ここで説明する呼吸器病原体アッセイの作業はコーネルアニマルヘルス診断センター内部開発資金によってサポートされていました。ナノスケールのPCRワークフローと関連する品質保証システムの開発は、部分的に（FOA PA-13から244）資金を提供し、助成金番号1U18FD005144-下に食品医薬品局（FDA）の獣医研究所調査・対応ネットワーク（FDA獣医-LIRN）と共同で実施しました01。出版料はVWRとクアンタBiosciences社が主催しました。私たちは、書き込みやプロトコルの見直しとその支援のためにガブリエル・ニッカーソン、Roopa Venugopalan、Veldinaカモ、XiuLin張、Jinzhiゆう、Weihua王、およびカトリーナウォーカーに感謝します。私たちは、作者のインタビューを撮影するためのマイク・キャロルに感謝します。我々は最終的に彼らの役に立つコメントのためのエディタと3匿名の査読をお願いいたします。

<ol>
	<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform.">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).</li><li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform.">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li><li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+screening+for+blood-borne+viral,+bacterial,+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform.">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li><li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR.">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li><li>Dreier, J., St&#246;rmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays.">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li><li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy.">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li><li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomics+of+emerging+pathogens.">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li><li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis.">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li><li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory,+a+Model+for+the+One+Health+Initiative.">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li><li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+of+Ticks:+The+Rule+Rather+Than+the+Exception.">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).</li></ol>

マーシャ・スレーターとエレンオルテンベルクは、この記事で使用する試薬および器具を生産サーモフィッシャーサイエンティフィック社の従業員です。

この手順は、6ヶ月（週2~3回）にわたって我々の研究室での呼吸器病原体のルーチン試験に使用されてきました。また、個別にカスタマイズされたプレート上の糞便サンプルおよび細菌分離株における腸管病原体プロファイリングのために同じ手順を使用して成功を収めています。プレートが生産されると、経験豊富なスタッフが一つの標準勤務時間内の2-7のステップを完了することができます。最も重要なステップは、プリアンププレート、（蒸発を防ぐために迅速に行わなければなりません）プレート間の前置サンプルの転送、および増幅プレートの最終的なカバーの適切なシールです。それが大幅にこのプロセスに必要な時間や事務処理の量を減少させたとして結果の分析（サンプルおよびコントロールの曲線をチェックする）ためのガイドとして、マクロのスプレッドシートを使用することも重要でした。提供マクロスプレッドシートは一例です。それは、異なる構成を有する板のために修正または再作成する必要があります。これは簡単にPEすることができます基本的なスプレッドシートの知識を持つ誰かによってrformed。 増幅板（33 NL）上にロードしたサンプルの非常に少量に、前増幅が必要とされます。このプロトコル（図示せず）の最適化では、増幅前にマスターミックス、ランダムプライマーの添加、サイクル数、アニール時間、および希釈を含む前置増幅パラメータの数を比較しました。各ターゲットは独自の最適な条件を持っていて、ここに記載されているものは、私たちのパネルの全体的な検出の最高の限界をもたらしたものを表します。このパネルには、ルーチン獣医の診断テストで検出された病原性ターゲットとサンプルタイプの広い範囲をカバーしていますが、プリアンプ手順への変更は、異なるパネルのために必要になることがあります。製造者に最適化された増幅条件は、95℃、アンでの変性、続いて95℃の酵素活性化で10分間で標準プローブベースのリアルタイムPCRプロトコルに基づいています60℃でのイーリング/エクステンション。プライマーおよびプローブはまた、メーカーに最適化された条件、したがって、滴定を必要としないを使用して、プレート上に予め印刷されています。 （関係なく、ターゲットのタイプの）全ての試料について、逆転写および予備増幅工程を組み合わせることで、ワークフローの効率を維持するために必要でした。全てのサンプルが逆転写し持つことも、感度を最大化するために有益です。さらに、阻害剤を最小限に抑えるために最適化されたプリアンプ用マスターミックスの使用は、同じプレート上の異なるサンプルタイプを組み合わせることで汎用性を可能にします。 シュウらによって記載された疾病管理センター（CDC）インフルエンザマトリックスアッセイ。7およびナノリットルスケールの反応のためにここに適合した人間とコンパニオンアニマルからサンプルをテストするのに適しているアッセイ普遍的なインフルエンザです。これは、マイクロリットルスケールのレアを使用して、すべてのA型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子の普遍的検出のために設計されましたctions。これは、CDCヒトインフルエンザウイルスパネルとCDC豚インフルエンザパネルの一部として世界中で使用されています。ここで適応EHV-1アッセイ8は、流産や神経疾患（Pusterlaとハッセー10によってレビュー）を引き起こす可能性があります馬の重要な呼吸器病原体を検出します。種に依存しない内部対照とのハイスループットプラットフォームにこれらのテストを適応の重要性は、それらがOneHealth監視手法に組み込むことができることです。高スループットのテストプラットフォーム上でこれらのアッセイの両方を持つことは、臨床施設、避難所、およびパフォーマンスイベントのための緊急事態への準備を容易にするであろう。 上記の結果は、分析的な性能にかなり多くの変動を示したマイコプラズマカニクイザルを除いて、プレート上のすべてのターゲットの代表でした。これは、理想的には58〜60となるべきであるプライマーの次善の融解温度（T m）に思われました＃176; C（理想的なプローブのTmは、68から70℃です）。このプラットフォームの制限は、それが迅速に配列を変更する能力を制限する個々のプローブを、注文の場合よりもプレートの設計、製造に時間がかかることです。一般に、リアルタイムPCRの他の制限は、新規または予期しない病原体を検出することができないことです。これは、複数の種における配列に一致するアッセイを設計することによってある程度克服することができますが、公平な全ゲノムシーケンシングベースの方法論は、新規薬剤の発見のために、より適しています。11,12 ナノスケールのリアルタイムPCRは、シンドロームベースではなく、高スループット分子診断における試薬や人件費を低減するために有用である種ベースのテストのための新しいパラダイムを可能にします。このアプローチによる大規模なパネルテストは、ダンとGurfield 13とMoutailler ら 14に記載されているようなOneHealthサーベイランスを容易にすることができます。初期のスワブサンプルの収集、一般的に臨床的発症の3日以内に、呼吸器病原体の存在を同定するための最良の機会を提供します。感染症の出現は、多くの場合、予測不可能であり、および試薬の変更を必要とすることなく、異なる種に対して実行できるテストは準備のために理想的です。この技術の将来のアプリケーションはpathotyping、抗菌薬耐性プロファイリング、さらにシンドロームベースの臨床診断のパネルにある可能性が高いです。ナノスケールリアルタイムPCRは、複数のサンプルの病原体タイプの迅速、ハイスループットスクリーニングのために最も有用であり、新しく出現する病原体を同定するための公平なまたは部分的にバイアスされたシークエンシングに基づくアプローチによって補完されます。

単一疾患のためにテストされている多数のサンプルに使用しない限り、ヒトおよび動物のための臨床診断における複数のエージェントの迅速かつ包括的に検出するための需要が、病原体検出のための単一の生物の分子診断方法は厄介です。獣医学的文脈では、ハイスループット診断方法が原因種の多種多様な病原体をカバーするための追加の必要性に特に重要です。食品媒介性疾患の管理や新興病原体サーベイランスのために近づくOneHealth細菌、ウイルス（DNAまたはRNAベース）、寄生虫、および真菌の数を含むテストのニーズの一例です。テスト効率を向上させるために一緒に複数の検体（多重化）のためのテストを組み合わせることへの挑戦は、感度の損失の可能性と最適化およびアッセイの検証のための大きな負担となっています。 ナノリットルスケールリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を変更であります多くの別々の反応は、同じ試料1上で同時に実行することを可能にする多重化の実施にネイティブ。 OpenArrayプラットフォームは、この原則2のアプリケーションです。それは、リアルタイムPCRとマイクロアレイ技術を兼ね備えています。空間多重化の概念に基づいて、すべてのサンプルは、貫通孔別個で多数のターゲットのために試験されます。このプラットフォームは、最初はシアニン系の二本鎖DNA結合化学2を使用し、暗い消光プローブ3を用いて、プローブベースの化学的性質のために利用できるようになりましたました。このプラットフォームは、主に人間4及び動物5に遺伝的プロファイリングに使用されています。最近、Grigorenko らによって血液由来DNA及びRNAの病原体を検出するように適合された。6二段階の逆転写/プレ増幅（プリアンプ）の手順を使用して。 ここでは、呼吸秒で病原体の両方のタイプを検出するためのワンステッププリアンプベースの手順を説明しますretionsと標準勤務時間内で完全に行うことができ、他の様々なサンプルタイプ。ワンステップのプリアンプが完了すると、サンプルは、このナノスケールPCRプラットフォームに付属の自動液体ハンドリングシステムによって受け入れられるフォーマットで384ウェルプレートに移します。システムは、一度に最大4枚のプレート（192検体およびコントロール）の表面を横切ってマスターミックスとサンプルを描画します。このロード処理の後、我々はサンプルが増幅され、1枚のプリントページに収まるの表に、各サンプル/ターゲットの組み合わせの3技術的反復の平均をまとめたマクロスプレッドシートを用いて分析する方法について説明します。 このプラットフォームを使用したサンプルから抽出したDNAおよび/またはRNAを分析するための統一された方法を確立しました。サンプルの多種多様なエラーの可能性を最小限に抑え、逆転写され、抽出された96ウェルフォーマットで事前に増幅しました。テストした呼吸サンプルは鼻腔スワブ、深い咽頭スワブを含め、トランス気管洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺組織。試験された薬剤のいくつかはまた、末梢血または糞便中に存在することができるので、我々は、プロシージャに、サンプルのこれらのタイプを組み込みました。この合理化されたワークフローは、個々のテストの代わりにパネルベースの病原体や毒素遺伝子の検出によって、効率的なテストを可能にすることによって、複数のプレートで実験を実行するに比べて時間とリソースを節約するのに役立ちます。ここで実証した呼吸器パネルは18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、スルーホール三重に印刷されていました。検出されたウマの病原体は、ウマアデノウイルス1及び2、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ鼻炎ウイルスA及びB、ウマヘルペスウイルス（EHV）タイプ1及び4、及びストレプトコッカス・エクイを含んでいました 。イヌの病原体は、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、 気管支敗血症菌、およびマイコプラズマカニクイザルが含まれていました 。 Aユニバーサルインフルエンザアッセイおよび内部統制（MS2 RNAファージ）も含まれていました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:227px;">Zap-OGlobin II lytic reagent</td>
			<td style="width:239px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">7546138</td>
			<td style="width:167px;">Optional reagent for preparing blood samples.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:227px;">Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">AM1840</td>
			<td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix )</td>
			<td style="width:239px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">95134-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gene-specific primer pool</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom order</td>
			<td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">Random primer mix</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1330S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:227px;">Standard 96-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:227px;">Amplification master mix (OpenArray master mix)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4462164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Clear adhesive seal</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">430611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Foil seal</td>
			<td style="width:239px;">Excel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">384-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4406947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4470813</td>
			<td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:30px;width:227px;">Accessories kit</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4469576</td>
			<td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">AccuFill tips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4471090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457243</td>
			<td>This is purchased with the amplification machine.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:227px;">Primer design software (Primer Express)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4363991</td>
			<td>See manufacturer&#39;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:227px;">Image analysis program (ImageJ)</td>
			<td style="width:239px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spreadsheet program (Excel)</td>
			<td style="width:239px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PCR plate spinner</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89184-608</td>
			<td>This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">TE buffer</td>
			<td style="width:239px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8890-100ML</td>
			<td>10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DMEM</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tissue disruptor (TissueLyser II)</td>
			<td style="width:239px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Conventional thermal cycler (Veriti)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

ナノリットルスケールリアルタイムPCRは、複数のアッセイが一緒に反応を組み合わせた一般的な欠点がない単一のプレート上で並行して実行できるように空間多重化を使用します。私たちは、急速に急性呼吸器疾患でイヌやウマの一般的な疾患の薬剤の存在を同定するために、この原理に基づいてパネルを設計し、評価しました。この原稿は、マイクロリットルスケールの反応とは異なる手順に焦点を当て、サンプル調製、増幅、および標的病原体配列の分析のためのナノスケール診断PCRワークフローを記載しています。提示呼吸パネルでは、18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、三重に設定しました。ユニバーサル抽出および増幅前のワークフローは、複数の行列及びDNAとRNAベースの病原体を収容するためにハイスループット試料調製のために最適化しました。代表的なデータを1つのRNAターゲット（インフルエンザマトリックス）と1つのDNA標的（ウマヘルペスウイルスのために提示されています1）。迅速かつ正確に病原体の包括的、シンドロームベースのグループをテストする能力は、診断テストの効率性と人間工学を改善するため、および急性呼吸器疾患の診断と管理のための貴重なツールです。

結果は、ポジティブコントロールルーチン診断試験のために提出臨床サンプルの組み合わせによる代表的なRNAアッセイ（インフルエンザマトリックス）とDNAアッセイ（EHV-1）のために、図1および図 2に示されています。この典型的な反応を通じて放出された蛍光シグナルは、1サイクル当たりの生の蛍光値をプロットし、図1に示されています。すべての相対サイクル閾値（Ct）値は、自動的に増幅マシンソフトウェアによって生成されました。バックグラウンド蛍光は、Ct値を計算する前に蛍光読み取りに組み込むのではなく、負荷品質の評価のための別個の測定基準として使用しました。 各ターゲットの検出（LOD）の分析限界は95％の検出レベルでのCt値の全体平均値プラスのコントロールのプールで2標準偏差に基づいて算出しました。すべてのターゲット。複製の少なくとも95％が代表的なアッセイのために陽性であった最高希釈は50コピーでした。 5コピーの検出は、複製の50％に成功しました。どちらのアッセイは、以下の1コピーで検出されました。 RNAおよびDNA分析のためのLODは、21.92と20.05のCt値で計算しました。これらの値は、疑わしい対として正の（潜在的にではない反復）の報告値のカットオフであると考えられました。 ターゲットの分析的性能の他の側面は、3つの異なる日（ 図2）で実行プール陽性対照の連続希釈を用いて評価しました。代表的なRNAとDNAのアッセイの平均効率は101.1パーセントと106.6パーセントでした。すべてのターゲットの全体の平均効率は101.3パーセントでした。アッセイはまた、良好な直線性（R 2&gt; 0.98）を有していました。複製中の変動はスルーホール一般的に、臨床サンプルについての0.2の標準偏差内でしたDコントロール。標的のいずれかとの間の交差反応性は観察されませんでした。 補足ファイル内の最終結果のワークシートは、10臨床診断サンプルおよび4を制御するための代表的な定量的な結果を示しています。臨床サンプルは日常鼻/口咽頭スワブ、肺組織、および糞便サンプルを含む試験した試料の種類のサブセットです。このセット内の1つ（馬）糞便サンプルは、サンプル中の阻害剤の存在を示して失敗したMS2内部統制を、示しています。これは、典型的に溶出された試料および/または再抽出の希釈によって管理されています。ここでそうであるように、負の増幅制御は、すべてのターゲットに対して否定的であるべきであり、負の抽出制御は、内部コントロールが含まれている必要があります。臨床セットでは、サンプルがbetacoronavirus、 気管支敗血症菌 、イヌジステンパーウイルスA、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、およびインフルエンザのためのCt値を生成しA. <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 図1増幅プロット。蛍光読み取りはRNAアッセイ（A）およびDNAアッセイ（B）用の増幅サイクルに対してプロットされています。三角形はCt値を表す示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 図2.標準曲線を3つの異なる日に試験したRNAおよびDNAアッセイの標準曲線は、ポジティブコントロールを使用して、増幅の直線範囲を示すためにプロットされています。 RNA（A）又はDNAのコピー数のサイクル閾値（Ct）値は対数に対してプロットされている（10）（ <strong&gt; B）標準。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 増幅プレート及びターゲット位置の表1に概略図。このプラットフォーム上でナノスケールのリアルタイムPCR試験のために使用したプレートは、顕微鏡スライドのサイズであり、貫通孔64の48サブアレイに配置され、貫通孔3,072の合計個々の反応のために。一つのサブアレイは三連で18ターゲットに、ここに示されています。各試料は、液体ハンドラーずつサブアレイに添加されます。プレートは、表面張力を介して貫通孔内の試薬を保持するために親水性および疎水性化合物で被覆されています。ステンレス鋼チップは3,072マイクロ加工、320ミクロンdiameteの直線アレイを形成するために、「フォトリソグラフィパターン化およびウェットエッチングでありますrを次のようにターゲットのための33ナノリットルの穴それぞれ「2略語は次のとおりです。BCOR、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）; BORD、 気管支敗血症菌 CAV、イヌアデノウイルス; CPIV、イヌパラインフルエンザウイルス; CPNV、イヌニューモ; DISTA / B、イヌを。ジステンパーウイルスA及びB; EADV1 / 2、ウマアデノウイルス1/2; EAV、ウマ動脈炎ウイルス; EHV1 / 4、ウマヘルペスウイルスタイプ1/4; ERVA / B、ウマ鼻炎ウイルスA / B; IVM、インフルエンザマトリックス; MCYNOS、 マイコプラズマカニクイザル 、MS2、内部統制（MS2 RNAファージ）; SEQU、 ストレプトコッカス・エクイ 。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 表2プレート伝達マップ 384ウェルプレートの96ウェルプリアンププレートから転送するために、固定の8チャンネルピペットを使用するための色分けされたプレート転送マップが示されています。あるいは、調節可能なピペットを使用してもよいです。同じ手順にかかわらず時間のたびに実行されます<html> OW多くのサンプルをプレートにあります。 <img alt="補足ファイル" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 補足ファイル。サマリーテーブルに結果をフォーマットするための2つのマクロを含むマクロ有効スプレッドシートファイルは、（プロトコールに記載されているように）が設けられています。マクロによって生成される典型的な結果表は（最終結果の下の）ファイルに含まれています。 2のマクロは、（48サンプルまで）最初の列のサンプル名と肯定的な結果とのそれらのため、各ターゲットのための3つのCt値の平均を記入します。増幅しなかったターゲットがこの表に空白表示されていることに注意してください。これは、簡単に用紙1枚に印刷され、効率的に生データを確認するための基準として使用することができます。最終的な結果]タブでは、10の臨床サンプルおよび4のコントロールのための代表的な結果が示されています。アッセイ名の略語は、 表1の凡例に記載されています。www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR at JoVE.com

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center. ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。 

ビデオ: High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

要約

さらに動画を探す

この動画の章

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

カテゴリの検出細菌性病原体のための"生物発光"レポーターファージ

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立

ハイスループット遺伝子タギングで

のジェノタイピング

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

要約

さらに動画を探す

この動画の章

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

カテゴリの検出細菌性病原体のための"生物発光"レポーターファージ

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立

ハイスループット遺伝子タギングで

のジェノタイピング

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属