The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

注：以下のプロトコルのためのバイオセーフティーレベル（BSL）は潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの季節性インフルエンザウイルスとBSL 3+のためのBSL 2です。ウイルス滴定ウイルス対照（VC）のウイルス濃度を決定するために中和実験の前に必要とされます。 1.ウイルス滴定注：ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートは、以下の柔軟性で設定することができます：（1）ウイルスの希釈は行または列（ 図1）のいずれかに沿って配置することができます。各ウイルスには、個別の行/列を占有する必要があります。 （2）ウイルス希釈増分は柔軟性があるが、それは左上隅に最高ウイルス濃度で開始する必要があります。 （3）複製の数に制限はありません。 注：マディンDarbyイヌ腎臓（MDCK）およびMDCK-SIAT1（SIAT）細胞は、博士M. Matrosovich、マールブルグ、GERによって提供されました10多くの。 SIAT細胞を安定的にヒトCMP-N-アセチルノイでトランスフェクションしたMDCK細胞である：シアル酸（SA）の発現増強のためのβガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子α2-6Galで終わるオリゴ糖。 <ol><li> 96ウェルプレートにMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞8十分なアリコート（200μL/ウェル）。コンフルエンスに到達するために2または3日間、5％CO 2、37℃で細胞をインキュベートします。 10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）を補充したDMEM中で細胞を増殖。 5％CO 2及び1mg / mlのG418硫酸と、37℃でSIAT細胞をインキュベートします。 注：希釈係数を経験し、使用する細胞株に依存しています。細胞単層は、ウイルス接種の時に（ すなわち、無細胞壁またはMDCK細胞用の外形線およびMDCK-SIAT1細胞のための密集したレイアウト）コンフルエントでなければなりません。希釈液としては、例えば、基づきますMDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーを表1に示します。 </li><li>ウェルあたりウイルス増殖培地（VGM）200μlで細胞を3回洗浄。 30分間、70％EtOHで多層プレートウォッシャーを殺菌し、その後洗浄する前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはVGMでそれをすすいでください。 </li><li> VGMを吸引し、直ちに各ウェルにVGMの50μlを添加します。 </li><li> （テストウイルスとの重複数に応じて、または少ない）6滅菌チューブのそれぞれにVGMの900μLを加えます。 、第1のチューブへのウイルスの100μLをピペットでよく混ぜ、およびシリアルに希釈し、各希釈の間にヒントを変更します。滴定する各ウイルスについて、この手順を繰り返します。 注：これは、10 -6に10 -1のウイルス希釈液を与えます。 </li><li> 9の重複ウェル（列9と図1の10）に、最高希釈（ 図1の1×10 -5）から始まる、各ウイルス希釈液50μLを追加6ウェルプレート。 </li><li>ウイルスが細胞に感染することを可能にするために2〜3時間、37℃でプレートを置きます。 注：2〜3時間のインキュベーションは、接種物中のウイルスが単層に到達するのに十分な時間を持っていることを保証する必要があります。 </li><li>オーバーレイを準備します（10ミリリットル/プレート） 注：オーバーレイは（材料リストを参照してください）2×DMEM、トリプシン（2 / mlの最終濃度）の5ミリリットル、1mg / mlのストックを20μl、およびセルロースコットンリンターの5ミリリットルで構成されています。 </li><li>接種物を取り除きます。 </li><li>オーバーレイ（各ウェルに200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩インキュベートします。 注：ウイルス出芽後の約4時間行われるので、プレートは、この時間の後に乱されないことが重要です。 </li><li>井戸からオーバーレイを吸引します。 </li><li> PBS A（200μL/ウェル）で氷冷4％パラホルムアルデヒドを追加します。 30分間または20分間、室温で4°Cでそれらを配置します。 注：PBS Aは10、外出先での自然なpHのリン酸緩衝食塩水であります塩化ナトリウム、塩化カリウム0.25gの、のNa 2 HPO 4、KH 2 PO 4 0.25 gを1.437 gの蒸留水1L（材料リストを参照）、F。 注：パラホルムアルデヒドを吸入したときに有害であると飲み込むと火傷を引き起こす可能性があります。そこ発がん性の限定的な証拠でもあり、それが皮膚に接触した後、感作を引き起こすことがあります。 </li><li>パラホルムアルデヒドを吸引除去し、PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 </li><li>将来の使用のために4℃でPBS Aでプレートを保管し、または以下の手順で行います。 </li><li>透過化バッファー（100μl/ウェル）を追加します。室温で30分間それを残します。 </li><li> PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 </li><li>ウェルあたり、：（ELISAバッファーで千1）第一抗体を50μl、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体を追加します。振とうしながら、1時間（または4℃で一晩）、室温で静置します。 </li><li>洗浄緩衝液（0.05％のTween 80 PBS A、V / V）でのp100μlの中で3回洗浄よくえー。洗浄の間に5分間室温でインキュベート。代わりに、ウェル当たり300μlのを使用してインキュベーションすることなく、それを3回洗浄します。 </li><li>ウェルあたり、：二次抗体50μlを、ヤギ抗マウスIgG（H + L）HRPコンジュゲート（ELISAバッファー1,000 1）を加えます。振とうしながら、1時間室温でインキュベートします。 </li><li>ステップ1.17で説明したように、それを3回洗浄します。 </li><li>基板（50μL/ウェル）を追加します。 30分間、または青色の発色がはっきりと見えるまで室温で静置します。 </li><li>反応を停止させるために、洗浄の間に2 -3分間、室温でインキュベートし、ウェル当たりの蒸留水200μlでプレートを2回洗浄します。 </li><li> （ 例えば、アルミホイルで包ん）プレートを空気乾燥し、暗所に保管してください。 </li></ol> 2.滴定定量<ol><li> 図2aに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置きます。にL字型の位置の制限を使用します最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保します。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 </li><li>画像をスキャンします。 注：設定を表2に示します。 </li><li>必要なウイルス濃度（ 図3）を計算するための「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 <ol><li>画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」タブのヒストグラムで赤いバーをスライドさせます。画像への影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 </li><li> 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 </li><li>負荷または入力ウェルプレート定義マップ。 &quot;：最適なウイルス集団（％）滴定」の閾値（ 例えば、30％）を示します。滴定の結果を計算するために「滴定プロセス」タブを選択します。滴定の結果を確認します。滴定の結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：ソフトウェアの詳細命令について補足S1を参照してください。特注ソフトウェアのコピーは、要求に応じて入手可能です。 注：一般的に、各ウェル11内の50％（20から85パーセント）全細胞のICPの周りにプラーク減少アッセイ利回りのための最高のウイルス希釈。 </li></ol></li></ol> 3.ウイルス中和注：中和アッセイのために必要なプレートの数を計算します。各プレートは、1つのウイルスと抗血清の数を収容することができます。 注：抗血清の数と重複の数に応じて、ウェルプレートを目で設定することができますE以下の柔軟性：（1）血清希釈は、行または列（ 図4）のいずれかに沿って配置することができます。各血清は、別々の行または列を占めるべきです。 （2）血清希釈の増分は柔軟性があるが、それはプレートの左上隅に最高血清中濃度で開始する必要があります。 （3）重複数は、抗血清の数のバランスをとります。より多くの重複が実験的変動を平滑化するのに役立ちます。 （4）VCの数とセル制御（CC）の重複数は柔軟性があり、彼らはまた、独立した行または列にする必要があります。 VCの複製の数は、抗血清のそれよりも有意に大きいことが予想されます。 <ol><li>事前に2または3日間、ステップ1.1から1.3のように、細胞単層を準備します。 </li><li>プレートの各ウェルにVGM50μlのを追加します。 </li><li>それぞれ、VCおよびCCの列11と12を使用してください。コラムの最初の行（A）に一時20受容体破壊酵素（RDE）処理の血清50μlのアリコートを追加ナノ秒1-10。 注：各ウイルスと血清の組み合わせについて、アッセイは二重に行われるので、一方のプレートは、例えば、1つのウイルスは、5つの抗血清に対して試験含んでいてもよいです。 </li><li> H（列図4の1月10日）を行ごとにAから50μLを移すと行H.から50μLを破棄することにより、2倍の段階希釈を行います</li><li> CC欄（ 図4の列12）の各ウェルに希釈液の50μlのを追加します。 </li><li> CCカラム（列1-11、行図4のAH）を除いて、プレートの各ウェルにウイルスの50μLを加えます。 </li><li> 2-3時間、37℃でそれをインキュベートします。接種物を取り除きます。各ウェルにオーバーレイ（200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩静置します。修正し、ウイルス滴定（1.11から1.22ステップ）の場合と同様に、プレートを染色します。 </li></ol> 4.中和定量<ol><li> Figuに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置き図2a再。最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保するために、L字型の位置の制限を使用してください。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 </li><li>ステップ2.2で説明したように、プレートをスキャンします。 </li><li>必要なウイルス力価（ 図3、ステップ2.3）を計算するために、「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 <ol><li>画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」で赤いバーをスライドさせます。影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 </li><li> 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 </li><li>よく-pの負荷または入力後半マップ。で、閾値（ 例えば、50％）を示す「中和：感染控除（％）。」 </li><li>力価を計算するために、「中和プロセス」を選択します。力価を確認し、中和結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：中和はVCに対して事前に定義されたICPの減少（例えば、50％や80％など）（ 図4の11列の平均）との血清の最高希釈の逆数として報告されています。 50％ICP減少は代表的な結果で使用されました。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本研究では、ウイルス間の真の抗原性の関係を定量化するためのイメージングベースのMNアッセイを説明しました。他のプラーク減少アッセイと比較すると、この方法は、感染性人口の完全なカバレッジを確保し、ウェル全体のICPを測定強調しています。プラーク形成のその独立性はまた、主に目に見えない小さなプラークを形成することができるか、それが唯一の単一細胞感染を管理することができ、ウイルスへのアッセイの適用を広げます。したがって、このアッセイはHIよりもウイルスおよび抗体の広い範囲の効果を調べることが可能であり、それは、より包括的に、ウイルス12の間に抗原性の類似性または差異を反映するために役立ちます。例えば、オセルタミビルカルボン酸塩が含まれている場合、MNアッセイは以下より正確に抗原性の違いを反映して、結合NA依存性に影響されます。アッセイの開発の間に、大きな努力が実験の一貫性、速度、および検出を増強するためになされました感度、フラットベッドスキャナでハイスループット定量滴定、撮影により入力ウイルスを制御することを含む、ユーザーフレンドリーなデータ処理プラットフォームを実現します。結果は、一般的と整合されているとHIのものを確認しています。なお、結果はまた、最近のA型およびB型ワクチンウイルスの抗原ドリフト変種間の抗原性の違い、ならびにそのような特定のA（H1N1）pdm09ウイルスのHA1でG155E置換などのカルチャ選択または突発的な変化に起因する抗原性の変化を明らかにしました12。 プロトコルは、大きく撮像信号を増強最強感染を与えた細胞株の選択とウイルス型またはサブタイプと一致しました。実験変動を試験した抗血清の数でバランスが重複のデザインで平滑化しました。不確実性は、また、主撮像装置によって影響される画質、から来ることができます。フラットベッドスキャナはsigniすることができますまともな色ficantly画像のコントラストを改善し、ノイズを低減します。ウイルスはまだ同じような状態を維持しながら、中和における入力ウイルスの量を定量的に対応する滴定から事前に決定されなければなりません。中和の間に、感染に対する抗血清応答は、参照ウイルス（VC）とバックグラウンドレベル（CC）との差に対して正規化されています。 VCとCCの正確な測定は、中和実験には不可欠です。より多くの重複が（8重複が代表的な結果で使用されていた）推奨されています。最後に、ソフトウェアを理解することは、実験の成功に不可欠です。ソフトウェアは、2年以上WHOインフルエンザセンター、英国のルーチンのウイルスの特徴付けのためにテストされています。様々な状況に対処するための詳細な手順は、 補足S1に設けられています。 このMNアッセイは、サンプルが内線をカバーする用途に適していますremely大きな視野だけで適度なイメージング解像度を必要とします。低コストで簡単なセットアップは、ほとんどのウイルス学研究所のシステムを容易に利用できるようにします。同じ試料の測定値の変化は、概ね走査11中に導入不確実性を定義する3％未満でした。このような再現性は、多くのウイルス学的研究に十分であり、さらに、複数のスキャンからの画像を平均化することによって低減することができます。 結論として、この研究は、日常的に、抗原性試験に使用することができ、特にヒトインフルエンザワクチンに含めるためのウイルスの半年ごとの選択のために、現在循環インフルエンザウイルスの詳細な分析にHIデータをサポートするために、強固なMNアッセイを実証します。

マイクロ中和（MN）アッセイは、中和抗体および抗ウイルス活性の定量のためにウイルス学で使用されています。赤血球凝集抑制（HI）アッセイの代替として、MNアッセイは、HI結果1,2,3の解釈を複雑にする可能性がある受容体結合インフルエンザウイルスでの親和性の変化の影響を受けた非抗原性の影響を克服することができます。最近まで、ほとんどのMNアッセイは、細胞変性効果（CPE）または酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）4,5に基づいていました。フォーカスおよびプラーク減少に基づいて、MNアッセイは1990年6,7,8に開発されました。プラーク減少アッセイは、感染性を定量化するために目に見えるプラークを数えるに依存しています。しかし、視覚的な数は、プラークの大部分は小さく、多くの現在の循環ウイルスの不可視であっても、人間の目によって解決される大きなプラークをカバーします。この不完全なカバレッジは私につながる、審査官の間で実験との間に有意な変化を引き起こす可能性がありますncomparable結果。いくつかのウイルスは、単一の細胞または非常に小さいプラークの不稔感染を示すときにメソッドを使用することも不可能です。 悪いカウント分解能は、画像ベースのプロトコルを導入することによって改善することができます。技術の進歩により、光学顕微鏡および高スループットウェルプレートリーダーは、感染した細胞9をカウントするための正確な手段を提供することができます。トランス照射顕微鏡下で、特定のマーカーでタグ付けされた感染細胞の細胞下解像度での吸収または蛍光コントラストにより視覚化することができます。サンプルは、コンピュータ画面上で分析することができます。 残念ながら、視野の制限によるもの、百以上のタイル張りの画像は単一のウェルをカバーするために必要とされます。 96ウェルを有するプレートを分析することについて1万画像の撮像及び処理を必要とするであろう。このような骨の折れるプロセスは時間がかかり、高価であり、分解能が得属でありますウイルス感染のルーチン特徴づけのため不要リットル。限られた予算との研究所では、フラットベッドスキャナを中心に構築されたアプローチは、費用対効果の高い、高スループットの代替手段を提供することがあります。 本稿では、ウイルスの多数の抗原特性評価および定量的に抗ウイルス活性及び中和抗体を測定するのに適している改良されたプラーク減少MNアッセイを説明します。アッセイは、いくつかの利点を有する：第一に、それは関係なく、プラークのサイズ、細胞レベルでのウイルス感染を測定することができるイメージングに基づくアッセイです。ウェル内の総感染細胞集団（ICP）をカウントすると、大幅にそれが可能低い感染性を有するウイルスを特徴付けすること、検出感度を増加させます。第二に、より正確な定量的な滴定は、入力ウイルスの量を決定するために、中和の前に導入されます。定量的な入力ウイルスが大幅ヴァリアーを低減します異なる実験や研究室間の結果測定結果を比較しやすくなるとの間る。第三に、中和力価は、定量は、高速かつユーザーフレンドリーな作り、画像を分析することによって直接決定することができます。最後に、プロトコルは、必要な分解能と精度でコスト効果の高い、高スループットの代替を提供します。定量は、フラットベッドスキャナや無料のデータ処理ソフトウェアに基づいています。全体のセットアップは、小さなフットプリントを持っており、ほとんどの実験室で展開可能です。 本論文で提示プロトコルは、ウイルス滴定、滴定の定量、ウイルス中和し、中和定量を含む4つの主要なステップで構成されています。ウイルス力価測定、中和に使用する入力ウイルスの量を決定する準備の実験です。滴定中に、ウイルス濃度の数は、96ウェルプレート中の細胞単層に適用されます。感染した細胞は、その後、セクション2ウイルスDILUで定量化されています入力に対応する中和にウイルスのようなICPが順番にある-85％が適用される20％を生産化 中和プロトコルの部3の力価は、上記のプロトコルが代表的な結果に提示されている続い部4の実験を用いて定量化されています。アッセイは、このような（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスとして、現在の循環インフルエンザウイルスのほとんどは最後の2年の間に徹底的にテストされています。インフルエンザウイルスの特性評価の結果は、2016年には南半球と2016年から2017年における北半球で使用するためのインフルエンザワクチンに関する勧告を与えたWHO協議会のレポートに含まれていました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

上記の手順に従って、我々は最近の抗原性の特性評価実験からいくつかの結果を提示します。滴定の設定はそれぞれの希釈のための二重重複で、8つの入力のウイルスを検査するために設計されました。ウイルス希釈液をウイルス間のばらつきをカバーするために、1.0×10 -1および1.0×1.0 -6の間で試験しました。テストウイルスは、A /カメルーン/ 15V-2015分の3538、を含むH3N2亜型、からのものであったA /ウラジオストク/ / 2015 36、A /モスクワ/、A /トムスク/ 10/2015 /、A /モスクワ/ 2015分の101 103 / 2015、A /モスクワ/ 100/2015、A /モスクワ/ 133/2015、およびA /ブラチスラバ/ 2015分の437。滴定の結果は図5に示されています。 図5dは、ウイルス希釈の増加に伴ってのICPの減少を示しています。曲線はウェル12内の全ての細胞に感染をもたらした同じウイルスのICP類に対して標準化した（ICP飽和と定義されます）。 ICPがhiで飽和状態に達しなかった場合ghestウイルス濃度、対応する重複からのICP平均が（ 図5dにA /モスクワ/ 2015分の103）の代わりに使用しました。 ICP飽和の30％を生成したウイルス希釈物を中和するための入力ウイルス希釈液（ 表3）として選択しました。 中和は、各プレート上の二重重複で、5抗血清に対して一つの入力ウイルスに感染していることを目的としました。示した参照ウイルスは、H3N2 A /ストックホルム/ 2015分の63です。 5抗血清は、A / HK 14分の4801卵のF12 / 15、A / HK 14分の7295 MDCK F02 / 15、A /南アフリカR2665 / 15 SIATのF50 / 15、A /スイス13分の9715923 SIAT NIBFのF18 / 15、ですおよびA /オランダ14分の525 SIATのF23 / 15。中和の結果を図6に示されています。 図6dは、血清希釈の増加による感染の進行状況が表示されます。縦軸の正規化された陽性集団は、平均ICPに対して、対応する抗血清応答からのICPの比率を表し、参照ウイルス12の。未感染細胞対照からのバックグラウンドICPは、正規化の際に差し引かれました。中和力価は、50％のICP減少（ 表4）に対応する血清希釈の逆数として決定しました。線形補間は、2つの隣接血清希釈の間に入る力価を推定しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> 図1： ウイルス滴定実験におけるウェルプレートのセットアップの例。テストウイルスは別々の行（HへA）に割り当てられています。列は異なるウイルス希釈物（1〜12）のために設計されています。 2列は、各ウイルス希釈重複として使用しました。スケールバー= 10ミリメートル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： サンプルの走査システムの概略図。 （a）は、フラットベッドスキャナの結像位置に96ウェルプレートは、（より再版します エルゼビアの許可）と11を参照すると、（b）に示したL字型位置制限の寸法（A）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> 図3：「 ウェルプレートリーダー「定量ソフトウェアのデスクトップ図。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </p&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> 図4： 中和実験におけるウェルプレートのセットアップの例。各抗血清は、重複（1〜10）で2列に割り当てられています。行は異なる血清希釈（HへA）のために設計されています。ウイルス制御は、8重複（H11へA11）で、11列を取ります。セル制御は8重複（H12へA12）で、カラム12です。スケールバー= 10ミリメートル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> 図5：滴定実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップが、（b）はウェルプレートの画像を走査し、（c）のイラストウイルス希釈物に対して正規化されたウイルス感染細胞集団色符号化され、定量化、ウイルス感染細胞集団、及び（d）の。 30％のICPを閾値として使用しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> 図6： 中和実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップ、（b）は走査ウェルプレートの画像、（c）の定量、ウイルス感染した細胞集団の図、および（d）血清希釈に対する正規化されたウイルス感染細胞集団。入力のviRUS（VC）は/ストックホルム/ 2015分の63です。 50％のICPは、力価を計算しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足S1： <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> 典型的な希釈 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK細胞 </td><td> MDCK-SIAT1細胞 </td></tr><tr><td> 2日 </td><td> 1：5（1 + 4） </td><td>午前1時10分（+ 9 1） </td></tr><tr><td> 3日 </td&gt; <td>午前1時10分（+ 9 1） </td><td> 1時20分（1 + 19） </td></tr><tr><td colspan="3"> ミリリットル当たりの細胞の典型的な数 </td></tr><tr><td></td><td> MDCK細胞 </td><td> MDCK-SIAT1細胞 </td></tr><tr><td> 2日 </td><td> 2×10 5 </td><td> 1×10 5 </td></tr><tr><td> 3日 </td><td> 1×10 5 </td><td> 5×10 4 </td></tr></tbody></table> 表1：MDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーに典型的な希釈液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>モード</td><td>プロフェッショナルモード</td></tr><tr><td>ドキュメントの種類</td><td>フィルム（フィルムエリアガイド付き） </td></tr><tr><td>自動露出タイプ</td><td>写真</td></tr><tr><td>イム年齢の種類</td><td> 24ビットカラー</td></tr><tr><td>解決</td><td> 1200 dpiの</td></tr><tr><td>保存された画像フォーマット</td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> 表2：フラットベッドスキャナの典型的なセットアップ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 行 </td><td> ウイルス </td><td> 推奨される希釈 </td></tr><tr><td> A </td><td> A /キャメロン/ 15V-2016分の3538 </td><td> 1.0×10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A /ウラジオストク/ 2015分の36 </td><td> 1.0×10 -3 </td></tr><tr><td> C言語 </td><td> A /モスクワ/ 103/2015 </td><td> 1.1×10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A /トムスク/ 2015分の5 </td><td> 5.9×10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A /モスクワ/ 101/2015 </td><td> 8.3×10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A /モスクワ/ 100/2015 </td><td> 1.4×10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A /モスクワ/ 133/2015 </td><td> 1.3×10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A /ブラチスラバ/ 437/2015 </td><td> 1.3×10 -4 </td></tr></tbody></table> 表3：30％、ICPの母集団から算出したウイルス希釈液。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> カラム </td><td> 抗血清 </td><td> 推奨される力価 </td></tr><tr><td> 1から2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3から4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td6 - &gt; 5 </td><td> A /南アフリカ/ R2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7から8 </td><td> /スイス/ 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9から10 </td><td> A /オランダ/ 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> 表4：抗血清に対するA /ストックホルムの50％ICP / 2015分の63で力価。

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Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K ビュー.  The Francis Crick Institute. この研究は説明します ウイルス間の抗原性の関係を分析するための画像化ベースのマイクロ中和アッセイ。プロトコルは、フラットベッドスキャナを使用し、滴定、滴定の定量、中和、及び中和定量を含む4つのステップがあります。アッセイは、現在の循環インフルエンザA（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスでうまく動作します。 

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

免疫・感染学

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...