孝行長崎から実験支援;;失明を防ぐための研究本研究は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しています。 KJWはNIH助成5T32EY013933と5T32DK007647-20でサポートされています。 VBMは、NIHの助成金K08EY020530によってサポートされています。

1。網膜下注入用デバイスを組み立てる<ol><li>ガラス毛細管の直径100μmの針を購入したりします。これは、サッター、P-97ピペットプラーまたは他の類似の装置を使用して手動で行うことができます。それが所望の直径（100μm程度）に達するまで、キャピラリーチューブの端を加熱し、プルアップされます。直径の小さい針が遺伝子治療ベクターを使用することができますが、これは、細胞または目に損傷を与えることなく、細胞注入のための推奨径である。鋼針に比べ、ガラスキャピラリーニードルは網膜破損を引き起こすことなく、注射液および網膜下腔へのアクセスの可視化を可能にするために、非常に細かいですが、鈍先端を持っています。 70％エタノールを使用して必要に応じてこれらのプルアップ針をクリーニング後、滅菌容器に保管してください。所定の位置に針を保持するためにテープで15センチメートル滅菌組織培養皿は、注射針が覆われており、無菌環境を保つために1つの方法です。この時点で、COMPL手続きが行われる手術室の中にセットアップをETE。それは、この手順はバリア施設内で行われている場合は特に、無菌のままにするために、すべての回で手術室にすべての機器を維持するのが最も簡単です。 </li><li>注射針にシリコーンを吸引除去し、針の内壁に沿ってコーティングを残すためにシリコーンを取り出します。シリコーンコーティングは、特に内側のガラス毛細管壁を突き刺すような針の穴を介して細胞やウイルスの通過を最大化します。 </li><li> （チューブから針を取り除く）を直接針の後のポイントでルアーロックで設定した25¾ゲージ採血を切断することにより滅菌したプラスチックチューブの約8cmの長さを取得します。 </li><li>滅菌生理食塩水で1mlサブQ 26 5/8-gaugeスリップオンチップシリンジを記入し、注射器から針を外します。 </li><li>プラスチックチューブの切断端に注射針を取り付け、他にルアーロックにシリンジを取り付ける終わり。 </li><li>それが正しく漏れなくても接続されていることを確実にするために針を介していくつかの生理食塩水を取り出し、チューブやキャピラリーニードル内のデッドスペースを埋めるために滅菌生理食塩水を吸引します。次に、注射針の先端に、空気の小さい、約1μlの量を吸引除去する。これは、注入液から生理食塩水を分離し、外科手術中に注入流体の終わりを示す視覚的な手がかりを提供します。注入装置は外科手術の際に、70％エタノールで拭いてきれいな表面上に保持されるべきである。また、外科手術の際に使用されるすべての機器が既に滅菌、使用できる状態に保たれるべきである注射針の例外のために、70％エタノールで前と後の両方でクリーニングする必要があります。これらの針は、手術後の処分ではなく、再利用されるべきである。 </li><li>最後に、目的のパッケージ化された遺伝子治療ウイルスベクターまたは幹細胞を含む注射液を吸引除去する。これはによって行うことができますその後無菌細胞培養皿の表面に溶液をピペッティング、滅菌ピペットチップ内に注射液を取って。ソリューションは簡単にシリンジを用いて注射針内に吸引することができます。必要な量は、マウスの年齢によって異なります。私たちの目的のために、私たちは、注射液の0.5から0.8μlを注入することができる産後5日目のマウスを使用しています。少ない量、0.5μlの以下は、そのような1μlのように、若いマウスと多量に使用することができ成体マウスに使用することができます。細胞のウイルス力価または番号が注入されるウイルス/細胞およびそれらの所望の標的組織に基づいて決定する必要があり、少量のようにあまりにも多くのウイルス粒子または細胞が網膜細胞に対して毒性につながることができます。ビデオでは、可視化の目的のために、我々は、1.5μlの、眼の中に注入するのに必要以上の色素を多量に使用してきました。 </li></ol> 2。網膜下腔へのアクセス<ol><li>無菌手術室の中では、マウスの年齢によって異なりますが、ローカルで承認された動物取扱業者のプロトコルに従ってマウスを安定させるか、または麻酔。成体マウスのための一般的な麻酔はイソフルランガスまたは滅菌生理食塩水でケタミン（100 mg / ml）とキシラジン（20 mg / ml）を0.1 ml/10g体重の腹腔内注射の使用を含む。周産期のマウスの場合、一般的な麻酔技術はイソフルランガスまたはcryoanesthesia（低体温）の使用を含む。すべての麻酔技術は、使用前にお近くの動物実験委員会の承認を得なければならない。同様の技術はP0または成体マウスへの幼いマウスに適用することができますが、我々は一般的に、（P）は産後5日目のマウスを使用しています。外科的処置は、マウスが手足を動かすことがなくなるまで開始され、もはやピンチをつま先に応答しないことはできません。血液の流れが遅くなりますので、周産期のマウスのために、彼らは、彼らは麻酔下で完全であることを知ることに別のキーカラーで目立って軽くなるだろう。 </li><li>周産期のマウスでは、mにVannasまっすぐはさみを使用オーケ閉鎖蓋裂に沿って約1.5 mmの切開。目が自然に将来で開きますインデント、でカットするように注意してください。これは蓋を癒すとマウスの開発中に正常に開くことが保証されます。我々は、彼らがこの手順の間、目に穴をあけることのリスクを軽減するので、Vannasはさみを好むものの、外科ブレードは、この目的のために使用することができます。ビデオでは、はさみは眼瞼縁に沿って直接穿刺し、カットに使用されていました。このテクニックを学ぶときに、鉗子は、切断前にまぶたを持ち上げ、目を損傷する危険を軽減するために使用されるべきである。 </li><li>目をproptose、それは注射用proptosed保持するために眼の下にわずかにまぶたを挟まないように湾曲したドレッシング鉗子でまぶたを引き離す。ステップ2で作った蓋切開が大きすぎると、目蓋の下に逆戻りし、注入手順中に適切な露出を防ぐことができます。成体マウスでは、DRと目の周りのわずかな圧力を適用することディエッサー鉗子は、注射用proptosed目を保持することができます。 </li><li>小さな強膜における切開または15度のマイクロサージェリーの刃で表面を傷つけによって地球の赤道より後方を確認します。この切開は、注射針の先端を通過するのに十分なだけ大きいが、それよりも大きくなければならない。望ましい場合には、そのような鍼治療の針のような小さな、鋭い針ではなく、マイクロサージェリーブレードの網膜下腔にこの切開を作るために使用することができます。暗く着色された動物では、暗褐色の色素組織（脈絡膜·網膜色素上皮）は、切開した時点で見えるようになります。軽い色素沈着またはアルビノマウスでは、手術用マーキングペンは切開部位を示すインクスポットを残して顕微ブレードの先端に適用することができます。切開部位からクリア（硝子）流体還流した場合、ブレードがあまりにも深く置かれ、硝子体腔および治療ウイルスまたは細胞は注入時に硝子体内にスペースを入力することが入力されました。 visualizati用目的のために、我々は、ビデオのこのポイントへの切開を行った。それは、この場合の網膜下注入を完了することは可能ですが、注入流体の存在によって引き起こされる網膜剥離は完全にこのマウスで治癒しない場合があります。したがって、注意が注射前に網膜を通して眼としないの外表面部のみを切断するために注意しなければなりません。 </li><li>慎重に切開部位に注射針を挿入し、網膜下のスペースを入力するには、外側の目の壁に平行して進める。眼内外壁に近すぎたり深すぎて前進すると、誤った場所への注入を指示します。針が正しい場所にあるかどうかを理解する最良の方法は、技術を練習することです。軽く色素沈着またはアルビノマウスで練習すると、網膜下空間に精密かつ正確な注射を作るのを助けることができます。針と注射液が、これらの目の中で目に見えるであるためです。 </li><li>シリンジプランジャに軽い圧力を適用し、ある所望の流体のジン注入。針が正しく網膜下空間内に配置されている場合は、適度な背圧が感じられるだろう。針がガラス質内にある場合には、注入時の有意に低い背圧と潜在的にいくつかの流体の逆流があるでしょう。重要な背圧がある場合は、ゆっくりと針を取り外す前に、少なくともさらに15秒間の場所に針を保持します。これは、高眼圧が切開部位バックアウト注入ウイルスまたは細胞を還流するのではなく均一にすることができます。空気と生理食塩水の一部は、注入手順時に必要な圧力上昇に起因する網膜下腔に注入してもよい。ケアは、それは目から注入されたウイルスまたは細胞を洗い流すことができるので、空気又は生理食塩水を過剰に注入しないように注意するべきです。これは、網膜下腔に注入しすぎて流体の存在から永久網膜剥離を起こすことも可能です。可視化の目的のために、余分な染料と空気がint型に注入したビデオの中の網膜下腔をO。これは明らかに気泡が網膜下空間内に留まると硝子体の中に消えていませんどのようにあまりにも多くが注入されている場合、色素の一部が網膜下腔の裏にフラッシュされますどのように見られるが、することができます。これは、これらの注射は、眼の正しい場所にあるすべてだったことを強調するために使用されていたので、人は針が切開部位を入力する必要がありますどのように視覚化することができます。網膜下腔に全ての注射は、注射液の存在に起因する一時的な網膜剥離を起こす。注入手順が正しく完了している場合は、この一時的な網膜剥離はすべてのそれ以上の実験のために使用することができます24時間とマウスで治るでしょう。目は外科手術に起因する約1週間柔らかいままである可​​能性がありますので、二回目の注射は、この期間中は避けるべきである。 </li><li>新生児マウスについては、そっとふたの後ろと軌道に戻って目をプッシュするために湾曲したドレッシング鉗子を使用しています。それが役に立つかもしれませんウイルスが網膜下空間内で安定するよう、ゆっくりと、その軌道に戻って目を押したときに、それが切開部位からフラッシュされることがないようにするために分を待つ。手術後、25ゲージ針から無菌の生理食塩水に0.25％に希釈した0.5％の一滴ブピバカイン（marcaine）が注射部位に配置することができます。マウスは、網膜下手術後の苦痛の明白な徴候を示していないと長時間作用型外用鎮痛ブピバカインとしての使用は、過去3年間のための十分なされています。このような感染症、腫れ、またはマウスの通常の日常活動の低下など、マウスは常に苦痛の兆候を探すために外科手術後に監視する必要があります。これらが発生した場合は、獣医師に通知されるべきであり、このようなブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を、さらなる痛みの治療薬は、腹腔内注射として与えることができます。 </li><li>局所的に承認された動物の取り扱いプロトコルに従って麻酔からマウスを覚ます。マウスは加熱pに保たれるべきであるそれは麻酔から目覚めるように正常な体温を維持するための広告。手術は麻酔を受けるために、マウスのための時間をカウントしない、完了するまでに5分未満を取る必要があります。したがって、加熱パッドは、実際の手順の実行中に必要ないのですが、手続きは時間の長い期間を取ることができるように1つのテクニックを学習している間必要になることがあります。それは自分自身で移動し始めているまで、マウスはクリーンケージに戻されるべきではない。新生児については、穏やかなつま先のピンチは完全に麻酔から回復するために彼らのために役立ちます、そして、彼らは母親と一緒に戻って配置される前に、そのピンクの色と動きを取り戻す必要があります。以前に記載されているマウスは、苦痛の形跡がないかを経時的にモニターする必要があります。 </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このビデオ技術は、正常に網膜下注入外科手術を完了し、遺伝子治療ベクター又は幹細胞を効率的に眼疾患を治療するために必要な場所に配置されていることを確実にする手順について説明します。それはこれらの細胞の周辺に遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織を置くので、この技術は、そのようなRPEまたは光受容体として網膜細胞のターゲティングを可能にします。従来の方法?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 0.8から1.10 x 100 mmのキャピラリチューブ（ガラス） </td><td>キンブルグラス株式会社</td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td><td>サター·インストゥルメント</td><td> P-97 </td><td>ナリシゲマイクロフォージを代わりに使用できます。カタログ＃MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> SL2-25ML </td><td>シリコーン</td></tr><tr><td> Dubeccoのリン酸、塩化カルシウム、塩化マグネシウムと緩衝生理食塩水</td><td> GIBCO-Invitrogen社</td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td>安全ロク3/4G 25×12 &quot;、血のコレクションセット</td><td> BDバキュテイナー</td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1ミリリットルサブQ 265/8Gスリップチップシリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5から10μlのフィンピペットIIの可変ボリュームピペッター</td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1から200μlのナチュラル面取りヒント</td><td>米国サイエンティフィック株式会社</td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8ステレオ顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60ミリメートル×15 mmのスタイル処理されたポリスチレン細胞培養皿</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannasストレートはさみ</td><td>シュトルツ眼科</td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td>繊細な鋸歯を有する湾曲したドレッシング鉗子</td><td>シュトルツ眼科</td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15度マイクロサーナイフ</td><td> Wils眼科株式会社に</td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td> Ketaset III </td><td> NADA＃45から290 </td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド研究所</td><td> NADA＃139から236 </td><td></td></tr><tr><td>ブピバカイン（Marcaine） </td><td>アストラゼネカ</td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

失明は、米国で約340万人に影響を与え、今後数年間で増加すると予想される。最近1、遺伝子治療や幹細胞移植は、網膜変性疾患に起因する失明を治療するための重要な治療手段となっています。そのような虹彩色素上皮細胞移植などの加齢黄斑変性症（AMD）に対する自家移植のいくつかの形態、有望な結果を生成しており、ヒトでの臨床試験は、遺伝子や幹細胞治療の他の形態のために始めている。2これらはRPE65遺伝子の交換を含むレーバー先天性黒内障とスタルガルト病で、ヒト胚性幹（ES）細胞を用いたRPE細胞移植患者における治療3-4現在の遺伝子治療ベクター及び網膜疾患患者の治療に利用できる幹細胞が存在すること、それは確認することが重要である適用する前に、動物モデルにおいて、これらの潜在的な治療法ヒトでの研究でそれらをING。マウスは眼の遺伝子治療用ベクターと幹細胞移植の治療効果をテストするための重要な科学的なモデルとなっている。このビデオの記事では5月8日 、私たちは、網膜下腔への遺伝子治療ベクター又は幹細胞を注入する手法を提示マウス眼周囲組織への損傷を最小限に抑えることができます。

マウス眼の描画は硝子体内注射し、網膜下の両方の外科的処置（矢印、 図1）の場所を表示する矢印で、参考のために標識された主要な構造体で示されています。そのようなlacZのレンチウイルスベクター（ 図2）のような遺伝子治療ベクターは、これらの場所を使用して注入することができる。さらに、このようなマウス胚性幹細胞（ 図3）などの...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K ビュー.  Columbia University. この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。

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High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

医学

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

がんの生産と活性酸素種の検出（ROS）

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

MACSの精製された感光体前駆体細胞の成人マウス・レチナへの副腎移植

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...