Name: a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
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著者は、イメージングの彼女の寛大な支援のため、ルースZelkha、MSに感謝します。この研究は、ARD、国立眼研究所、NIH、および研究から失明防止への無制限の助成金からコアグラントEY01792への助成金R01のEY024349-01A1、MEに臨床サイエンティスト育成プログラム賞K12EY021475によってサポートされていました。 ARDは失明を防止するための研究からキャリア開発賞を受賞です。

動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。 1.動物の準備<ol><li> 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。麻酔が反映された後、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまみます。動物が反応してはなりません。 </li><li>以前の角膜損傷がないことを確認するために実験を行う前に、スリットランプの下で目を点検します。 </li><li>眼に1％塩酸テトラカインの低下を植え付けます。 60後 - 90秒、感覚がないことを確認するために、角膜反射をテストします。プロパラカイン塩酸塩0.5％を代わりに使用することができます。 </li><li>角膜感覚の損失がある場合特定の、静かに目にし、目の周りの毛に5％ポビドンヨードのドロップを置きます。 1分後にドロップを拭き取るか、ツールチップに干渉から髪を防止するために、目の周りの毛の上に広げました。 </li></ol> 2.角膜上皮擦過<ol><li>手術用手袋とガウンを着用してください。無菌回転バリと滅菌ピンセット：必要なツールを準備します。より良い制御のために、曲がったピンセットを使用しています。手順中に滅菌シート上のツールを配置します。 </li><li>曲がったピンセットを使用して、鼻側から蓋をつかみ、そっと目をproptosingことで目を安定させます。あまりにも多くの圧力を使用しないでください。 </li><li>手術用顕微鏡下で、二回滅菌回転バリを使用して、輪部領域の周囲360°を剃ります。ラウンドごとに6秒 - 5の速度で角膜輪部の周りに移動します。 注：バリが1固定速度を持っています。しかし、それは確立された速度で回転するために、「先端ナットは「完全に締めてください。 </li><li>回転バリで角膜輪部に角膜輪部から全体の角膜上皮を削除します。より良い結果を得るために、循環方式でツールを移動し、それが角膜表面に多少の並列先端の側面で動作するように保持します。上皮はすでに削除されていない再ブラッシング領域によって間質を傷つけないように注意してください。眼の上の任意の圧力を加えないでください。必要に応じてブラシの先端を清掃してください。 </li><li>角膜上の滅菌リン酸緩衝生理食塩水のドロップを植え付けると柔らかいクリーニングティッシュで任意の切り離された上皮シートを乾いた布で拭き取ってください。 </li><li>もしあれば、残りの上皮を剃ります。 </li><li>手術中にマウス尾に注意してください。 注：任意の動きが発生した場合、麻酔の深さが薄れており、さらなる注入が必要です。一次注入量の三分の二の三分の一は十分なものでなければなりません。麻酔薬で動物を過剰摂取しないでください。 </li><li>別の目でそれらを使用する前に、すべてのツールを滅菌します。 </li></ol> 3.完全な上皮削除の確認<ol><li>角膜に1mg / mlのフルオレセインナトリウムの低下を適用します。 30秒後に角膜をきれいにし、上皮の完全な除去を確認するために、コバルトブルーフィルターを用いて、顕微鏡下でそれを調べます。 注：上皮欠損と角膜の領域が緑色に可視化されます。 </li></ol> 4.ポスト操作のケア<ol><li>加熱毛布の上に動物を入れて、回復の下ながら（そのケージに、例えば ）安全な場所に保管してください。意識的なものの会社に無意識の動物を保管しないでください。 </li><li> 1％のエリスロマイシン眼軟膏を適用します。これはまた、眼の乾燥を防ぐことができます。アプリケーションに一週間のための抗生物質の日常を続けます。 </li><li>キロブプレノルフィン皮下処置後にし、再び12時間後/ 0.1ミリグラムを注入します。 2日間一日二回の注射を続けます。 </li><li>麻酔から完全に回復するまで、45分 - 30のための動物を観察します。 注意：回復の下ながら、腹面に呼吸筋の軽度の運動は、動物の健康を示しています。 </li></ol>

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	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. 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E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質11を使用する機種、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪?...

角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症1-6に取得しました。 LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 1前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。 回転バリが均等に根本的な間質1を傷つけることなく、上皮を除去する便利なツールです。創傷治癒研究において中心角膜びらん7,8を誘導するために使用されてきました。マウスでLSCDを作成するためにここに提示された技術は、以前に報告されていません。以前より回復Oで、不均一で傷害特に輪部と複数の変数の表現型1、9時鈍いスパチュラ結果と上皮を削る方法を導入F正常な角膜上皮1。鈍スクレーパと異なり、回転バリがよく7、8、10などの上皮基底膜を除去します。幹細胞を切断するための他の報告された方法は、下にある眼の構造への不要な損傷を引き起こすことができるだけでなく、有意な炎症およびその後の角膜の混濁またはにつながるだけでなく、水酸化ナトリウム、N-ヘプタノール、及び塩化ベンザルコニウムのような化学物質の使用を含みます上皮の扁平上皮化生11-15。回転バリは、これらの重篤な合併症に関連付けられていません。外科的に輪部上皮を除去し、単独で、または化学物質10、11、16を使用して、実行することがより困難であり、小さな目と（マウスなどの）薄い輪部上皮を有する動物における最良の選択肢ではありません。また、驚くべきことに、limbectomyはまだ10の背後にある輪部上皮の一部を残すことができます。 以下に記載された技術は、血管新生のANとLSCDになります患者における完全なLSCDの提示を模倣し、少なくとも3ヶ月1持続dはconjunctivalization。これは、マウスにおけるLSCDまたは創傷治癒の病態生理、免疫学、および潜在的な治療法を研究することを目指している人に適しています。おそらく、いくつかの修正を加えて、この手順は、ラットまたはウサギ10で行うことができます。回転バリが効率的に上皮を除去するように、角膜上皮摩耗/創傷および関連する治療または分子生物学的研究に関連する任意の研究に利用され得ます。

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。 以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。 回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。

この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それは?...

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K ビュー.  University of Illinois at Chicago. 次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。 

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

医学

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

発生生物学

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

神経科学

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

マウスの精密アルカリ熱傷のための修正生検パンチ法

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

著者スポットライト:角膜混濁の治療と再生の研究の進歩 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

視力の活性化:網膜変性症に対する幹細胞治療

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

著者スポットライト:視力回復の進歩-網膜疾患に対する幹細胞ベースの治療 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

要約

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免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

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免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹