凍結保存後32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製に技術支援を提供してくれたWei Sheng Tan氏、Luanne Chiang Xue Yen氏、Xinyi Lee氏、Yingying Chung氏に感謝します。この研究の一部は、National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017)およびNational Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)からH.G.T.への助成金によって支援されました。

in vivo実験は、SingHealthの動物管理および使用委員会(IACUC)および眼科および眼科研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明によって承認されたガイドラインとプロトコルに従って行われました。仔犬は、シクロスポリン(260 g / L)を含む飲料水を与えることにより、P17(移植前)からP30(移植後)までの免疫抑制を行いました。
1. 凍結保存後の32日目のヒトES細胞由来光受容体前駆細胞の調製
<ol><li>37°Cのウォーターバスで予熱した光受容体分化培地(PRDM)。</li>
	<li>液体窒素から32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞を含むクライオバイアルを回収します。ドライアイスの上に保管してください。</li>
	<li>クライオバイアルを37°Cのウォーターバスで3〜5分間解凍します。32日目の細胞を1 mLのPRDMに再懸濁し、130 x g で4分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を除去し、細胞を 1 mL の PRDM に再懸濁します。</li>
	<li>細胞計数のために10 μLの混合物を取り除きます。メーカーの指示に従って、0.2%トリパンブルーを使用して細胞を混合します。細胞混合物を細胞計数チャンバースライドにピペットで移します。自動セルカウンターで細胞数と生存率を決定します。</li>
	<li>細胞生存率が70%を超えたら次のステップに進みます。残りの細胞懸濁液を130 x g で4分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを3 x 105 細胞/μLの濃度でPRDMに再懸濁して移植します。</li>
	<li>目に見える細胞の塊を観察します。10 μLのピペットチップをマイクロチューブに入れて、目に見える細胞凝集が観察されなくなるまで、細胞凝集を繰り返し再懸濁します。33G注射シリンジに装填し、針を通して細胞溶液が押し出されるのを観察します。</li>
</ol>2. rd10 マウスにおけるヒトES細胞の網膜下送達
<ol><li>動物の準備<ol><li>腹腔内アプローチにより、27Gの針に取り付けられた1 mLのツベルクリン注射器でケタミン(20 mg / kg体重)とキシラジン(2 mg / kg体重)の組み合わせを使用して、マウス(P20、男性/女性、3〜6 g)を麻酔します。先制鎮痛薬としてマウスにブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を投与します。.</li>
		<li>麻酔後、瞳孔散大のために1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンをそれぞれ点滴します。角膜に眼科用ジェルを塗布して、目の乾燥や麻酔関連の白内障を防ぎます。</li>
		<li>完全に麻酔されるまでマウスを空のケージに入れます。肉球をつまんで適切な麻酔レベルを評価し、動物が強くつまんでも反応しないかどうかを確認します。</li>
		<li>マウスが完全に麻酔されたら、38°Cに設定された温かいパッドの上にマウスを置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の網膜下送達<ol><li>ここで行うように、1ポート経硝子体扁平部アプローチを使用するには、無菌環境で網膜下注射を実行します。直接光路を備えた直立手術用顕微鏡を使用して注入を行います。</li>
		<li>ニードルハブを取り外して、10 μLのガラスシリンジを準備します。33G鈍針をガラスシリンジに取り付けます。金属製のハブカバーを取り、針をシリンジに慎重に固定します。</li>
		<li>蒸留水で洗い流して、針の漏れや開存性の兆候がないか確認します。シリンジを空にして、慎重に横に置きます。</li>
		<li>麻酔をかけたマウスを枕の上に置き、治療眼を顕微鏡の対物レンズにまっすぐ見上げます。0.5%のプロパラカインの塩酸塩を加え、30秒待ちます。眼科用ジェル150μLを眼に塗布し、その上に丸いカバースリップを置きます。</li>
		<li>角膜、虹彩、瞳孔、水晶体、結膜を観察して、目の大まかな検査を行います。瞳孔を通して、焦点面を調整してマウスの眼底を視覚化します。視神経ヘッドが瞳孔の中心に配置されるまでヘッドを調整し、枕に適切に配置して頭の動きを最小限に抑えます。</li>
		<li>チューブの底部をhESCで複数回軽くたたいて、均一な細胞懸濁液を得ます。10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を使用して、2 μLの細胞/培地を回収します。注射の直前に細胞を抜いて、シリンジ内での細胞の沈降/凝集を防ぎます。</li>
		<li>30Gの使い捨て針を使用して、リンバスの後ろに2mmのところに硬化切除の傷を作ります。レンズに触れないように、針の角度を~45°に保ちます。針の先端が目に映ったら、針をそっと引き抜きます。針刺しによる怪我を防ぐために、使用後は針を鋭利なビンに捨ててください。</li>
		<li>ガラス注射器を取り、鈍い針を硬化切除術の傷口に挿入します。レンズに触れずに、鈍い針を進入創の反対側の網膜に達するまで進めます。出血を避けるために、注射領域に主要な網膜血管がないことを確認してください。.</li>
		<li>強膜の圧力分岐が見られるまで、網膜を静かに貫通します。針の鈍い端を強膜と平行に保ち、細胞が硝子体腔に漏れないようにします。</li>
		<li>2 μLの細胞懸濁液またはPRDM培地(コントロール)を、シリンジに穏やかな圧力を維持しながら、網膜下腔にゆっくりと注入します。注射が成功すると、目に見えるブレブ(すなわち、細胞懸濁液/培地が入った網膜の隆起)が注射部位に形成されるはずです。 注:注射中は、網膜の裂傷や針先の細胞の閉塞を避けるために、穏やかな圧力のみを使用する必要があります。</li>
		<li>ブレブを確認したら、細胞が落ち着くまで10秒待ちます。針を目からそっと引っ込めます。</li>
	</ol></li>
	<li>ブレブの術中光干渉断層撮影(OCT)スキャン(オプション)<ol><li>マウスの目の位置を調整し、頭をゆっくりと動かして顕微鏡下でブレブを視覚化します。頭をそっと持って位置を固定します。追加の瞳孔散大は必要ありません。カバースリップや目のジェルを剥がさないでください。それはblebを視覚化するための明確な光学媒体を与える。</li>
		<li>手術用顕微鏡に内蔵されているiOCT機能を使用して、術中OCTを行います。</li>
		<li>OCT画面の Cube(キューブ )オプションを押し、 矢印 ボタンを押してスキャン領域をブレブに配置します。 センタリングとフォーカス をスライドさせてOCTを調整し、最高のOCT品質を実現します。 Capture/Scan(キャプチャ/スキャン )を押して、ブレブ領域のOCTスキャンを取得します。画像を確認して、スキャンの品質を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>回復<ol><li>カバースリップをはがし、ガーゼで目からジェルをきれいにします。感染を防ぐために、注射後に抗生物質軟膏を1回塗布します。</li>
		<li>動物が胸骨臥位を維持してホームケージに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、温かい光の下で麻酔から回復するのを待ちます。注射後少なくとも3日間、炎症、感染、苦痛の兆候がないか動物を監視します。. 注意: 150Wのウォームライトは、動物ケージから少なくとも30cm離す必要があり、火傷をしないように注意する必要があります。</li>
		<li>ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)の皮下注射を8時間ごとに1日間、または獣医師の推奨に従って投与します。.目の炎症や感染が観察された場合は、獣医師に相談して適切な治療を受けてください。</li>
	</ol></li>
	<li>器具の洗浄と滅菌<ol><li>10 μLのガラスマイクロリットルシリンジと33Gの鈍い針を100%エタノールで10回洗い流します。シリンジを蒸留水で点滅させてエタノールを洗い流します。</li>
		<li>ガラスシリンジと針を分解します。シリンジを乾燥させて保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>

視力の活性化:網膜変性症に対する幹細胞治療

Hwee Goon Tayは、Alder Therapeutics ABの共同設立者です。他の著者は、競合する利害関係がないと宣言しています。

網膜下注射は、RPEおよび網膜疾患を治療するための細胞懸濁移植に使用されています23,25,26,27,28,31,40。このアプローチは、細胞移植や遺伝子治療のアプローチだけでなく、網膜疾患の新規治療化合物を評価するために?...

遺伝性の網膜疾患や加齢黄斑変性症は、視細胞の喪失や最終的には失明につながります。網膜光受容体は、光伝達(すなわち、光をニューロン信号に変換すること)に関与する特殊な細胞で構成される網膜の外側セグメント層です。桿体および錐体視細胞は、網膜色素層(RPE)1に隣接しています。細胞の損失を補うための光受容体細胞補充療法は、新しく発展している治療アプローチです。損傷した視細胞を修復するために、胚性幹細胞(ESC)2,3,4、人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来RPE細胞、網膜前駆細胞(RPC)4,5,6,7,8を使用しました。網膜下腔、網膜とRPEの間の閉鎖空間は、その近傍のために損傷した視細胞、RPE、およびミューラー細胞を置き換えるためにこれらの細胞を沈着させる魅力的な場所です9,10,11。
遺伝子治療や細胞治療は、前臨床試験において様々な網膜疾患に対する再生医療に網膜下腔を活用しています。これには、抗センスオリゴヌクレオチド療法12,13またはCRISPR/Cas9、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースの戦略14,15,16、材料の移植(RPEシート、網膜補綴物17,18,19)、分化幹細胞由来網膜オルガノイド20のいずれかの形での遺伝子または遺伝子編集ツールの機能コピーの送達が含まれます、21,22網膜およびRPE関連疾患を治療する。RPE65関連レーバー先天性黒内障(LCA)23,24、CNGA3連鎖色覚異常25、MERTK関連網膜色素変性症26、脈絡膜血症27,28,29,30を治療するための網膜下腔におけるhESC-RPE31を用いた臨床試験効果的なアプローチであることが証明されています。損傷部位付近に細胞を直接注入することで、適切な領域への細胞の沈降、シナプス統合、および最終的な視覚的改善の可能性が大幅に向上します。
ヒトおよび大型眼モデル(すなわち、ブタ32,33,34,35、ウサギ36,37,38,39,40、および非ヒト霊長類41,42,43)への網膜下注射が確立されていますが、マウスモデルへのそのような注射は、眼球のサイズと巨大さの制約のために依然として困難ですマウスの目44、45、46を占めるレンズ。しかし、遺伝子改変モデルは小動物でのみ容易に利用でき、大型動物(ウサギやヒト以外の霊長類)では入手できないため、マウスへの網膜下注射は、網膜遺伝性疾患の新しい治療法を検討するために注目を集めています。細胞またはAAVを網膜下腔に送達するために、3つの主要なアプローチ、すなわち経角膜経路、経強膜経路、および扁平部経路が使用されています(図2を参照)。経角膜および経強膜経路は、白内障形成、癒着、脈絡膜出血、および注射部位からの逆流に関連しています11,44,45,47,48,49。射出プロセスを直接可視化するパースプラナアプローチを採用し、顕微鏡下でリアルタイムに射出部位を把握することができます。
我々は最近、組換えヒト網膜特異的ラミニンアイソフォームLN523を用いて、ゼノフリーの化学的に定義された条件下でヒト胚性幹細胞(hESC)を光受容体前駆細胞に分化させる方法を記載した。LN523が網膜に存在することがわかったので、ヒト網膜の細胞外マトリックスニッチが in vitro で再現され、それによってヒトES細胞からの光受容体の分化をサポートできるという仮説を立てました36。シングルセルトランスクリプトーム解析により、コーンロッドホメオボックスとリフェリンを共発現する光受容体前駆細胞が32日後に生成されることが示されました。常染色体ヒト網膜色素変性症を模倣した網膜変性10(rd10)変異マウスモデルを用いて、ヒトES細胞由来光受容体前駆細胞32日目の生体内における有効性を評価し た。ヒトES細胞由来の視細胞前駆細胞を、視受容器の機能不全と変性が進行しているP20の rd10 マウスの網膜下腔に注入した36。ここでは、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と rd10 マウスの網膜下腔への送達に関する詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、AAV、細胞懸濁液、ペプチド、または化学物質をマウスの網膜下腔に投与するためにも使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

ヒト多能性幹細胞を用いた視細胞の再生は、進行期の遺伝性網膜疾患と老化性網膜疾患の両方を治療するための有望な治療法です。ヒト組換え網膜特異的ラミニンアイソフォームマトリックスは、ヒト胚性幹細胞(hESC)の視細胞前駆細胞への分化をサポートできることを示しました。さらに、これらの細胞の網膜下注射も、 rd10 げっ歯類およびウサギモデルで部分的な回復を示しています。網膜下注射は、標的空間に近いため、眼の視細胞および網膜色素上皮(RPE)層に医薬品化合物を送達するために使用されている確立された方法であることが知られています。また、網膜疾患を治療するために、アデノ随伴ウイルスベクターを網膜下腔に送達するためにも使用されています。マウスモデルにおける医薬品化合物および細胞の網膜下送達は、マウス眼球のサイズに制約があるため、困難である。このプロトコルは遺伝の網膜色素変性症の突然変異体、 rd10 マウスのこれらのセルの注入そして網膜の下配達技術のためのhESC得られた光受容体の祖先のセルの準備のための詳しいプロシージャを記述する。このアプローチにより、標的領域、特に視細胞変性につながる疾患が発生する網膜の外側の核層への細胞治療が可能になります。

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

著者スポットライト:視力回復の進歩-網膜疾患に対する幹細胞ベースの治療 

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

10 μL のガラスシリンジはメーカーの指示に従って組み立て(図 1)、細胞懸濁液/培地の送達に使用した鈍い針を 図 1B に示します。網膜下注射のさまざまなアプローチを 図2に示します。このプロトコルでは、pars planaアプローチについて説明します(図2C)。ガラス注射器に取り付けられた鈍い針は、硬化切?...

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我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10 マウスにおけるこれらの細胞の網膜下送達のための詳細なプロトコルについて記述する。

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

私の研究は、光受容体の変性を引き起こす網膜疾患の進行期に対する幹細胞ベースの治療法の開発に焦点を当てています。私たちの研究の目標は、患者の視細胞の喪失を臨床的に安全で機能的な視細胞前駆細胞に置き換え、視力を改善したり、視力を回復させたりすることです。主な前臨床モデルはマウスですが、眼球が小さいため、特に網膜下に材料を注入することは困難です。網膜下注射を成功させるためのスキルを身につけるには、忍耐と忍耐が必要です。我々は、32日で光受容体前駆細胞を作製できる受容体分化法用ラミニン塩基の開発に成功しました。げっ歯類におけるこの視細胞前駆細胞懸濁液の網膜下移植は、眼の穴と移植片の間のシナプス結合をもたらしました。これにより、部分的な視覚回復につながりました。私たちのアプローチはシンプルで、適切な視覚化は、外科医が関心のある領域に針を扱うのに役立ちます。

sub-retinal-delivery-human-embryonic-stem-cell-derived-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

669 ビュー.  Singapore Eye Research Institute. 私の研究は、光受容体の変性を引き起こす網膜疾患の進行期に対する幹細胞ベースの治療法の開発に焦点を当てています。私たちの研究の目標は、患者の視細胞の喪失を臨床的に安全で機能的な視細胞前駆細胞に置き換え、視力を改善したり、視力を回復させたりすることです。主な前臨床モデルはマウスですが、眼球が小さいため、特に網膜下に材料を注入すること?...

ビデオ: 著者スポットライト:視力回復の進歩-網膜疾患に対する幹細胞ベースの治療 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

医学

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

凍結保存された32日目のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の復活

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.