This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).

本研究では、承認され、カリフォルニア大学アーバイン校で施設内動物管理使用委員会の勧告に準じて行きました。すべての手順は、イソフルラン麻酔下で実施し、すべての努力は苦痛を最小限に抑えるために行われました。 同種指向性レトロウイルスの1世代<ol><li>商用マキシプレップキットまたは塩化セシウム精製のどちらかを使用して、少なくとも1μgの/μlの濃度で高品質のプラスミドを準備します。 注：言及（これらは、（この場合はCALR 7,8）目的の遺伝子をコードするMSCVのバックボーンベクターが含まれており、選択のマーカー（ など GFP、ネオ、）だけでなく、同種指向性パッケージングプラスミド、エンコードギャグ-POL-ENVここでは、プラスミドなど）。 </li><li> DMEM中で解凍し、展開した低継代293T細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシン（D10）で、10％FBSおよびL-グルタミンを補充しました。プレート加湿さ10cm組織培養処理皿の中で5×10 6個の細胞組織培養を37℃にてインキュベーター、5％CO 2。 </li><li>培養中の293T細胞を展開します。トランスフェクションの前日には、真空フラスコに1mlのPBSを吸引上清を添加することにより、細胞を洗浄。 </li><li>細胞をトリプシン処理するには、2ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、インキュベート料理を2加湿組織培養インキュベーター中- 3分37℃、5％CO 2。 </li><li>トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。 </li><li> 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。 </li><li>血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。 </li><li>シード生成されたウイルスごとに3つの10cmの組織培養処理皿に皿当たり2×10 6個の細胞。 注 ： -トランスフェクションまたは悪いウイルス収量の時点で50％コンフルエンスを得ることができる最適な結果を得るためには、30を超える細胞が許可されていません。 </li><li>すぐにトランスフェクションの前に、真空フラスコに培地を吸引し、5mlの新鮮なD10と交換します。 </li><li>すべての10 CMのペトリ皿は、個々の滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブを準備するトランスフェクトします。 </li><li>ピペット減少血清培地の760μlの各マイクロ遠心チューブには、慎重に直接メディアへのトランスフェクション試薬の40μlを添加します。 5分間室温で組織培養フード中で管をインキュベートします。 </li><li>目的の遺伝子（空のベクターを用いて、15μgの場合）だけでなく、それぞれのチューブに5μgのプラスミドでMSCVベクター30μgのを追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。さらに15分間組織培養フード中で室温でインキュベートします。 注：小さいベクターは、ウイルスの収量を有する傾向があります。 </li><li>慎重に滴下、そのそれぞれ10センチメートルペトリ皿に各反応（約800μl）を、総容量を追加し、穏やかに混合するために左右に料理を傾けます。加湿した組織のcuに細胞を返しますltureインキュベーター。 </li><li>組織培養インキュベーター中で8時間または一晩のインキュベーション後、静かに吸引真空フラスコにメディアとは、新鮮なD10の10ミリリットルと交換してください。 </li><li> 48時間後、トランスフェクション時に35ミリリットル注射器に上清を回収し、細胞破片を除去するために0.45μmの膜でろ過します。 </li><li>オプション：バック293T細胞および追加のウイルスに置き10ミリリットル新鮮なD10は72時間トランスフェクション後に収穫することができます。 </li><li>追加のウイルスが回収されない場合、バイオハザード廃棄物中の293T細胞を処分。 </li><li>単回使用量（ウイルス力価のために例えば1ミリリットルまたはBM感染の6.5ミリリットル）にアリコートウイルス上清。 -80℃で液体窒素とストアウイルスによるフラッシュ凍結ウイルス。 注：彼らは非常にウイルス力価を減少させるように繰り返し凍結/融解の繰り返しは避けてください。 </li></ol> 2.フローサイトメトリーによって相対ウイルス力価を決定します<ol><li> 3T3細胞を解凍し、D10に維持します。 10センチメートル文化細胞加湿した組織培養37℃インキュベーター、5％CO 2で組織培養処理皿。 </li><li>三重でウイルス力価を実行します。細胞を調製するために、真空フラスコに1mlのPBSと吸引上清を添加することによって細胞を洗浄します。 </li><li>細胞をトリプシン処理するために2mlの0.05％トリプシンを追加し、インキュベート皿を加湿組織培養インキュベーター中、37℃で、5％CO 2。 </li><li>トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。 </li><li> 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。 </li><li>血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。 </li><li>シード15 60ミリメートル組織培養処理皿に1×10 5細胞の密度で3T3細胞と一晩インキュベートします。 </li><li> 3、1：10、1：30、および1：1ミリリットルの合計にD10を使用して解凍したウイルス上清の100希釈液1を加えます。また、ウイルスフリーコントロールが含まれています。 </li><li>私を吸引真空フラスコに3T3細胞から径とD10の4ミリリットルと交換してください。 </li><li>ウイルス上清の希釈液で3T3細胞をオーバーレイし、各ディッシュに最終濃度8μg/ mlとなるようにポリブレンを追加します。 37℃で組織培養インキュベーター中で48時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li>フローサイトメトリーによる相対的なウイルス力価を決定します。 <ol><li>細胞を洗浄するために、真空フラスコにメディアを吸引し、5ミリリットルのPBSを追加します。 </li><li>真空フラスコにPBSを吸引除去します。 1ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、2、37℃でインキュベート - 5分は皿から細胞を剥離します。 </li><li>プレートから残りの細胞を剥離するには、上下3ミリリットルのD10とピペットを追加します。 10分間400×gでFACSチューブと遠心分離機に細胞を移します。 </li><li>上清を除去し、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 10分であり、デカンテーション、上清のための400×gで遠心分離します。 200μlのPBSで再懸濁。 </li><li> 9フローサイトメーターで細胞を実行します。トン内3万イベント - 20,000を収集彼は（SSC 対 FSCによって決定される）セルゲートを生き、GFP +およびGFPの割合を計算-細胞を。 注：ウイルス力価が許容できると考えられているときにウイルス上清の収率は、少なくとも50％のGFP + 3T3細胞の1時30希釈。 50％未満のGFP +細胞におけるこの希釈の結果は、その後、次善の変換結果を得ることができる場合。ウイルス力価を決定するための計算は、リモンらから適合させました。 、 ブラッド （1997）9。 </li><li>希釈ファクター×ウイルス力価=粒子形成単位（PFU）/ mlの= [上清の（GFP +細胞の頻度×3T3細胞の数）/容量（ml）]：相対的なウイルス力価を決定するために、式を使用します。 </li></ol></li></ol> 3.伝達のドナー骨髄細胞<ol><li>骨髄（BM）収穫のためのドナーマウスを準備するには、最初の5％を合わせ補足の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔1L /分の酸素。応答性を評価するために足をつまみます。 注：（未満8週齢）ドナーマウス（8日、移植前に）5日前骨髄採取に準備する必要があります。一つのドナーマウスは、少なくとも2つの受信者のために十分な細胞を提供します。 </li><li>注入150ミリグラム/キログラム27 G×½ &quot;針を用いて麻酔したマウスにおける眼窩後部注射による5-フルオロウラシル（5-FU）。 注意！ 5-FUの抗癌化学療法剤。常に認定された化学ヒュームフードやダクトバイオセーフティキャビネット内の5-FUを処理します。 5-FUで処置したマウスの適切なラベル付けを決定するために、金融機関の実験室および動物安全委員会に相談してください。 <ol><li>その側に麻酔をかけたマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。 </li><li>内側眼角へと上向きにベベルと横針で出発し、45時に針を挿入します針が途中まで挿入され、内側方向、停止中の°の角度。ゆっくりと細胞を注入し、慎重に針を外してください。 注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。 </li><li>このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。 </li></ol></li><li>収穫骨髄5日（移植の3日前）、5-FU処置後。 <ol><li> 1L /分で酸素補給を組み合わせた5％の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔。応答性を評価するために足をつまみます。 </li><li>頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。毛皮が濡れになるまで、70％EtOHで寛大に噴霧することにより、マウスを滅菌します。 </li><li>解剖ハサミを使用して、皮膚に切開を行い、離れて足の筋肉から筋膜を分析。次に、ヒップで大腿骨と足首で脛骨を切断することによって、マウスから離れて足を解剖。 </li><li>ベンド「L」字型に脚部とは、解剖ハサミで膝関節で切断することにより、各脚の骨を分離します。 </li><li>各脚の骨の遠位端部に軟骨を除去するために、軟骨が解除されるまで、そっと足骨の一端に向かって筋肉をこすり取る際には、解剖ハサミを使用しています。 </li><li> 27 Gのx½インチの針と注射器を使用して、PBSと面一に各脚の骨は、50ミリリットルコニカルチューブに100μMのナイロン膜の上に、2％FBSを補充しました。骨まで洗浄骨が採取された細胞の数を最大化するためにホワイトになります。 </li><li>単一細胞懸濁液を得るために、50mLのコニカルチューブにナイロン膜を介して細胞をマッシュシリンジのプランジャーを使用します。他のマウスの足で繰り返します。 </li></ol></li><li> 400×gで10分間4℃で遠心し細胞と上清を捨てます。再懸濁BMを5mlの塩化アンモニウムカリウム（ACK）緩衝液中の赤血球を溶解します。氷上で10分間細胞をインキュベートします。 </li><li>細胞溶解を停止するためにPBSでチューブを埋めます。 Centri400×gで10分間、4℃でFUGE細胞と上清を捨てます。 BMペレットは、赤い色を持っている場合は溶解ステップを繰り返します。 </li><li> 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、血球計数器を用いてトリパンブルー排除によって細胞をカウントします。 </li><li> DMEM、20％FBS、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充含まれている2回プレstimのカクテルメートルあたり2×10 6個の細胞で細胞を再懸濁し、IL-3（14 ngの/ ml）を、IL-6（24 ngの/ミリリットル）、およびSCF（112 ngの/ mlで）。プレート6ウェルプレート中のウェルあたり2ミリリットル。 </li><li> 37℃で一晩細胞をインキュベートし、5％のCO 2。 </li><li>含む各ウェルBM細胞にウイルス上清の2ミリリットルを追加し、ポリブレン（/ミリリットル8μgの）を追加します。 1,500×gで90分間、30℃で回転プレートを一晩組織培養インキュベーターにプレートを戻します。 </li><li> 400×gで10分間、4℃でコニカルチューブと遠心分離機にピペット細胞懸濁液、プレートを破棄することはありません。 2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、ウェルあたりの新鮮な2×プレstimのカクテルとオリジナルのウェルに戻ります。 </李&gt; <li>ステップ3.7から3.9を繰り返して、2 番目のスピノキュレーションを実行します。 </li></ol>レシピエントマウスに4移植ドナー細胞<ol><li> BM細胞の注入前に致死量の全身照射&lt;24時間で移植用同系レシピエントマウスを準備します。 注 ：BALB / cマウスのための致死量の放射線照射は、一般的に800〜900センチグレイとC57B / 6 10 1,000-1,200 cGyです。用量は、典型的には少なくとも3-4時間間隔を空け照射の二つのセッションに分割されます。 </li><li>優しくコニカルチューブに上清をピペットでステップ3.11、6ウェルプレートから収穫形質導入されたドナー細胞から続きます。残留細胞を回収し、50mlコニカルチューブに追加する1mlのPBSで各ウェルを洗浄します。 </li><li>ウェルに0.05％トリプシンを0.5mlを加え、5分間組織培養インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li><li>ウェルに1ミリリットルのD10を追加し、穏やかにピペッティングすることにより、残りの細胞を剥離。それぞれのチューブに細胞を追加400×gで10分間4℃で遠心分離することによって、ステップ4.2およびペレットからの。 </li><li> 400×gで10分間4℃でPBSと遠心で細胞を洗浄します。 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、トリパンブルー排除により血球計数器を用いて細胞数を計測します。 注 ：ベクターは、GFPタグを有する場合には、フローサイトメーターを用いてGFP陽性細胞の割合を定量化します。 </li><li>マウスに注入するための100μlのPBS - 50で2×10 6細胞- 5×10 5を再懸濁します。 </li><li>滅菌27 Gのx½ &quot;針を用いて麻酔したマウスに眼窩後部注射を介して細胞を注入します。 注：他の注射技術は、尾静脈、脾臓、または大腿骨が含まれます。 <ol><li>応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を使用して、マウスを麻酔。 </li><li>その側にマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。 </li><li>傘を上に向けて、n個の挿入45°の角度で内側眼角に横eedle。 注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。 </li><li>このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。 注：次の移植マウスは、数週間のための低血球数を持っているので、感染しやすいでしょう。抗生物質または酸性水を用いて予防を使用することができます。 </li></ol></li><li>移植後1ヶ月、フローサイトメトリーによる生着したドナー細胞の指標として、末梢血中の％のGFPを測定します。 注：だけではGFPは細胞の移植の成功を決定することはできません。ウイルス形質導入に失敗した可能性があり、まだ生着が発生している可能性があります。この場合には、GFP +細胞が検出されないだろうが、移植細胞の生着が成功しました。 <ol><li>末梢血Bの10μLを取りますyの21 G×1½ &quot;シリンジで伏在足の静脈を穿刺し、血液凝固を防ぐために、PBS中の100mMのEDTAに追加します。 </li><li> 10分間氷上で血液と溶解に1ミリリットルACKを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li>上清を吸引し、真空フラスコ中とPBSは、溶解を停止するには、2％のFBSを補充した1ミリリットルを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li> 100μlのPBS中の真空フラスコ再懸濁ペレット中の上清を吸引し、2％FBSを補充しました。 </li><li>フローサイトメーターでサンプルを実行し、（SSC 対 FSCによって決定される）生細胞ゲート内30万イベントを収集し、GFP +およびGFPの割合を計算-セル9を 。 </li></ol></li><li>さらに1ヶ月の移植後に、疾患の進行を監視するために自動化された獣医の血液分析器18を使用して完全血球数（CBC）を行います。 注：％によって病気を監視し続けます毎月の末梢血とCBCでGFP。 </li><li>実験を終了するには、応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を用いてマウスを麻酔。組織病理学のための頸椎脱臼や収穫脾臓および骨髄によってマウスを生け贄に捧げます。 注：この実験の長さは主観的なものであると終了日は、予想される疾患の表現型に基づいて評価されるべきです。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、疾患のドライバーとしてCALRdel52変異を有する骨髄線維症への進行と本態性血小板血症のような疾患を再現するために、マウスに骨髄移植を実行する方法の詳細な説明を提供します。増加した血小板、巨核球の拡大、および骨髄線維症にCALRdel52結果を発現する細胞の移植の成功。骨髄移植は、多段階プロセスであるので、技術的なエラーは、目的の遺伝子、あるいはマウス?...

形質移植は、マウスにおける血液悪性腫瘍をモデル化するための有用な方法です。この技術は、バックBCR-ABL1の異所性発現が忠実にマウス1に慢性骨髄性白血病を再現できた最初の実証にまでさかのぼる骨髄性悪性疾患を研究するために特に有用となっています。この技術は、その後骨髄増殖性腫瘍（MPN）を変異させJAK2 V617FおよびMPL W515K / Lの広範な研究を促進してきました。 MPNは、成熟骨髄細胞と骨髄線維症の過剰産生を特徴とする血液悪性腫瘍のグループです。これらの疾患は、一般的にはJak2、MPL、またはCALRのいずれかで体細胞変異を獲得した造血幹細胞のクローン性増殖から生じます。形質移植JAK2 V617FおよびMPL W515K / Lモデルの展示真性多血と骨髄線維症2の臨床的特徴- 5 &lt;/ SUP&gt;。最近、カルレティキュリン変異MPNのマウスモデルはまた、形質移植法6で生成されています。これらのマウスは、増加した血小板、巨核球数の増加、および骨髄線維症本態性血小板血症のような疾患を発症します。一緒に、これらのモデルはMPNの分子病態だけでなく、前臨床設定において治療薬を開発し、研究するための能力への洞察を得る機会を提供していません。 この原稿はCALRdel52突然変異を中心とした形質導入移植方法論の詳細な説明を提供します。この技術は、変異体が照射同系のレシピエントマウスに構築物を発現するレトロウイルスで形質導入した骨髄細胞の移植を含みます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELL LINES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASMIDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoPak, also known as pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td>Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional &#947;-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20672</td>
			<td>Additional &#947;-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONSUMABLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-052-CI</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FU</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974061B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365809001</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction-transplantation mouse model of myeloproliferative neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

形質移植技術は、細胞は、目的の遺伝子を発現するレシピエントマウスの造血再構成をもたらします。 図1は、MPN変異したカルレティキュリンの導入-移植マウスモデルの概要を示しています。簡単に言えば、CALRwtまたはCALRdel52を発現しているレトロウイルスはC57B / 6ドナーマウスからのBM細胞を感染させるために使用されます。形質導入した細胞を照射C57B...

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Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.8K ビュー.  University of California, Irvine. This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation. 

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

がん研究

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

膵臓癌の正交性切除マウスモデル

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

要約

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膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

周辺照射による疲労のマウスモデル

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

散発性結腸直腸癌の遺伝子操作マウスモデル

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウスモデルにおける腫瘍生着

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウスモデル

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

膵臓癌の正交性切除マウスモデル

消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術

エクスビボマウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

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エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウスモデルにおける腫瘍生着

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウスモデル

エクスビボマウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル