.5 mlのツイーン20でpH 6.5。 </li><li> 2ミリリットルのCaCl 2（10mg / ml）で94.7ミリリットルの1x MES、pHが6.5を混ぜ、PNA-HRPO（MES、20mMのCaCl 2を、1％BSAを用いてpH 6.5）のための希釈剤を準備し、3.3ミリリットルの30％BSAに。 </li></ol></li><li>ノイラミニダーゼ（NA） 注：H6Nxウイルスreass公開された方法5,10以下ortants（これらはH6サブタイプのHAと関心のNAを持っている）、生成されます。彼らは、社内で使用できない場合、協力者から不活性化された再集合体ウイルスのバイアルを要求します。不活化ウイルスを使用する場合、調製物は、不活性化処理はNA活性に有意な影響を及ぼさなかったことを実証を通じてELLAでの使用に適していることを確認します。 <ol><li> -80℃できちんとした尿膜液0.5mlのアリコートを発育鶏卵で培養H6Nxウイルスのストックを11と格納します。 </li><li>各アッセイのために、ウイルスの新しいアリコートを使用してください。アリコートを凍結し、解凍しないでください。 </li></ol></li><li>血清サンプルおよびコントロール<ol><li> 45-60分間56℃の水浴中で、全ての血清（試験サンプル例えば 、前およびワクチン接種後の血清、並びに対照、 例えば 、既知のNI力価を有するサンプル）を熱不活性化します。前または熱処理後の-20〜-70℃で血清を保管してください。 SAMP場合レは、サンプルを繰り返し凍結及び解凍されないように、凍結前に、いくつかのアリコートを行い、繰り返し試験します。 </li><li> （&gt; 5ミリリットル）低力価および高力価と相互に少なくとも一つを識別するために、合理的な量で利用可能なヒト血清中のNI力価を測定するために、ELLAを使用してください。店舗≤-20°Cとして100μlのアリコートを、同じサンプルは、アッセイ性能を追跡するために多くのアッセイにおける対照として使用することができるようになっています。 </li></ol></li><li>ピーナッツ凝集素（PNA） - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO） <ol><li> PNA-HRPO希釈液（MES、 塩化カルシウムでpH 6.5および1％BSA）を準備します。 </li><li>希釈液1mlにPNA-HRPO 1mgを溶解させることによって、PNA-HRPO原液を準備します。 -20℃で20から200μlのアリコートを保管してください。 </li><li>新しいPNA-HRPOロットを使用する前に、テスト1：500、1：750、1：1000〜1：ポジティブコントロール（ウイルスのみ）で、最大ODをもたらす量と背景を識別するために、この試薬の2000希釈液（ウイルス）トンノー帽子は&lt;正の信号の10％です。 <ol><li> 2.1節で説明したように四重のウイルス希釈液を作ります。 </li><li> 2.2節で説明したように、フェチュインでコーティングされたプレートに希釈液を移し、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li> 16-18時間後、プレートを洗浄し、1追加：プレートの行を複製するPNA-HRPOの2,000希釈液（100μl/ウェル）：500、1：750、1：1000〜1。 </li><li> 2.3.9へのステップ2.3.4で説明したようにアッセイを完了します。 </li><li> &gt; 10倍のバックグラウンドである最大信号が得られた希釈を選択するために、データを確認します。 </li></ol></li><li>使用直前に、1.5.3で同定されたPNA-HRPOの最適希釈を準備します。 </li></ol></li><li>洗浄緩衝液（0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の0.05％ツイーン20（PBS-T））を大量に調製します。室温で保管してください。 </li><li>ペルオキシダーゼ基質（o-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD））を準備します。注：このような3,3のような代替ペルオキシダーゼ基質」、5,5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）を使用することができます<ol><li>アッセイの日に100ミリリットルのdH 2 Oに1カプセルを溶解させることにより、リン酸-クエン酸緩衝液を準備します。 </li><li>使用直前にリン酸 - クエン酸緩衝液20mlに1 OPD錠（10 mg）を溶解させます。 </li></ol></li><li>停止液（1 NH 2 SO 4）を準備：SO 4 973ミリリットルのdH 2 Oに27.2ミリリットルの株式98％のH 2を追加します。混合し、次いで、室温で保管してください。 </li></ol> ELLAで使用するためのNAの量の2決意<ol><li> 96ウェルプレートにウイルス希釈液を調製<ol><li>列希釈プレートの1-11に120μlのサンプル希釈剤（セクション1.2）を分注します。 </li><li>カラム1に、追加の96μlのサンプル希釈剤を追加します。 </li><li>解凍した後、これがウイルスの1:10希釈を与える列1のウェルを複製するために24μLを追加する前に、ウイルスのバイアルをボルテックス。 </li><li>転送することにより、検体希釈液中のウイルスの連続2倍希釈液を作ります各希釈のためのクリーンなピペットチップを使用して、次の1つのウェルから120μlを。 </li></ol></li><li>フェチュインでコーティングされたプレートへのウイルスの希釈を転送<ol><li> PBS-T（1.6節）で、フェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上に各プレートをブロット。 </li><li>フェチュインでコーティングされたプレートの11列1に各ウェルに検体希釈液（セクション1.2.1）の50μLを加えます。 </li><li> （これらのウェルは、陰性対照である）カラム12にサンプル希釈液の100μlのを追加します。 </li><li>転送列フェチュインでコーティングされたプレートの対応するウェルに希釈プレートの1月11日から希釈したウイルス50μlの。 </li><li>プレートシーラーでプレートをカバーし、その後、37℃の加湿インキュベーターに入れてください。 </li><li>残りのステップは、（16-18時間後）を行うことする時間をメモします。 </li></ol></li><li> NAの決意を完了<ol><li>インキュベーション（16〜18時間）完了すると、転送ベンチにプレートとプレートシーラーを削除します。 </li><li> PBS-T（1.7節）でプレートを6回洗浄した後、全ての液体がウェルから除去されていることを確認するために反転させ、吸収紙タオル上でバッチリ。 </li><li>すべてのウェルに（1.5.3で決定希釈で）100μl/ウェルPNA-HRPO溶液を添加し、室温で2時間静置します。 </li><li>インキュベーションが終了している15分未満前にセクション1.7で説明したように、OPD溶液を調製。 </li><li> PNA-HRPOを除去し、各ウェルにOPD基質100μlを添加する前に乾燥しみするために、テストプレートを3回洗浄します。 </li><li>室温で正確に10分間プレートをインキュベートします。 </li><li> 1N硫酸100μl/ウェルを加えて反応を停止します。 </li><li> 0.1秒間490nmでの光学密度（OD）を測定するために、プレートリーダーを使用してください。 </li><li>保存して、すべてのデータファイルをエクスポートします。 </li></ol></li><li>血清学のために使用されるウイルスの希釈を選択<ol><li> ODの490nmのをプロットしたグラフを描きます</sUB&gt;各ウイルス希釈液での値。 、（これは通常、滴定曲線の先頭でプラトーに対応した信号である）、最小信号（バックグラウンドコントロールを提供するプレートのカラム12にはウイルスが含まれていない井戸）最大信号を識別するために滴定曲線を点検入力希釈（曲線すなわち、線形領域）に比例したODをもたらすウイルスの希釈。 </li><li>最大信号の約90％を与え、直線範囲内にあるウイルスの希釈を選択します。選択された希釈でのODはバックグラウンドシグナルよりも少なくとも10倍大きいことを確認してください。この特定のウイルスストックを採用し、すべてのアッセイのために選択されたウイルス希釈液を使用してください。 注：別の方法として、ウイルスのNA活性を測定し、ELLAに〜15-20μUNA活動/ミリリットルを使用しています。 </li></ol></li></ol> 3.酵素結合レクチンアッセイ注： 図2笙希釈およびアッセイプレートのセットアップをWS。 <ol><li>サンプル希釈液を作ります<ol><li>氷の上で熱不活性化サンプルを置きます。 注：8の血清を各プレートに希釈することができます。 </li><li>プレート全体の1：10から始まる希釈液を使用して設定するために、列3-11内のすべてのウェルに120μlのサンプル希釈剤を追加します。 </li><li>コラム2に、検体希釈液の216μlの各サンプルの24μlを添加します。 3回上下にピペッティングすることで十分でサンプルを混合した後、次の列に120μLを移します。 </li><li>ピペットチップを変更した後、上下にピペッティングによりウェルの内容物を混合した後、次の列に120μLを移します。 </li><li>サンプルまでの手順を繰り返し3.1.4カラム11に転送されており、残りの120μlを破棄します。 </li></ol></li><li>フェチュインでコーティングされたプレートにサンプルおよびウイルスを追加<ol><li>ウイルス、渦のバイアルを解凍し、ステップ2で選択された希釈率で希釈剤（セクション1.2）でウイルスを懸濁します。4.2。各アッセイプレートのためのウイルスの少なくとも5ミリリットルを準備します。プレートを洗浄し、血清サンプルをプレートに添加されるまで、氷上で希釈したウイルスを保管してください。 </li><li> （一般的にプレート当たり4血清を適用）アッセイのために必要とされ、フェチュインでコーティングされたプレートの数を決定します。 PBS-Tでフェチュインでコーティングされたプレートを3回洗浄した後、各プレートを反転し、余分な洗浄バッファーを除去するために、吸水性ペーパータオルの上にブロット。 </li><li>列2-11の重複ウェルに希釈プレートから各血清対照または試料希釈液50μlを転送するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。 </li><li>陰性対照（カラム12）を除く全てのウェルに希釈したウイルスの50μLを加えます。 </li><li>カラム1のウェルに検体希釈液の50μlのを追加し、カラム12にサンプル希釈液の100μlを添加します。 </li><li>プレートシーラーでウェルを覆い、その後静かにプレートの側面をタップするか、10秒間中程度の速度でプレートシェーカー上に置くことによって混合します。 </li><li> humidifにプレートを置き16-18時間、37℃でIEDインキュベーター。 </li></ol></li><li> PNA-HRPOを追加し、2.3節で説明したようにアッセイを完了</li></ol> 4.データ解析<ol><li>アッセイ結果の妥当性を判断<ol><li>バックグラウンド値（ウイルスなし）は、ポジティブコントロール（ウイルスおよび血清なし）の10％未満であることを確認します。 </li><li>同じ条件を用いて、異なるアッセイにおける対照血清ランの力価は中央値力価の2倍以内であることを確認します。 </li><li>対照ウェルのOD測定値は（≤20％異なる）一貫性があり、重複したサンプルウェルのOD測定値は（≤10％異なる）一致していることを確認します。 </li><li>無効な結果の根本原因を特定し、4.1.1、4.1.2または4.1.3に記載されている基準は、満たされていない場合、アッセイを繰り返します。トラブルシューティングをしようとすると、表1に示す要因を考慮してください。 </li></ol></li><li> 50％エンドポイント力価を割り当て<ol><li>各アッセイプレート、suコマンドのためのすべての測定値から平均バックグラウンド（ウェルに添加していない抗原）btract。 </li><li>式を用いて、各血清希釈におけるパーセント阻害を計算する：100×（OD ウイルスのみ制御 - OD テストサンプル ）/ OD ウイルスのみを制御 。 </li><li>最大信号の少なくとも50％の阻害をもたらした最高希釈を識別します。 </li><li> 50％終点力価として、この希釈の逆数を報告します。 注意：50％の阻害が任意の希釈で達成されなかった場合は、力価は、最初にテストした希釈よりも小さい例えば 、&lt;10 1:10最初にテストした希釈があります。 </li></ol></li><li> 50％阻害濃度を計算する（IC 50） <ol><li>次のようにIC 50力価を決定するために、4パラメータロジスティック回帰を使用してください：すべての測定値から平均バックグラウンドを減算した後、回帰分析を行うプログラムに結果を転送します。 </li><li>最大設定で、非線形回帰を使用してくださいウイルスのみの対照と最小値は、正確に50％阻害に対応する希釈を決定するために、ゼロに設定。 </li><li> IC 50力価として、この希釈の逆数を報告します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflicts of interest.

酵素結合レクチンアッセイは、血清中のNI抗体価を測定するための実用的な方法です。 ELLAは、1990年にによってLambre ら 、説明したが、標準的な血清学的ア ​​ッセイとして承認されるには、臨床サンプル12-16のNIの抗体価を測定するためのアッセイを実施する多数の研究室で、より最近てきました。いくつかの変形を測定するNI力価に大きな影響を与えることなく、プロトコルのステップにすることができます。例えば、PBSを希釈剤として使用することができるいくつかのNAサブタイプが有意に酵素活性が低下しているように、しかし、意思決定が行われる前に、推奨される緩衝液（MES、pHは6.5）、PBS中のウイルス滴定曲線を比較することは非常に有用ですpH値&gt; 7.0。最適なpHが使用されていない場合は、ウイルスの最大シグナルは、アッセイにおける抗原の過剰量（ すなわち 、ウイルス）を用い、その結果、低減され得ます。これらの条件下で、アッセイは減少感度を有していてもよいです。 いくつかのノー未処理の血清をELLAで試験した場合のn-特異的阻害が観察されます。これは、熱不安定性β阻害剤の存在を示す、熱処理（56℃、45分間）により除去されます。インフルエンザHAの他の非特異的阻害剤（α及びγクラス）は、特にH3N2ウイルスの血球凝集および感染に関連して、記載されています。 H3N2ウイルスは、NAの供給源として使用される場合、実際に、非特異的阻害はまたELLAで観察されます。この阻害は、シアリダーゼ9少量の血清試料を処理することにより除去されます。 他の血清学的アッセイのためのように、陰性および陽性対照は、アッセイ性能を評価するための手段を提供するために、各アッセイに含まれるべきです。アッセイは、許容基準を満たしていない場合には、理由が特定されるべきである。 表1は、問題のトラブルシューティングに対処することができるアッセイにおける潜在的な手順のリストを提供します。 ELLAプロトコルプロブこのレポートでIDEDは、NAのソースとして、トリウイルスからのHA発信が含まれている再集合体ウイルスを使用しています。これは、許可証は、低病原性鳥ウイルスで動作するために必要とされるため、アッセイを行うには限界を提示します。 H6Nx再集合体ウイルスは、それらが不活性化された後、実験室間で共有することができます。したがって、再集合体ウイルスを生成する実験室の不活性化が完了したことを実証した後、アッセイは、コラボレーションを介して行うことができ、製剤は、そのNA活性を保持しています。 H6Nx再集合体ウイルスを使用する制約は、NAの非感染源を使用することによって克服することができます。他の人がウイルス様粒子（VLP）15を使用しているが、例えば、いくつかの研究室では、精製された組換えNA 17を使用しています。しかし、組換えNAもVLPはどちらも容易に入手可能であり、したがって、我々は、抗原的に不整合鳥HAでインフルエンザウイルスを継続して使用します。 伝統的なNI抗体力価を測定する方法は、いくつかの理由のために実用的ではありません。最も関心の呈色反応を生成するために必要とされている有害な化学物質です。また、サンプルの大容量が必要とされ、アッセイを行うために煩雑です。これとは対照的に、ELLAは、実行が容易であり、サンプルの妥当な数の滴定を可能にする形式です。アッセイの収量再現性のある結果7,8-ことELLA変動ショーを調べた研究からのデータ。 ELLAは、結果として可能NI抗体力価のルーチン測定をした、そして血清学的研究を行う研究室によって、より頻繁に使用されることが予想されます。 ELLAを行う際に考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、NA活性の非特異的阻害剤が除去されなければなりません。これらの阻害剤は、一般的に熱不安定性、45分間56℃で加熱処理することにより破壊されます。熱処理は、非特異を除去するのに十分ですH3N2ウイルスはELLAで使用される場合H6リアソータントウイルスはNAの供給源として使用されているサンプルからFIC阻害剤が、しかし、ヘマグルチニンに結合する血清因子もELLAを妨害し、シアリダーゼの少量での処理によって除去されるべきです治療9を加熱する前に。これは、アッセイの感度を低下させるように、第2、抗原、 すなわち 、再集合体H6Nxウイルスの過剰な量、使用すべきではありません。ウイルスの注意深い滴定が不可欠なステップです。各アッセイで使用される抗原の量は、すなわち 、十分な背景の上にある信号を提供しなければならない、と滴定曲線の直線範囲内である必要があり、信号（光学密度）は、ウイルスの希釈に比例する必要があります。 ルーチン血清学に加えて、ELLAは、季節性インフルエンザウイルスのNAとの間の抗原性の違いを評価するために使用することができます。包含aのウイルス株を選択するとき、この情報は非常に有用であってもよいですsのワクチン候補とNAの抗原ドリフトにつながる免疫圧力のより深い理解を容易にするであろう。また、ブタ又は鳥インフルエンザウイルスからのNAの抗原分析新興株のパンデミックの可能性を決定する際に重要な情報を提供することができます。

ノイラミニダーゼ（NA）はインフルエンザビリオンの表面上に発現される糖タンパク質です。その酵素活性は、感染細胞1,2-から新たに形成されたウイルス粒子の放出に必須です。活性NA阻害する抗体は、3つの動物モデルにおいてウイルス力価と疾患の症状を軽減し、人間4の疾患に対する抵抗性と相関します。ワクチン接種後のNA阻害（NI）の力価の増加は、したがって、NI抗体価を測定するための伝統的なアッセイはルーチン血清学のための実用的ではないので、しかし、多くの過去のインフルエンザ免疫原性試験は、このエンドポイントが含まれていなかった、ワクチンの有効性の指標を果たすことができます。 NI力価を測定するための従来の方法は、NA 1複合糖質から切断されたシアル酸の量を定量することに基づいています。多くの場合、チオバルビツール酸（TBA）法と呼ばれるこの方法は、シアル交流に変換する有害化学物質を使用して分析法により定量化することができる発色団へのid。アッセイは、個々のガラス管が使用されるため、多数のサンプルを試験するアッセイが煩雑製造には適していません。 96ウェルプレートにアッセイの小型化は、しかし、このアッセイは、依然として有害化学物質の使用を必要とし、したがって、理想的ではない、より実用的な形式5を提供します 。 NI抗体価を測定するための代替アッセイはLambré らによって開発された。6。この検定は、シアル酸がNAによって解放されたときに露出する糖タンパク質、ガラクトースの最後から二番目の糖の量を測定することによって酵素活性を定量化します。ピーナッツ凝集素（PNA）は、ガラクトースと特異的に結合するので、PNA - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）コンジュゲートは、比色読み出しを得るために使用することができます。測定される光学濃度は、試料中のNA活性に比例します。 NI力価が最高希釈を決定することによって測定されますNA活性の少なくとも50％を阻害する血清。この酵素結合レクチンアッセイ（ELLA）はNAのための基質として、フェチュイン、高度にグリコシル化された血清タンパク質でコーティングした96ウェルプレート中で行われます。 NI力価を測定するアッセイのための重要な考慮事項は、NAの源です。ワクチン接種を受けたか、感染した個体からの血清はNAにヘマグルチニン（HA）に対する抗体ならびに抗体が含まれているためです。 HAに結合する抗体は、NAの活性を妨害し、従って、HA特異的抗体による非特異的阻害を避けるために、NA又は抗原不適合HAを含む全ウイルスアッセイに使用されるべきで精製することができます。これらのウイルスは、古典的な再集合により、または逆遺伝学によって発生させることができます。目的は、標的株に関連していないサブタイプのHA、および研究されているウイルスのNAが含まれているウイルスを救出することです。この資料に記載されているアッセイは、回転によって生成されたA型インフルエンザウイルスを採用しますA型インフルエンザウイルス、サブタイプH1N1とH3N2 5から亜型H6のHAおよび目標とNAを含むように遺伝学をERSE。 ELLAと小型化TBAアッセイによって生成された結果は、同様のサブタイプ特異性と感度7で、これらのメソッドは同等で表示されます。 ELLAは、有害化学物質の使用を必要とするため、NI力価を測定するための好ましい方法であるしません。ほんの数ステップ（ 図1）と、実行するのは簡単です：サンプルを希釈し、追加され、フェチュインでコーティングされたプレートへのウイルス（NAのソース）に転送されます。プレートをO / Nインキュベートし、PNA-HRPOを加える前に洗浄されます。 2時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加します。呈色反応を停止させ、最終的には光学濃度が測定され、NAの活性の少なくとも50％阻害をもたらしたサンプル希釈の逆数は、50％終点力価として報告されます。 reproducibiliを評価するためのイントラ実験室での研究ELLAのtyが、プレート間の変動が最小であり、オペレータにオペレータ再現性が力価7でせ ​​いぜい2倍の差が生じたことを示しました。 ELLA変動のその後の研究室間の研究では、異なる実験室で行われ、標準の包含は、さらに結果8のばらつきを低減することができるときアッセイは良好な再現性を持っていることを示しました。 ELLAは、前臨床および臨床インフルエンザワクチン研究7からの血清のパネルにNI抗体力価を測定することに適しており、また、インフルエンザウイルスのNA 9の間の抗原性の違いを評価するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Coating buffer&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-84-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>5x MES, pH 6.5&amp;nbsp;</td><td>KD-Medical</td><td>PBS-0134</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>30% BSA</td><td>Sigma</td><td>A8327</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lectin PNA-HRPO</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;L7759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-T</td><td>Sigma</td><td>P3563-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>96-well&amp;nbsp; Maxisorp plates</td><td>NUNC</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom well plates</td><td>NUNC</td><td>267245</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-192B</td><td></td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Charles River Laboratories</td><td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Variety of suppliers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Rainin, Eppendorf</td><td>8 or 12 channel manual pipette 50-250 &amp;micro;l volume</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Depends on pipettor brand</td><td>Depends on pipettor brand</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader, with 490 nm filter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor V</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 56 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator set to 4 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

ノイラミニダーゼに対する抗体（NA）、インフルエンザウイルスに対する第二の最も豊富な表面タンパク質、インフルエンザに対する保護に寄与する。 （NI）を阻害NAを測定する従来の方法の抗体価は、日常的な血清学的検査のために実用的ではありません。このプロトコルは、酵素結合レクチンアッセイ（ELLA）、大型糖タンパク質基質、フェチュインでコーティングした96ウェルプレートで行われるNI力価を測定するための実用的な代替方法を記載します。最後から二番目の砂糖、ガラクトースを露出するNAを切断フェツインから末端シアル酸を、。ピーナッツ凝集素（PNA）は、ガラクトースに対する特異性を有するレクチンであるため、脱シアリル化の程度は、発色性ペルオキシダーゼ基質を添加したPNA-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して定量することができます。測定される光学密度はNA活性に比例します。 NI抗体価を測定するために、血清の連続希釈物を一定量のOでフェチュインでコーティングされたプレート上で37°CO / NでインキュベートしますF NA。 NA活性の≥50％の阻害をもたらす最高血清希釈の逆数は、NI抗体価として指定されます。 ELLAは、インフルエンザ感染またはワクチン接種後のヒト抗体応答のルーチン評価のための実用的なフォーマットを提供します。

本稿で提示アッセイは、図1に概略的に示されている。 図2は、96ウェルプレートのレイアウトを示し、そして血清サンプルの連続希釈物を、フェチュインでコーティングされたプレートにそれらを転送する前に、希釈プレート中で調製されていることを示しています。アッセイの重要なパラメータは、アッセイで使用されているノイラミニダーゼの量です。これは、再集合体ウイルスの滴定により決定されます。 H6N1およびH6N2ウイルスの力価測定の例が図3に示されている。H6N1の1:10 1:20 1:40希釈で、光学密度は、条件は、最大読み取りが得られるようにしたことを示し、同様でした。 1:80希釈で、読み出しは最大の約90％であり、従って、ウイルスのこの希釈液をその後のアッセイに用いました。血清滴定の例は、 図4に示されている。図ではあったヒト血清サンプルTIを示していますH6N1とH6N2ウイルスに対してtrated。各データ点は、血清の連続希釈によって達成されたNA活性の阻害パーセントを示します。 H6N1アッセイにおける最初の血清希釈は1:80でした。 ≥50％の阻害をもたらす最高希釈は、NIの抗体価であり、この例で示す血清の力価は、NC / 99のNA（N1）に対して640であるので、H6N2アッセイにおける血清の最初の希釈は5でした。およびWI / 05のNA（N2）に対して160。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> 図1. ELLAプロトコルの概略アッセイで使用するための抗原の希釈（ウイルス）の（A）決意（プロトコールのステップ2）：ウイルス希釈をすることによって測定フェチュインコーティングされたプレートとNAのアクティビティに追加されますプロトコルのステップ2.3で説明したようにPNA-HRPOとの結合を介して末端ガラクトース残基を定量化します。 （B </stron<html>血清NI抗体価（プロトコールのステップ3）のグラム&gt;）決意。サンプルを希釈し、その後、ウイル​​スを添加するフェチュインでコーティングされたプレートに移します。プレートは、O / N PNA-HRPOを追加し、呈色反応を生成するために必要な手順を完了する前にインキュベートします。最後に、呈色反応を停止させ、光学密度を測定しました。 NAの活性の少なくとも50％の阻害をもたらすサンプル希釈の逆数が50％終点力価として報告されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> 図2.図はELLAプレートが設定表示されます。血清サンプルの連続希釈は、希釈プレートで作られ、その後、フェチュインでコーティングされたプレートに移しています。<html> 3fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> H6N1とH6N2ウイルス滴定の 図3. 例。H6N1 BR / 07の連続希釈液（AのNA /ブリスベン/ / 2007（H1N1）59は、青色のシンボルで示される）およびH6N2 UR / 07（NA Aの/ウルグアイ/ 716 /赤シンボルに示す2007（H3N2）） フェチュインでコーティングされたプレートで18時間インキュベートし、説明したようにPNA-HRPOとの反応性を決定しました。平均 2つのウェルのOD 490nmのウイルス希釈の逆数に対してプロットされます。 ELLAで使用するために選択H6N1の希釈は1:80だったとこれらの希釈液は、中の最大光学密度の約90％をもたらし、直線範囲内であったため、選択されたH6N2の希釈は1：40でした。3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> N1のNA（赤シンボル）とN2（青シンボル）のサブタイプに対する血清の 図4. 滴定。NA阻害力価は、再集合体ウイルスH6N1 NC / 99に対して測定した（A /ニューカレドニア/ 1999分の20（H1N1）のNAが含まれています）およびH6N2 ウィスコンシン/ 05（含まれているAのNA /ウィスコンシン/ 67/2005（H3N2））。血清の連続希釈物のパーセント酵素阻害を50％阻害を示す破線の水平線で示されています。 AののNAに対するNA阻害力価/ニューカレドニア/ / 1999 20（H1N1）（NC / 99）とA /ウィスコンシン/ 67/2005 2 9.3（640）と2 7.3であった（WI / 05）（H3N2）（それぞれ160）、。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">VEの大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のrsion。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 問題 </td><td> 考えられる原因（複数可） </td><td> 溶液 </td></tr><tr><td>弱い信号またはウイルス滴定に達していない高原</td><td> ⅰ）低NA酵素活性 ⅱ）ウイルスストック最適な条件の下で保存されていません</td><td> i）は、希釈剤は、NA活性のための最適なpHを有することを確認します。 pHが最適である場合、新たなウイルス株または濃縮ウイルスを調製 ⅱ）再増殖し、アリコートの株式; -80℃で保存する前にドライアイス上でスナップ凍結バイアル</td></tr><tr><td>弱いか陽性細胞対照ウェル中の色なし</td><td> ⅰ）ウイルス希釈が誤って割り当てられました 凍結されたウイルスのアリコートにおけるii）のバイアル間変動 ⅲ）PNA- HRPOはあまり変性または希釈します ⅳ）OPDが正しく準備します</td><td>私）;繰り返しウイルス滴定 ⅱ）全く変動がないことを確認するために、同じバッチからいくつかのバイアルを滴定します。著しい変動した場合、新鮮なアリコートを準備 ⅲ）PNA- HRPOをretitrateするために最適なウイルスの希釈を使用します ⅳ）OPDの新鮮な準備と繰り返し</td></tr><tr><td>弱いまたは陽性対照血清による阻害なし</td><td>アッセイで使用ⅰ）多すぎるウイルス ⅱ）血清が悪化</td><td> ⅰ）リピートウイルス滴定 ⅱ）新しい抗血清チェック貯蔵条件を取得</td></tr><tr><td>陰性対照血清による阻害</td><td>血清のⅰ）不適切な熱処理 アッセイで使用ⅱ）少なすぎるウイルス</td><td> ⅰ）血清の熱不活化を繰り返し ⅱ）リピートウイルス滴定</td></tr><tr><td>高いバックグラウンド</td><td> ⅰ）プレートの汚染の可能性を ⅱ）PNA- HRPOの濃度が低すぎる/高すぎます</td><td> ⅰ）たてコーティングしたプレートを使用して繰り返します ⅱ）使用する正しい希釈を識別するために、PNA-HRPOを滴定</td></tr><tr><td>ウイルス滴定は、低希釈でNA活性の見かけの阻害を示します</td><td> I）の尿膜液は、NAのための基質を含んでいてもよいです</td><td> ⅱ）ショ糖クッションを通してペレット化されたウイルスを使用します</td></tr></tbody></table> 性能基準を満たしていないアッセイの表1根本原因分析 。このテーブルには、ELLAを実行するときに発生する可能性のある問題の考えられる原因とソリューションを提供しています。

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Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K ビュー.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

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Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

免疫・感染学

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

医学

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

ELISAアッセイ:間接、サンドイッチ、競争力

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
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Education

JoVE Science Education

高等生物学

免疫学

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Source: Kaufmann, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55833">An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

標的抗原に対する血清抗体を検出するためのヘマググルチン化阻害アッセイ

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫診断

特殊なアッセイ

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

インフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価測定法

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

抗体ベースの技術

特性評価と機能分析

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

Source: Gross, F. L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56448">Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing &#945;2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human serology