This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Tutti i virus reassortant dal vivo con i componenti aviarie devono essere maneggiati con livello di biosicurezza 2 (BSL2) pratiche -Enhanced in un laboratorio approvato per l&#39;uso da parte del Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e il comitato di biosicurezza istituzionale. 1. Preparazione dei reagenti e materiale di partenza Nota: fare riferimento alla tabella materiali per ottenere la fonte di tutti i reagenti. <ol><li> Piastre Fetuina rivestite <ol><li> Preparare tampone di rivestimento mescolando 10 ml 10x tampone di rivestimento con 90 ml di H 2 O. deionizzata </li><li> Preparare una soluzione stock di Fetuina a 25 mg / ml in tampone di rivestimento 1x e conservare in 500 microlitri aliquote a -20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di fetuina (25 mg / ml) immediatamente prima di lastre di verniciatura diluendo la soluzione madre 1.000 volte in 1x tampone di rivestimento. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 ml di soluzione di lavoro di fetuina in all pozzetti di una piastra a 96 pozzetti che ha alta capacità di legame con le proteine. </li><li> Coprire ogni piatto con un sigillante piatto poi impilare le piastre in gruppi di 10 e avvolgerli in carta stagnola. </li><li> Posizionare le piastre in frigorifero (2-8 ° C) per almeno 18 ore prima di eseguire un test. Nota: Le piastre possono essere rivestite in anticipo e memorizzati con la soluzione di rivestimento a 2-8 ° C per 2 mesi. </li></ol></li><li> diluenti <ol><li> Per preparare il diluente per fare dei virus e dei campioni diluizioni (2- (N -morpholino) di acido etansolfonico (MES), pH 6,5, 20 mM CaCl 2, 1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,5% Tween 20), mescolare 94,2 ml 1X MES, pH 6,5 con 2 ml di CaCl 2 (10 mg / ml), 3,3 ml di 30% di BSA e 0,5 ml di Tween 20. </li><li> Per preparare il diluente per PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con 20 mM CaCl 2 e 1% BSA), miscela 94.7 ml 1x MES, pH 6,5 con 2 ml di CaCl 2 (10 mg / ml) e 3,3 ml di 30% BSA . </li></ol></li><li> Neuraminidasi (NA) Nota: H6Nx reass virusortants (questi hanno HA di H6 sottotipo e la NA di interesse), sono generati seguenti metodi pubblicati 5,10. Richiedi fiale di virus reassortant inattivato da un collaboratore se non sono disponibili in-house. Quando si utilizza il virus inattivato, confermare che la preparazione è adatto per l&#39;uso in ELLA attraverso la dimostrazione che il processo di inattivazione non ha avuto un impatto significativo sull&#39;attività NA. <ol><li> Culture uno stock di virus H6Nx in uova di gallina embrionate 11 e memorizzare 0,5 ml aliquote di liquido allantoico ordinata a -80 ° C. </li><li> Utilizzare una nuova aliquota di virus per ogni test. Non congelare e scongelare le aliquote. </li></ol></li><li> I campioni di siero e Controlli <ol><li> Calore inattivare tutti i sieri (campioni di prova ad esempio, sieri pre e post-vaccinazione, così come i comandi, ad esempio, campioni con nota NI titolo) in un bagno di acqua a 56 ° C per 45-60 min. Conservare i sieri da -20 a -70 ° C prima o dopo il trattamento termico. Se la SAMPles devono essere testati più volte, fare diverse aliquote prima del congelamento in modo che il campione non è più volte congelati e scongelati. </li><li> Utilizzare il ELLA per misurare i titoli NI di sieri umani che sono disponibili in quantità sufficiente (&gt; 5 ml) per identificare almeno uno con basso titolo e un altro con un alto titolo. Conservare aliquote di 100 microlitri come ≤-20 ° C in modo che lo stesso campione può essere utilizzato come controllo in molti saggi per monitorare le prestazioni del dosaggio. </li></ol></li><li> Peanut Agglutinina (PNA) -Horseradish perossidasi (HRPO) <ol><li> Preparare il diluente PNA-HRPO (MES, pH 6,5 con CaCl 2 e 1% BSA). </li><li> Preparare una soluzione stock PNA-HRPO sciogliendo 1 mg di PNA-HRPO in 1 ml di diluente. Conservare 20-200 aliquote microlitri a -20 ° C. </li><li> Prima di utilizzare un nuovo lotto PNA-HRPO, test 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 e 1: 2000 diluizioni di questo reagente per identificare la quantità che determina OD massima con il controllo positivo (solo virus) e uno sfondo ( nessun virus) tcappello è &lt;10% del segnale positivo. <ol><li> Fare diluizioni virus quadruplicato come descritto nel paragrafo 2.1. </li><li> Trasferire le diluizioni ad una piastra Fetuina rivestita come descritto nella sezione 2.2 e incubare la piastra a 37 ° C. </li><li> Lavare la piastra 16-18 hr tardi e aggiungere 1: 500, 1: 750, 1: 1.000 e 1: 2.000 diluizioni di PNA-HRPO (100 microlitri / pozzetto) per duplicare le righe della piastra. </li><li> Completare il test come descritto nei punti 2.3.4 a 2.3.9. </li><li> Esamina i dati per selezionare la diluizione che ha provocato un segnale massimo che è&gt; 10 volte precedenti. </li></ol></li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare la diluizione ottimale del PNA-HRPO identificate in 1.5.3. </li></ol></li><li> Preparare un grande volume di tampone di lavaggio (0,01 M tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4, 0,05% Tween 20 (PBS-T)). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare il substrato perossidasi (o-Fenilendiammina dicloridrato (OPD)): Nota: substrati perossidasi alternative come 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), può essere utilizzato <ol><li> Preparare tampone fosfato-citrato sciogliendo 1 capsula in 100 ml dH 2 O del giorno di dosaggio. </li><li> Sciogliere 1 OPD compresse (10 mg) in 20 ml di tampone fosfato-citrato immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di arresto (1 NH 2 SO 4): aggiungere 27,2 ml di 98% H 2 SO 4-973 ml dH 2 O. Mescolare e poi conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Determinazione dell&#39;importo di NA da utilizzare in ELLA <ol><li> Preparare diluizioni virus in un 96-pozzetti <ol><li> Dispensare 120 microlitri del campione diluente (punto 1.2) in colonne 1-11 della piastra di diluizione. </li><li> Per la colonna 1, aggiungere un ulteriore 96 ml diluente campioni. </li><li> Scongelare e poi vortice la fiala di virus prima di aggiungere 24 ml nei pozzetti duplicati nella colonna 1. Questo dà una diluizione 1:10 di virus. </li><li> Effettuare diluizioni seriali 2-fold di virus nel diluente campioni, trasferendo120 ml da un bene per i prossimi utilizzando puntali puliti per ogni diluizione. </li></ol></li><li> Trasferimento diluizioni Virus ad una piastra Fetuina rivestite <ol><li> Lavare le Fetuina rivestite piastra 3 volte con PBS-T (sezione 1.6) e poi cancellare ogni piatto sul tovagliolo di carta assorbente per eliminare qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente per campioni (punto 1.2.1) per ciascun bene nelle colonne da 1 a 11 della piastra Fetuina rivestita. </li><li> Aggiungere 100 ml di diluente campioni di colonna 12 (questi pozzi sono il controllo negativo). </li><li> Trasferimento 50 ml di virus diluito da colonne 1-11 della piastra di diluizione ai corrispondenti pozzetti della piastra Fetuina rivestita. </li><li> Coprire la piastra con un sigillante piatto e poi metterlo in un incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Prendere nota del momento in cui verranno eseguiti passaggi rimanenti (16-18 ore più tardi). </li></ol></li><li> Completa la Determinazione NA <ol><li> Quando l&#39;incubazione è completa (16-18 ore), trasferire ilpiatto al banco e rimuovere la pellicola sigillante. </li><li> Lavare la piastra 6 volte con PBS-T (sezione 1.7) e poi invertito e pacca sulla carta assorbente per garantire tutto il liquido è stato rimosso dai pozzetti. </li><li> Aggiungere 100 ml / pozzetto soluzione PNA-HRPO (alla diluizione determinato 1.5.3) a tutti i pozzetti e incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Meno di 15 minuti prima dell&#39;incubazione alla fine, preparare la soluzione OPD come descritto nella sezione 1.7. </li><li> Lavare le piastre di prova per 3 volte per rimuovere il PNA-HRPO e asciugare prima di aggiungere 100 ml di substrato OPD in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra per esattamente 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 100 ml / pozzetto di acido solforico 1N. </li><li> Utilizzare un lettore di piastre per misurare la densità ottica (OD) a 490 nm per 0,1 sec. </li><li> Salvare ed esportare tutti i file di dati. </li></ol></li><li> Selezionare la diluizione Virus che verrà utilizzato per gli esami sierologici <ol><li> Disegnare un grafico che traccia OD 490nm </sub&gt; valori ad ogni diluizione virus. Controllare la curva di titolazione per identificare il segnale massimo (questo è solitamente il segnale che corrisponde ad un plateau all&#39;inizio della curva di titolazione), il segnale minimo (pozzetti che contengono nessun virus nella colonna 12 della piastra di fornire il controllo di sfondo), e le diluizioni del virus che provocano OD proporzionale alla diluizione di ingresso (cioè, nella regione lineare della curva). </li><li> Selezionare la diluizione virus che dà circa il 90% del segnale massimo ed è all&#39;interno del range lineare. Verificare che la densità ottica a diluizione selezionato è almeno 10 volte maggiore del segnale di fondo. Utilizzare la diluizione virus selezionato per tutte le analisi che impiegano questo particolare virus magazzino. Nota: In alternativa, misurare l&#39;attività NA del virus e utilizzare ~ 15-20 μU NA attività / ml nel ELLA. </li></ol></li></ol> 3. Enzyme-linked lectina Assay Nota: Figura 2 shoWS l&#39;installazione delle piastre di diluizione e dosaggio. <ol><li> Fare diluizioni del campione <ol><li> Posizionare i campioni inattivati ​​al calore sul ghiaccio. Nota: 8 sieri diluibile in ciascuna piastra. </li><li> Per un set up utilizzando diluizioni a partire da 01:10 tutta la piastra, aggiungere 120 ml di diluente del campione a tutti i pozzetti nelle colonne 3-11. </li><li> Per colonna 2, aggiungere 216 ml di diluente del campione e 24 ml di ogni campione. Mescolare il campione nel pozzetto pipettando su e giù 3 volte e poi trasferire 120 microlitri nella colonna successiva. </li><li> Dopo aver cambiato le punte delle pipette, mescolare il contenuto del pozzo pipettando su e giù e poi trasferire 120 ml alla colonna successiva. </li><li> Ripetere il punto 3.1.4 fino a quando il campione è stato trasferito alla colonna 11 e le restanti 120 ml scartato. </li></ol></li><li> Aggiungere Campioni e Virus alla Piastra Fetuina rivestite <ol><li> Scongelare una fiala di virus, vortice e risospendere il virus nel diluente (punto 1.2) alla diluizione che è stato selezionato al passaggio 2.4.2. Preparare almeno 5 ml di virus per ogni piastra test. Mantenere il virus diluito in ghiaccio fino le piastre vengono lavate e campioni di siero sono stati aggiunti alla piastra. </li><li> Decidere il numero di lastre Fetuina rivestite che sono necessarie per il saggio (applicata in via generale 4 sieri per piastra). Lavare le Fetuina rivestite piastra 3 volte con PBS-T e poi capovolgere ogni piatto e asciugare su carta assorbente per eliminare l&#39;eccesso di tampone di lavaggio. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 50 ml di ogni controllo siero o diluizione del campione dalla piastra di diluizione in pozzetti duplicati nelle colonne 2-11. </li><li> Aggiungere 50 ml di virus diluito a tutti i pozzetti tranne per il controllo negativo (colonna 12). </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente per campioni di pozzi nella colonna 1 e aggiungere 100 ml di diluente per campioni di colonna 12. </li><li> Coprire i pozzetti con un sigillante piatto e poi mescolare picchiettando delicatamente i lati del piatto o posizionare su un agitatore a velocità moderata per 10 sec. </li><li> Porre la piastra in una Humidifincubatore IED a 37 ° C per 16-18 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere PNA-HRPO e completare il test come descritto nella sezione 2.3 </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Determinare la validità dei risultati del test <ol><li> Verificare che i valori di fondo (senza virus) sono meno del 10% del controllo positivo (virus e senza siero). </li><li> Verificare che i titoli del controllo corsa sieri a diversi dosaggi utilizzando le stesse condizioni si trovano a 2 volte del titolo mediana. </li><li> Verificare che le misure di densità ottica di pozzetti di controllo sono coerenti (≤20% diversi) e che le misurazioni OD di pozzetti del campione duplicato sono coerenti (≤10% diverso). </li><li> Determinare la causa principale dei risultati non validi e ripetere il test se i criteri di cui al 4.1.1, 4.1.2 o 4.1.3, non sono soddisfatte. Considerare i fattori presentati nella tabella 1 quando si cerca di risolvere i problemi. </li></ol></li><li> Assegnare un end-point Titer 50% <ol><li> Per ogni piatto saggio, subtract sfondo media (nessun antigene aggiunti ai pozzetti) da tutte le letture. </li><li> Calcolare la percentuale di inibizione ad ogni diluizione di siero con la formula: 100 x (virus OD solo controllo - campione di prova OD) / virus OD solo il controllo. </li><li> Identificare la diluizione più elevata che ha provocato almeno il 50% di inibizione del segnale massimo. </li><li> Relazione il reciproco di questa diluizione come end-point titolo 50%. Nota: Se il 50% di inibizione non è stato raggiunto in qualsiasi diluizione, il titolo è inferiore alla prima diluizione testata, ad esempio, &lt;10 quando 1:10 è la prima diluizione testata. </li></ol></li><li> Calcolare la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) <ol><li> Utilizzare quattro regressioni logistiche parametro per determinare la IC50 titolo come segue: sottrarre il fondo media da tutte le letture e poi trasferire i risultati di un programma che esegue l&#39;analisi di regressione. </li><li> Utilizzare regressione non lineare, con la massima impostataal virus controllano e il minimo impostato a zero, per determinare la diluizione che corrisponde esattamente il 50% di inibizione. </li><li> Segnala il reciproco di questa diluizione come IC50 titolo. </li></ol></li></ol>

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The authors have no conflicts of interest.

Il saggio lectina enzimatico è un metodo pratico per misurare NI titoli anticorpali nel siero. Sebbene ELLA stato descritto da Lambre et al., Nel 1990, la sua accettazione come un test sierologico standard è stato più recente, con numerosi laboratori che effettuano test per misurare NI titoli anticorpali di campioni clinici 12-16. Alcune modifiche possono essere apportate passi protocollo senza un grande impatto ai titoli NI che vengono misurati. Ad esempio, PBS può essere utilizzato come diluente, tuttavia, è molto utile per confrontare le curve virus titolazione nel buffer consigliata (MES, pH 6,5) e PBS prima che una decisione è presa, come alcuni sottotipi di NA hanno significativamente ridotta attività enzimatica a pH&gt; 7,0. Quando il pH ottimale non viene utilizzato, il segnale massimo di virus può essere ridotta, con conseguente utilizzo di una quantità eccessiva di antigene (ad esempio, virus) nel saggio; in queste condizioni, il campione potrebbe avere sensibilità ridotta. alcuni noinibizione specifica-n si osserva quando i sieri non trattata sono testati nel ELLA. Questo viene rimosso mediante trattamento termico (56 ° C per 45 min), indicando la presenza di termolabili beta-inibitori. Altri inibitori non specifici (α e γ-classe) di influenza HA sono stati descritti, in particolare in relazione alle H3N2 emoagglutinazione virus e infettività. Infatti, l&#39;inibizione non specifico si osserva anche in ELLA quando H3N2 sono utilizzati come fonte di NA; questa inibizione viene rimosso mediante trattamento dei campioni di siero con una piccola quantità di sialidasi 9. Per quanto riguarda altri test sierologici, controlli negativi e positivi devono essere inclusi in ogni test di fornire un mezzo per valutare le prestazioni del dosaggio. Quando il test non ha soddisfatto i criteri di accettazione, il motivo dovrebbe essere identificato. Tabella 1 fornisce un elenco di potenziali punti nel test che possono essere affrontate per risolvere i problemi. Il prov protocollo ELLAided in questo rapporto utilizza il virus reassortant che contengono HA proveniente da un virus aviario, come fonte di NA. Questo presenta una limitazione di eseguire il test, perché il permesso è richiesto per lavorare con bassi virus aviari patogeni. H6Nx virus reassortant possono essere condivisi tra i laboratori dopo che sono stati inattivati. Pertanto il saggio può essere condotto attraverso collaborazioni volta laboratorio generare virus reassortant ha dimostrato che l&#39;inattivazione è completa e la preparazione ha conservato la propria attività NA. Il vincolo di utilizzare H6Nx virus reassortant può essere superato utilizzando fonti non infettive di NA. Ad esempio, alcuni laboratori hanno utilizzato purificata ricombinante NA 17, mentre altri hanno usato particelle virus-simili (VLP) 15. Tuttavia, né ricombinante NA né VLP sono facilmente disponibili e pertanto si continuano ad usare virus influenzali con una HA aviaria antigenicamente-non corrispondenti. Il tradizionaleMetodo per misurare NI titoli anticorpali non è pratico per diversi motivi; di maggiore preoccupazione sono le sostanze chimiche nocive che sono necessari per produrre una reazione di colore. Inoltre, sono necessari grandi volumi di campione e il test è ingombrante da eseguire. Al contrario, il ELLA è facile da eseguire ed è in un formato che consente la titolazione di un numero ragionevole di campioni. I dati provenienti da studi che ha esaminato ELLA variabilità mostrano che i risultati del test i rendimenti riproducibili 7,8. Il ELLA ha di conseguenza reso la misurazione di routine di titoli anticorpali NI possibili, e si prevede che sarà usato più frequentemente dai laboratori che conducono studi sierologici. Ci sono diversi passaggi critici che devono essere considerati quando si esegue il ELLA. Innanzitutto, inibitori non specifici di attività NA devono essere rimossi. Questi inibitori sono generalmente termolabili e vengono distrutti dal trattamento termico a 56 ° C per 45 min. Il trattamento termico è sufficiente rimuovere non specific inibitori di campioni quando H6 virus reassortant sono utilizzati come fonte di NA, tuttavia, quando H3N2 sono utilizzati nella ELLA, fattori di siero che si legano a emoagglutinina interferiscono anche con la ELLA e devono essere rimossi per trattamento con una piccola quantità di sialidasi prima del trattamento termico 9. In secondo luogo, una quantità eccessiva di antigene, cioè, virus H6Nx reassortant, non deve essere utilizzato come questo riduce la sensibilità del test. titolazione attenta del virus è quindi un passo essenziale; la quantità di antigene usato in ciascun saggio deve fornire un segnale che è ben al di sopra del fondo, e deve essere compresa nell&#39;intervallo lineare della curva di titolazione, cioè, il segnale (densità ottica) deve essere proporzionale alla diluizione virus. Oltre alla sierologia di routine, il ELLA può essere utilizzato per valutare le differenze antigeniche tra AN di virus influenzali stagionali. Queste informazioni possono essere molto utile quando si seleziona i ceppi di virus per l&#39;inclusione di uns candidati vaccini e faciliterà una maggiore comprensione delle pressioni immunitarie che provocano deriva antigenica di NA. Inoltre, l&#39;analisi antigenica dei NAS da virus dell&#39;influenza suina o aviaria può fornire informazioni critiche nel determinare la potenziale pandemia di ceppi emergenti.

Neuraminidasi (NA) è una glicoproteina espressa sulla superficie di virioni dell&#39;influenza. L&#39;attività enzimatica è essenziale per il rilascio di particelle virali neoformate da cellule infette 1,2. Gli anticorpi che inibiscono l&#39;attività NA riducono titoli di virus e sintomi della malattia in modelli animali 3 e correlazione con la resistenza contro la malattia negli esseri umani 4. Un aumento di inibizione NA (NI) titoli a seguito della vaccinazione può quindi servire un indicatore di efficacia del vaccino, tuttavia molti studi di immunogenicità passato influenza non hanno incluso questo punto finale, perché il test tradizionale per misurare NI titoli anticorpali è impraticabile per gli esami sierologici di routine. Il metodo tradizionale per misurare titoli NI è basato sulla quantificazione della quantità di acido sialico che viene scisso dalla glicoconiugati da NA 1. Questo metodo, spesso indicato come metodo tiobarbiturico acid (TBA), utilizza sostanze chimiche pericolose per convertire ac sialicoid per un cromoforo che può essere quantificata mediante spettrometria. Il test non è adatto per verificare un gran numero di campioni in quanto vengono utilizzati tubi di vetro individuali, rendendo il dosaggio ingombrante. La miniaturizzazione del test di un 96 pozzetti fornisce un formato più pratico 5, tuttavia questo test richiede ancora l&#39;uso di sostanze chimiche tossiche e quindi non è ideale. Un test alternativo per misurare NI titoli anticorpali è stato sviluppato da Lambre et al. 6. Questo test quantifica attività enzimatica misurando la quantità di zucchero penultimo glicoproteine, galattosio, che diventa esposto quando l&#39;acido sialico è rilasciato da NA. Poiché arachidi agglutinina (PNA) si lega specificamente al galattosio, una perossidasi di rafano-PNA (HRPO) coniugato può essere usata per ottenere un colorimetrico visualizzazione. La densità ottica che viene misurato è quindi proporzionale all&#39;attività NA nel campione. titoli NI sono misurate determinando la più alta diluizionedi siero che inibisce almeno il 50% dell&#39;attività NA. Questo test lectina enzimatico (ELLA) viene effettuata in piastre da 96 pozzetti rivestiti con fetuina, una proteina del siero altamente glicosilata, come substrato per la NA. Una considerazione importante per i saggi che misurano titoli NI, è la fonte di NA. Questo perché sieri di soggetti vaccinati o infetti contengono anticorpi contro emoagglutinina (HA), così come gli anticorpi per NA. Gli anticorpi che si legano a HA possono interferire con l&#39;attività NA e quindi, per evitare l&#39;inibizione non specifica da anticorpi HA-specifici, purificato NA o virus intero contenente un HA antigenicamente-mismatched deve essere utilizzato nel saggio. Questi virus possono essere generati da riassortimento classica o dalla genetica inversa; l&#39;obiettivo è quello di salvare un virus che contiene HA di un sottotipo che non è legato al ceppo di destinazione, e NA del virus che viene studiato. Il test descritto in questo articolo utilizza i virus dell&#39;influenza A, che vengono generati dal revERSE genetica per contenere HA del sottotipo H6 e mirato NA dal virus dell&#39;influenza A, sottotipo H1N1 e H3N2 5. I risultati generati da Ella e saggi TBA miniaturizzati mostrano questi metodi sono paragonabili, con simile specificità e sensibilità sottotipo 7. ELLA non richiede l&#39;uso di sostanze chimiche pericolose e quindi è il metodo preferito per misurare titoli NI. E &#39;facile da eseguire, con pochi passi (Figura 1): campioni vengono diluiti e trasferiti ad una piastra rivestita Fetuina cui virus (la fonte di NA) è aggiunto. La piastra viene incubata O / N e lavato prima di aggiungere PNA-HRPO. Dopo una incubazione di 2 ore, la piastra viene lavata e viene aggiunto substrato della perossidasi; la reazione colorimetrica si arresta e infine la densità ottica è misurata e il reciproco della diluizione del campione che ha provocato almeno il 50% di inibizione dell&#39;attività NA è riportata come end-point titolo 50%. Uno studio intra-laboratorio per valutare reproducibility del ELLA, ha dimostrato che la variabilità piastra-to-plate è minima e l&#39;operatore a operatore di ripetibilità portato a differenze più di 2 volte del titolo 7. Un successivo studio inter-laboratorio di ELLA variabilità ha mostrato che il test ha una buona riproducibilità quando eseguite in laboratori diversi e che l&#39;inclusione di uno standard in grado di ridurre ulteriormente la variabilità nei risultati 8. Il ELLA è adatto per misurare NI titoli anticorpali in pannelli di siero di studi vaccino influenzale preclinici e clinici 7 e può essere utilizzato anche per valutare le differenze antigeniche tra le AN di virus influenzali 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">KPL</td>
			<td style="width:113px;">50-84-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;fetuin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3385</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5X MES, pH 6.5&#160;</td>
			<td>KD-Medical</td>
			<td>PBS-0134</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8327</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin PNA-HRPO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;L7759</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS-T</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3563-10PAK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">o-Phenylenediamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8287</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-citrate buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4922</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well&#160; Maxisorp plates</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>439454</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well round bottom well plates</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>267245</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate sealers</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>14-245-192B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chicken eggs</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multichannel pipette</td>
			<td>Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf</td>
			<td>8 or 12 channel manual pipettem 50-250 &#181;l volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips</td>
			<td>Depends on pipettor brand</td>
			<td>Depends on pipettor brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader, with 490 nm filter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Victor V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">water bath set to 37 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">water bath set to 56 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigerator set to 4 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator set to 37 &#176;C</td>
			<td>Variety of suppliers&#160;</td>
			<td>Variety of models</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

Gli anticorpi anti-neuraminidasi (NA), la seconda più abbondante proteina di superficie sul virus dell&#39;influenza, contribuiscono verso la protezione contro l&#39;influenza. I metodi tradizionali per misurare NA inibizione (NI) titoli anticorpali non sono pratici per gli esami sierologici di routine. Questo protocollo descrive il dosaggio enzimatico lectina (ELLA), un metodo alternativo pratico per misurare i titoli NI che viene eseguita in 96 pozzetti rivestiti con un ampio substrato glicoproteina, fetuina. unirà NA acidi terminali sialico da Fetuina, esponendo lo zucchero penultima, galattosio. Arachidi agglutinina (PNA) è una lectina con specificità per galattosio e quindi la portata della desialylation può essere quantificato utilizzando un coniugato perossidasi di rafano-PNA, seguita da aggiunta di un substrato cromogenico perossidasi. La densità ottica che viene misurato è proporzionale all&#39;attività NA. Per misurare NI titoli anticorpali, diluizioni seriali di sieri vengono incubate a 37 ° CO / N su piastre Fetuina rivestite con un importo fisso of NA. Il reciproco della diluizione più alta del siero che si traduce in ≥50% inibizione dell&#39;attività NA è designato come il titolo anticorpale NI. Il ELLA fornisce un formato pratico per la valutazione di routine delle risposte anticorpali umani a seguito di infezione influenzale o la vaccinazione.

Il saggio presentato in questo manoscritto è illustrato schematicamente in Figura 1. La Figura 2 mostra il layout di piastra da 96 pozzetti, e indica che diluizioni seriali dei campioni di siero sono preparati in una piastra di diluizione prima di trasferirli alla piastra Fetuina rivestita. Un parametro critico del test è la quantità di neuraminidasi che viene utilizzato nel saggio; questo è determinato attraverso la titolazione del virus reassortant. Esempi di H6N1 e H6N2 titolazioni virali sono mostrati in figura 3. In 1:10, 1:20 e 1:40 diluizioni H6N1, la densità ottica era simile, indicando che le condizioni erano tali che una lettura massima è stata ottenuta. Ad una diluizione 1:80, la lettura-out era circa il 90% del massimo e quindi questa diluizione del virus è stato utilizzato in saggi successivi. Esempi di titolazioni siero sono mostrati in Figura 4. La figura mostra un campione di siero umano che era titrati contro H6N1 e virus H6N2. Ciascun punto dati mostra la percentuale di inibizione di attività NA che è stato raggiunto da diluizioni seriali di siero; la prima diluizione del siero nel test H6N1 era 1:80; la prima diluizione del siero nel dosaggio H6N2 era 5. Poiché la diluizione più elevata che provoca ≥50% di inibizione è il titolo anticorpale NI, il titolo del siero mostrato in questo esempio è 640 contro la NA NC / 99 (N1) e 160 contro il NA di WI / 05 (N2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . Figura 1. Uno schema del protocollo ELLA (A) Determinazione della diluizione di antigene (virus) da utilizzare nel test (fase 2 del protocollo): diluizioni di virus sono aggiunti ad una piastra rivestita fetuina e l&#39;attività NA misurata dal quantificare i residui di galattosio terminale attraverso il legame di PNA-HRPO come descritto al punto 2.3 del protocollo; (B </stron<html> g&gt;) Determinazione dei titoli anticorpali NI siero (punto 3 del protocollo). I campioni vengono diluiti e quindi trasferiti ad una piastra Fetuina rivestita in cui viene aggiunto virus. La piastra è incubata O / N prima di aggiungere PNA-HRPO e completando i passi necessari per generare una reazione di colore. Infine, la reazione del colore viene bloccato e la densità ottica è misurata. Il reciproco della diluizione del campione che si traduce in almeno il 50% di inibizione dell&#39;attività di NA viene segnalato come end-point titolo del 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma che mostra la piastra ELLA impostato. Diluizioni seriali dei campioni di siero sono realizzati in una piastra di diluizione e quindi trasferiti ad una piastra Fetuina rivestita.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di H6N1 e H6N2 titolazioni virus. Diluizioni seriali di H6N1 BR / 07 (NA di A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) mostrato in simboli blu) e H6N2 UR / 07 (NA di A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2) mostrato in simboli rossi) sono state incubate per 18 ore in piastre fetuina rivestite e la reattività con PNA-HRPO determinato come descritto. Media OD 490nm di 2 pozzi è tracciata contro il reciproco della diluizione virus. La diluizione di H6N1 selezionato per l&#39;uso nel ELLA era 1:80 e della diluizione H6N2 selezionato era 01:40 perché queste diluizioni portato a circa il 90% della densità ottica massima e sono rimasti nel range lineare.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> Figura 4. La titolazione del siero contro NA di N1 (simboli rossi) e N2 (simboli blu) sottotipi. NA titoli di inibizione sono stati misurati contro i virus H6N1 reassortant NC / 99 (contiene il NA di A / Nuova Caledonia / 20/1999 (H1N1) ) e H6N2 WI / 05 (contiene il NA di A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). inibizione dell&#39;enzima per cento per diluizioni seriali del siero viene mostrata con la linea orizzontale tratteggiata che indica il 50% di inibizione. L&#39;inibizione titoli NA contro l&#39;AN di A / Nuova Caledonia / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) e A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) erano 2 9.3 (640) e 2 7.3 ( 160), rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">cliccate qui per visualizzare un grande ve</a>rsion di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Cause possibili) </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td> Segnale debole o assente plateau raggiunto nel titolazione del virus </td><td> i) l&#39;attività enzimatica bassa NA ii) del virus Stock non conservato in condizioni ottimali </td><td> i) confermano che il diluente ha pH che è ottimale per l&#39;attività NA; se il pH è ottimale, preparare un nuovo virus magazzino o concentrato virus ii) ricrescere e un&#39;aliquota magazzino; fiale snap-freeze in ghiaccio asciutto prima di riporlo a -80 ° C </td></tr><tr><td> colore debole o assente in pozzetti di controllo delle cellule positive </td><td> i) la diluizione Virus assegnato in modo non corretto ii) Vial-to-vial variabilità in aliquote congelate dei virus iii) PNA- HRPO denaturato o diluito troppo iv) OPD preparati in modo non corretto </td><td> io); titolazione del virus Ripetere ii) Titolare diverse fiale dello stesso lotto per garantire che non vi è alcuna variabilità. Se significativa variabilità, preparare aliquote freschi iii) la diluizione usare virus ottimale retitrate PNA- HRPO iv) Ripetere con la preparazione fresca di OPD </td></tr><tr><td> Debole o assente inibizione da parte di sieri di controllo positivo </td><td> i) Troppo virus impiegato per test ii) Siero deteriorata </td><td> i) la titolazione Ripetere virus ii) Ottenere nuove condizioni di conservazione antisieri Controlla </td></tr><tr><td> L&#39;inibizione da sieri di controllo negativo </td><td> i) inadeguato trattamento termico del siero ii) Troppo poco virus impiegato per test </td><td> i) Ripetere calore inattivazione del siero ii) la titolazione Ripetere virus </td></tr><tr><td> alta sfondo </td><td> i) possibile contaminazione di piastre ii) la concentrazione PNA- HRPO troppo alta / troppo bassa </td><td> i) Ripetere con piastre rivestite di fresco ii) Titolare PNA-HRPO per identificare corretta diluizione da utilizzare </td></tr><tr><td> Virus titolazione mostra apparente inibizione dell&#39;attività NA a basse diluizioni </td><td> i) liquido allantoico può contenere substrato per NA </td><td> ii) uso di virus che è stato in granuli attraverso un cuscino di saccarosio </td></tr></tbody></table> Tabella 1. l&#39;analisi delle cause di test che non soddisfano i criteri di prestazione. Questa tabella fornisce le possibili cause e soluzioni per i problemi che possono verificarsi durante l&#39;esecuzione del ELLA.

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Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Views.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Immunologia e infezioni

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...