The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

注：以下のプロトコルのためのバイオセーフティーレベル（BSL）は潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの季節性インフルエンザウイルスとBSL 3+のためのBSL 2です。ウイルス滴定ウイルス対照（VC）のウイルス濃度を決定するために中和実験の前に必要とされます。 1.ウイルス滴定注：ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートは、以下の柔軟性で設定することができます：（1）ウイルスの希釈は行または列（ 図1）のいずれかに沿って配置することができます。各ウイルスには、個別の行/列を占有する必要があります。 （2）ウイルス希釈増分は柔軟性があるが、それは左上隅に最高ウイルス濃度で開始する必要があります。 （3）複製の数に制限はありません。 注：マディンDarbyイヌ腎臓（MDCK）およびMDCK-SIAT1（SIAT）細胞は、博士M. Matrosovich、マールブルグ、GERによって提供されました10多くの。 SIAT細胞を安定的にヒトCMP-N-アセチルノイでトランスフェクションしたMDCK細胞である：シアル酸（SA）の発現増強のためのβガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子α2-6Galで終わるオリゴ糖。 <ol><li> 96ウェルプレートにMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞8十分なアリコート（200μL/ウェル）。コンフルエンスに到達するために2または3日間、5％CO 2、37℃で細胞をインキュベートします。 10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）を補充したDMEM中で細胞を増殖。 5％CO 2及び1mg / mlのG418硫酸と、37℃でSIAT細胞をインキュベートします。 注：希釈係数を経験し、使用する細胞株に依存しています。細胞単層は、ウイルス接種の時に（ すなわち、無細胞壁またはMDCK細胞用の外形線およびMDCK-SIAT1細胞のための密集したレイアウト）コンフルエントでなければなりません。希釈液としては、例えば、基づきますMDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーを表1に示します。 </li><li>ウェルあたりウイルス増殖培地（VGM）200μlで細胞を3回洗浄。 30分間、70％EtOHで多層プレートウォッシャーを殺菌し、その後洗浄する前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはVGMでそれをすすいでください。 </li><li> VGMを吸引し、直ちに各ウェルにVGMの50μlを添加します。 </li><li> （テストウイルスとの重複数に応じて、または少ない）6滅菌チューブのそれぞれにVGMの900μLを加えます。 、第1のチューブへのウイルスの100μLをピペットでよく混ぜ、およびシリアルに希釈し、各希釈の間にヒントを変更します。滴定する各ウイルスについて、この手順を繰り返します。 注：これは、10 -6に10 -1のウイルス希釈液を与えます。 </li><li> 9の重複ウェル（列9と図1の10）に、最高希釈（ 図1の1×10 -5）から始まる、各ウイルス希釈液50μLを追加6ウェルプレート。 </li><li>ウイルスが細胞に感染することを可能にするために2〜3時間、37℃でプレートを置きます。 注：2〜3時間のインキュベーションは、接種物中のウイルスが単層に到達するのに十分な時間を持っていることを保証する必要があります。 </li><li>オーバーレイを準備します（10ミリリットル/プレート） 注：オーバーレイは（材料リストを参照してください）2×DMEM、トリプシン（2 / mlの最終濃度）の5ミリリットル、1mg / mlのストックを20μl、およびセルロースコットンリンターの5ミリリットルで構成されています。 </li><li>接種物を取り除きます。 </li><li>オーバーレイ（各ウェルに200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩インキュベートします。 注：ウイルス出芽後の約4時間行われるので、プレートは、この時間の後に乱されないことが重要です。 </li><li>井戸からオーバーレイを吸引します。 </li><li> PBS A（200μL/ウェル）で氷冷4％パラホルムアルデヒドを追加します。 30分間または20分間、室温で4°Cでそれらを配置します。 注：PBS Aは10、外出先での自然なpHのリン酸緩衝食塩水であります塩化ナトリウム、塩化カリウム0.25gの、のNa 2 HPO 4、KH 2 PO 4 0.25 gを1.437 gの蒸留水1L（材料リストを参照）、F。 注：パラホルムアルデヒドを吸入したときに有害であると飲み込むと火傷を引き起こす可能性があります。そこ発がん性の限定的な証拠でもあり、それが皮膚に接触した後、感作を引き起こすことがあります。 </li><li>パラホルムアルデヒドを吸引除去し、PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 </li><li>将来の使用のために4℃でPBS Aでプレートを保管し、または以下の手順で行います。 </li><li>透過化バッファー（100μl/ウェル）を追加します。室温で30分間それを残します。 </li><li> PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 </li><li>ウェルあたり、：（ELISAバッファーで千1）第一抗体を50μl、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体を追加します。振とうしながら、1時間（または4℃で一晩）、室温で静置します。 </li><li>洗浄緩衝液（0.05％のTween 80 PBS A、V / V）でのp100μlの中で3回洗浄よくえー。洗浄の間に5分間室温でインキュベート。代わりに、ウェル当たり300μlのを使用してインキュベーションすることなく、それを3回洗浄します。 </li><li>ウェルあたり、：二次抗体50μlを、ヤギ抗マウスIgG（H + L）HRPコンジュゲート（ELISAバッファー1,000 1）を加えます。振とうしながら、1時間室温でインキュベートします。 </li><li>ステップ1.17で説明したように、それを3回洗浄します。 </li><li>基板（50μL/ウェル）を追加します。 30分間、または青色の発色がはっきりと見えるまで室温で静置します。 </li><li>反応を停止させるために、洗浄の間に2 -3分間、室温でインキュベートし、ウェル当たりの蒸留水200μlでプレートを2回洗浄します。 </li><li> （ 例えば、アルミホイルで包ん）プレートを空気乾燥し、暗所に保管してください。 </li></ol> 2.滴定定量<ol><li> 図2aに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置きます。にL字型の位置の制限を使用します最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保します。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 </li><li>画像をスキャンします。 注：設定を表2に示します。 </li><li>必要なウイルス濃度（ 図3）を計算するための「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 <ol><li>画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」タブのヒストグラムで赤いバーをスライドさせます。画像への影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 </li><li> 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 </li><li>負荷または入力ウェルプレート定義マップ。 &quot;：最適なウイルス集団（％）滴定」の閾値（ 例えば、30％）を示します。滴定の結果を計算するために「滴定プロセス」タブを選択します。滴定の結果を確認します。滴定の結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：ソフトウェアの詳細命令について補足S1を参照してください。特注ソフトウェアのコピーは、要求に応じて入手可能です。 注：一般的に、各ウェル11内の50％（20から85パーセント）全細胞のICPの周りにプラーク減少アッセイ利回りのための最高のウイルス希釈。 </li></ol></li></ol> 3.ウイルス中和注：中和アッセイのために必要なプレートの数を計算します。各プレートは、1つのウイルスと抗血清の数を収容することができます。 注：抗血清の数と重複の数に応じて、ウェルプレートを目で設定することができますE以下の柔軟性：（1）血清希釈は、行または列（ 図4）のいずれかに沿って配置することができます。各血清は、別々の行または列を占めるべきです。 （2）血清希釈の増分は柔軟性があるが、それはプレートの左上隅に最高血清中濃度で開始する必要があります。 （3）重複数は、抗血清の数のバランスをとります。より多くの重複が実験的変動を平滑化するのに役立ちます。 （4）VCの数とセル制御（CC）の重複数は柔軟性があり、彼らはまた、独立した行または列にする必要があります。 VCの複製の数は、抗血清のそれよりも有意に大きいことが予想されます。 <ol><li>事前に2または3日間、ステップ1.1から1.3のように、細胞単層を準備します。 </li><li>プレートの各ウェルにVGM50μlのを追加します。 </li><li>それぞれ、VCおよびCCの列11と12を使用してください。コラムの最初の行（A）に一時20受容体破壊酵素（RDE）処理の血清50μlのアリコートを追加ナノ秒1-10。 注：各ウイルスと血清の組み合わせについて、アッセイは二重に行われるので、一方のプレートは、例えば、1つのウイルスは、5つの抗血清に対して試験含んでいてもよいです。 </li><li> H（列図4の1月10日）を行ごとにAから50μLを移すと行H.から50μLを破棄することにより、2倍の段階希釈を行います</li><li> CC欄（ 図4の列12）の各ウェルに希釈液の50μlのを追加します。 </li><li> CCカラム（列1-11、行図4のAH）を除いて、プレートの各ウェルにウイルスの50μLを加えます。 </li><li> 2-3時間、37℃でそれをインキュベートします。接種物を取り除きます。各ウェルにオーバーレイ（200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩静置します。修正し、ウイルス滴定（1.11から1.22ステップ）の場合と同様に、プレートを染色します。 </li></ol> 4.中和定量<ol><li> Figuに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置き図2a再。最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保するために、L字型の位置の制限を使用してください。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 </li><li>ステップ2.2で説明したように、プレートをスキャンします。 </li><li>必要なウイルス力価（ 図3、ステップ2.3）を計算するために、「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 <ol><li>画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」で赤いバーをスライドさせます。影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 </li><li> 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 </li><li>よく-pの負荷または入力後半マップ。で、閾値（ 例えば、50％）を示す「中和：感染控除（％）。」 </li><li>力価を計算するために、「中和プロセス」を選択します。力価を確認し、中和結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：中和はVCに対して事前に定義されたICPの減少（例えば、50％や80％など）（ 図4の11列の平均）との血清の最高希釈の逆数として報告されています。 50％ICP減少は代表的な結果で使用されました。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
<li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A%28H3N2%29+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+%28egg-derived%29+vaccine+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li>
<li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+%28H5N1%29+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol.37%22%5BJournal%5D)">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li>
<li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li>
<li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li>
<li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents%2Fprobes+and+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+World+Summer+2005%22%5BJournal%5D)">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

本研究では、ウイルス間の真の抗原性の関係を定量化するためのイメージングベースのMNアッセイを説明しました。他のプラーク減少アッセイと比較すると、この方法は、感染性人口の完全なカバレッジを確保し、ウェル全体のICPを測定強調しています。プラーク形成のその独立性はまた、主に目に見えない小さなプラークを形成することができるか、それが唯一の単一細胞感染を管理することができ、ウイルスへのアッセイの適用を広げます。したがって、このアッセイはHIよりもウイルスおよび抗体の広い範囲の効果を調べることが可能であり、それは、より包括的に、ウイルス12の間に抗原性の類似性または差異を反映するために役立ちます。例えば、オセルタミビルカルボン酸塩が含まれている場合、MNアッセイは以下より正確に抗原性の違いを反映して、結合NA依存性に影響されます。アッセイの開発の間に、大きな努力が実験の一貫性、速度、および検出を増強するためになされました感度、フラットベッドスキャナでハイスループット定量滴定、撮影により入力ウイルスを制御することを含む、ユーザーフレンドリーなデータ処理プラットフォームを実現します。結果は、一般的と整合されているとHIのものを確認しています。なお、結果はまた、最近のA型およびB型ワクチンウイルスの抗原ドリフト変種間の抗原性の違い、ならびにそのような特定のA（H1N1）pdm09ウイルスのHA1でG155E置換などのカルチャ選択または突発的な変化に起因する抗原性の変化を明らかにしました12。 プロトコルは、大きく撮像信号を増強最強感染を与えた細胞株の選択とウイルス型またはサブタイプと一致しました。実験変動を試験した抗血清の数でバランスが重複のデザインで平滑化しました。不確実性は、また、主撮像装置によって影響される画質、から来ることができます。フラットベッドスキャナはsigniすることができますまともな色ficantly画像のコントラストを改善し、ノイズを低減します。ウイルスはまだ同じような状態を維持しながら、中和における入力ウイルスの量を定量的に対応する滴定から事前に決定されなければなりません。中和の間に、感染に対する抗血清応答は、参照ウイルス（VC）とバックグラウンドレベル（CC）との差に対して正規化されています。 VCとCCの正確な測定は、中和実験には不可欠です。より多くの重複が（8重複が代表的な結果で使用されていた）推奨されています。最後に、ソフトウェアを理解することは、実験の成功に不可欠です。ソフトウェアは、2年以上WHOインフルエンザセンター、英国のルーチンのウイルスの特徴付けのためにテストされています。様々な状況に対処するための詳細な手順は、 補足S1に設けられています。 このMNアッセイは、サンプルが内線をカバーする用途に適していますremely大きな視野だけで適度なイメージング解像度を必要とします。低コストで簡単なセットアップは、ほとんどのウイルス学研究所のシステムを容易に利用できるようにします。同じ試料の測定値の変化は、概ね走査11中に導入不確実性を定義する3％未満でした。このような再現性は、多くのウイルス学的研究に十分であり、さらに、複数のスキャンからの画像を平均化することによって低減することができます。 結論として、この研究は、日常的に、抗原性試験に使用することができ、特にヒトインフルエンザワクチンに含めるためのウイルスの半年ごとの選択のために、現在循環インフルエンザウイルスの詳細な分析にHIデータをサポートするために、強固なMNアッセイを実証します。

マイクロ中和（MN）アッセイは、中和抗体および抗ウイルス活性の定量のためにウイルス学で使用されています。赤血球凝集抑制（HI）アッセイの代替として、MNアッセイは、HI結果1,2,3の解釈を複雑にする可能性がある受容体結合インフルエンザウイルスでの親和性の変化の影響を受けた非抗原性の影響を克服することができます。最近まで、ほとんどのMNアッセイは、細胞変性効果（CPE）または酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）4,5に基づいていました。フォーカスおよびプラーク減少に基づいて、MNアッセイは1990年6,7,8に開発されました。プラーク減少アッセイは、感染性を定量化するために目に見えるプラークを数えるに依存しています。しかし、視覚的な数は、プラークの大部分は小さく、多くの現在の循環ウイルスの不可視であっても、人間の目によって解決される大きなプラークをカバーします。この不完全なカバレッジは私につながる、審査官の間で実験との間に有意な変化を引き起こす可能性がありますncomparable結果。いくつかのウイルスは、単一の細胞または非常に小さいプラークの不稔感染を示すときにメソッドを使用することも不可能です。 悪いカウント分解能は、画像ベースのプロトコルを導入することによって改善することができます。技術の進歩により、光学顕微鏡および高スループットウェルプレートリーダーは、感染した細胞9をカウントするための正確な手段を提供することができます。トランス照射顕微鏡下で、特定のマーカーでタグ付けされた感染細胞の細胞下解像度での吸収または蛍光コントラストにより視覚化することができます。サンプルは、コンピュータ画面上で分析することができます。 残念ながら、視野の制限によるもの、百以上のタイル張りの画像は単一のウェルをカバーするために必要とされます。 96ウェルを有するプレートを分析することについて1万画像の撮像及び処理を必要とするであろう。このような骨の折れるプロセスは時間がかかり、高価であり、分解能が得属でありますウイルス感染のルーチン特徴づけのため不要リットル。限られた予算との研究所では、フラットベッドスキャナを中心に構築されたアプローチは、費用対効果の高い、高スループットの代替手段を提供することがあります。 本稿では、ウイルスの多数の抗原特性評価および定量的に抗ウイルス活性及び中和抗体を測定するのに適している改良されたプラーク減少MNアッセイを説明します。アッセイは、いくつかの利点を有する：第一に、それは関係なく、プラークのサイズ、細胞レベルでのウイルス感染を測定することができるイメージングに基づくアッセイです。ウェル内の総感染細胞集団（ICP）をカウントすると、大幅にそれが可能低い感染性を有するウイルスを特徴付けすること、検出感度を増加させます。第二に、より正確な定量的な滴定は、入力ウイルスの量を決定するために、中和の前に導入されます。定量的な入力ウイルスが大幅ヴァリアーを低減します異なる実験や研究室間の結果測定結果を比較しやすくなるとの間る。第三に、中和力価は、定量は、高速かつユーザーフレンドリーな作り、画像を分析することによって直接決定することができます。最後に、プロトコルは、必要な分解能と精度でコスト効果の高い、高スループットの代替を提供します。定量は、フラットベッドスキャナや無料のデータ処理ソフトウェアに基づいています。全体のセットアップは、小さなフットプリントを持っており、ほとんどの実験室で展開可能です。 本論文で提示プロトコルは、ウイルス滴定、滴定の定量、ウイルス中和し、中和定量を含む4つの主要なステップで構成されています。ウイルス力価測定、中和に使用する入力ウイルスの量を決定する準備の実験です。滴定中に、ウイルス濃度の数は、96ウェルプレート中の細胞単層に適用されます。感染した細胞は、その後、セクション2ウイルスDILUで定量化されています入力に対応する中和にウイルスのようなICPが順番にある-85％が適用される20％を生産化 中和プロトコルの部3の力価は、上記のプロトコルが代表的な結果に提示されている続い部4の実験を用いて定量化されています。アッセイは、このような（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスとして、現在の循環インフルエンザウイルスのほとんどは最後の2年の間に徹底的にテストされています。インフルエンザウイルスの特性評価の結果は、2016年には南半球と2016年から2017年における北半球で使用するためのインフルエンザワクチンに関する勧告を与えたWHO協議会のレポートに含まれていました。

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strep&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10&amp;nbsp;g, KCl 0.25&amp;nbsp;g, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.437 g, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0.25 g, and Dist. Water 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4 g in 100 ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Overlay (10 ml/plate):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Trypsin 2&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml final concentration, Avicell 5&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100&lt;sup&gt;e&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T8787</td><td>Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Wash Buffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb against influenza type A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2&lt;sup&gt;nd&lt;/sup&gt; Antibody: 1:1,000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase substrate</td><td>KPL&amp;nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Substrate: True blue +0.03% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;g&lt;/sup&gt; (1:1,000 of 30% solution)</td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microtitre plates</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8 channel multiwall-plate washer and manifold</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>The imaging software can be downloaded freely from &lt;a href=&quot;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;amp;infoType=Downloads&quot;&gt;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;amp;infoType=Downloads&lt;/a&gt;.</td></tr><tr><td>Software operational environment: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Window based with NI Vision builder</td><td>Version: LabVIEW2012 or above</td></tr></tbody></table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

上記の手順に従って、我々は最近の抗原性の特性評価実験からいくつかの結果を提示します。滴定の設定はそれぞれの希釈のための二重重複で、8つの入力のウイルスを検査するために設計されました。ウイルス希釈液をウイルス間のばらつきをカバーするために、1.0×10 -1および1.0×1.0 -6の間で試験しました。テストウイルスは、A /カメルーン/ 15V-2015分の3538、を含むH3N2亜型、からのものであったA /ウラジオストク/ / 2015 36、A /モスクワ/、A /トムスク/ 10/2015 /、A /モスクワ/ 2015分の101 103 / 2015、A /モスクワ/ 100/2015、A /モスクワ/ 133/2015、およびA /ブラチスラバ/ 2015分の437。滴定の結果は図5に示されています。 図5dは、ウイルス希釈の増加に伴ってのICPの減少を示しています。曲線はウェル12内の全ての細胞に感染をもたらした同じウイルスのICP類に対して標準化した（ICP飽和と定義されます）。 ICPがhiで飽和状態に達しなかった場合ghestウイルス濃度、対応する重複からのICP平均が（ 図5dにA /モスクワ/ 2015分の103）の代わりに使用しました。 ICP飽和の30％を生成したウイルス希釈物を中和するための入力ウイルス希釈液（ 表3）として選択しました。 中和は、各プレート上の二重重複で、5抗血清に対して一つの入力ウイルスに感染していることを目的としました。示した参照ウイルスは、H3N2 A /ストックホルム/ 2015分の63です。 5抗血清は、A / HK 14分の4801卵のF12 / 15、A / HK 14分の7295 MDCK F02 / 15、A /南アフリカR2665 / 15 SIATのF50 / 15、A /スイス13分の9715923 SIAT NIBFのF18 / 15、ですおよびA /オランダ14分の525 SIATのF23 / 15。中和の結果を図6に示されています。 図6dは、血清希釈の増加による感染の進行状況が表示されます。縦軸の正規化された陽性集団は、平均ICPに対して、対応する抗血清応答からのICPの比率を表し、参照ウイルス12の。未感染細胞対照からのバックグラウンドICPは、正規化の際に差し引かれました。中和力価は、50％のICP減少（ 表4）に対応する血清希釈の逆数として決定しました。線形補間は、2つの隣接血清希釈の間に入る力価を推定しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> 図1： ウイルス滴定実験におけるウェルプレートのセットアップの例。テストウイルスは別々の行（HへA）に割り当てられています。列は異なるウイルス希釈物（1〜12）のために設計されています。 2列は、各ウイルス希釈重複として使用しました。スケールバー= 10ミリメートル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： サンプルの走査システムの概略図。 （a）は、フラットベッドスキャナの結像位置に96ウェルプレートは、（より再版します エルゼビアの許可）と11を参照すると、（b）に示したL字型位置制限の寸法（A）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> 図3：「 ウェルプレートリーダー「定量ソフトウェアのデスクトップ図。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </p&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> 図4： 中和実験におけるウェルプレートのセットアップの例。各抗血清は、重複（1〜10）で2列に割り当てられています。行は異なる血清希釈（HへA）のために設計されています。ウイルス制御は、8重複（H11へA11）で、11列を取ります。セル制御は8重複（H12へA12）で、カラム12です。スケールバー= 10ミリメートル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> 図5：滴定実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップが、（b）はウェルプレートの画像を走査し、（c）のイラストウイルス希釈物に対して正規化されたウイルス感染細胞集団色符号化され、定量化、ウイルス感染細胞集団、及び（d）の。 30％のICPを閾値として使用しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> 図6： 中和実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップ、（b）は走査ウェルプレートの画像、（c）の定量、ウイルス感染した細胞集団の図、および（d）血清希釈に対する正規化されたウイルス感染細胞集団。入力のviRUS（VC）は/ストックホルム/ 2015分の63です。 50％のICPは、力価を計算しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足S1： <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> 典型的な希釈 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK細胞 </td><td> MDCK-SIAT1細胞 </td></tr><tr><td> 2日 </td><td> 1：5（1 + 4） </td><td>午前1時10分（+ 9 1） </td></tr><tr><td> 3日 </td&gt; <td>午前1時10分（+ 9 1） </td><td> 1時20分（1 + 19） </td></tr><tr><td colspan="3"> ミリリットル当たりの細胞の典型的な数 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK細胞 </td><td> MDCK-SIAT1細胞 </td></tr><tr><td> 2日 </td><td> 2×10 5 </td><td> 1×10 5 </td></tr><tr><td> 3日 </td><td> 1×10 5 </td><td> 5×10 4 </td></tr></tbody></table> 表1：MDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーに典型的な希釈液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>モード</td><td>プロフェッショナルモード</td></tr><tr><td>ドキュメントの種類</td><td>フィルム（フィルムエリアガイド付き） </td></tr><tr><td>自動露出タイプ</td><td>写真</td></tr><tr><td>イム年齢の種類</td><td> 24ビットカラー</td></tr><tr><td>解決</td><td> 1200 dpiの</td></tr><tr><td>保存された画像フォーマット</td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> 表2：フラットベッドスキャナの典型的なセットアップ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 行 </td><td> ウイルス </td><td> 推奨される希釈 </td></tr><tr><td> A </td><td> A /キャメロン/ 15V-2016分の3538 </td><td> 1.0×10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A /ウラジオストク/ 2015分の36 </td><td> 1.0×10 -3 </td></tr><tr><td> C言語 </td><td> A /モスクワ/ 103/2015 </td><td> 1.1×10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A /トムスク/ 2015分の5 </td><td> 5.9×10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A /モスクワ/ 101/2015 </td><td> 8.3×10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A /モスクワ/ 100/2015 </td><td> 1.4×10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A /モスクワ/ 133/2015 </td><td> 1.3×10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A /ブラチスラバ/ 437/2015 </td><td> 1.3×10 -4 </td></tr></tbody></table> 表3：30％、ICPの母集団から算出したウイルス希釈液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> カラム </td><td> 抗血清 </td><td> 推奨される力価 </td></tr><tr><td> 1から2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3から4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td6 - &gt; 5 </td><td> A /南アフリカ/ R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7から8 </td><td> /スイス/ 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9から10 </td><td> A /オランダ/ 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> 表4：抗血清に対するA /ストックホルムの50％ICP / 2015分の63で力価。

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.1K ビュー.  The Francis Crick Institute. この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。 

ビデオ: Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

合成オリゴヌクレオチドを用いたDNA酵素のアッセイ

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

著者スポットライト:Characterizing Novel Enzymes from Extremophiles and Common Pathogens to Understand DNA Repair and Replication

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

生化学

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

免疫・感染学

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The characterization of these anti-drug antibodies (ADA), especially those that may neutralize the biological activity of the drug, termed neutralizing antibodies (NAbs), is crucial in understanding the effects of these antibodies on the drug&#39;s pharmacological profile. This protocol describes a cell-based flow cytometry method to detect factors that neutralize the cellular uptake of a representative lysosomal ERT in human matrix. The protocol consists of three procedures: screening, a confirmatory step, and titer assays to detect, identify, and establish the relative level of neutralizing antibody titer in subject samples.
In this method, samples are first mixed with the fluorophore-conjugated ERT product, then incubated with cells [e.g., human T lymphocytes (Jurkat cells)] that express a cell-surface cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR), and finally, analyzed with a flow cytometer. A sample without NAbs will result in the uptake of the fluorophore-conjugated ERT product via CI-M6PR, whereas, the presence of NAbs will bind to the drug and interfere with the CI-M6PR binding and uptake. The amount of the fluorophore-conjugated ERT internalized by the Jurkat cells is measured by flow cytometry and evaluated as the percentage (%) signal inhibition compared to the response obtained in the presence of a representative drug-na&#239;ve matrix. In the confirmatory step, the samples are pre-incubated with ERT-conjugated magnetic beads to deplete drug-specific factors that bind to the drug (such as NAbs) prior to an incubation with cells. Samples that screen and confirm positive for drug-specific NAbs in the assay are then serially diluted to generate an antibody titer. Semi-quantitative antibody titers may be correlated with measurements of drug safety and efficacy.

Here we present a cell-based flow cytometry method to detect neutralizing antibodies or other factors that interfere with the cellular uptake of enzyme replacement therapies in a human matrix, such as cerebral spinal fluid (CSF) or human serum.

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

生物学

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

要約

さらに動画を探す

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

試金を使用して SIAT1 MDCK 細胞のインフルエンザ a (h3n2) ウイルス中和によるひと血清中の抗体を中和することを測定

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法