M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

研究倫理の声明：本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、南カリフォルニア制度動物実験委員会（IACUC）の大学によって承認され、研究室の評価および認定協会からの国民健康ガイドラインの研究所や勧告に厳密に従って行きましたアニマルケア国際。 1.齧歯類の脳の単離と免疫染色のための準備 1日目： <ol><li>連続深いイソフルラン麻酔（4％）の下で（12ヶ月齢）エージングTgF344-ADラット（14ヶ月齢）またはAPP / PS1マウスを置きます。つま先のピンチと引っ込め反射の欠如によって麻酔の深さを評価します。 </li><li>胸郭の両側を切断し、心臓を露出するように持ち上げます。心臓の左心室に23 G針を挿入し、右心房に小さな切開を行います。氷冷リン酸緩衝生理食塩水でtranscardial灌流によって放血に進みます（PBS）蠕動ポンプ（マウス用の30ミリリットル、150 - ラットでは200ミリリットル）を使用。 </li><li>皮膚に尾側正中切開を行い、脇の皮膚や筋肉を動かします。正中線に沿って頭蓋骨の上部を通過し、目の間にカットします。骨プレートを取り外して、頭蓋骨から脳全体を隔離します。 </li><li>冠状齧歯類の脳マトリックス中に脳を置き、四半期にそれをスライス。 4℃でパラホルムアルデヒド固定液（PBS中の4％PFA）で後部四半期O / N（16時間）インキュベートします。その後、洗浄PBSで3倍、および70％エタノールに移します。注意：PFAは毒性があり、適切な個人保護装置を有する化学フードの下で処理する必要があります。 </li></ol> 2日目： <ol start="5"><li>カセットを埋め込むに脳の四半期を置き、次第に順次より濃縮1時間エタノール浴中の組織（70％、80％、95％、および100％×3）を脱水。 </li><li> 3つの連続した100％のキシレン浴（1時間毎）で組織から明らかエタノール。注意：キシレンは、毒性およびSHであります適切な個人保護装置を有する化学フードの下に扱うことウルド。 </li><li> 2溶融パラフィンワックス槽後のパラフィンブロックに埋め込む組織（56から58°C、90分ごと）。 </li></ol> 3日目： <ol start="8"><li>ミクロトームを用いてパラフィン包埋脳の10μmの厚さの切片をカット。ディップセクション水浴（1分間50°C）へとスライドを顕微鏡に適用されます。スライドに組織接着性を確保、O / Nを乾燥させるためにスライドを残します。 </li></ol> 2.免疫染色注：抗体の異なる組み合わせは、後述する染色手順のために利用することができます。ラットおよびマウスの脳組織と適合する抗体カクテルは、 表1に記載されています。 4日目： <ol><li> 2×100％キシレン浴（12分毎）を用いて脱パラフィン脳切片。 </li><li>連続エタノール浴中で脳切片を再水和 - 100％10分間、5分間、95％、10分間、80％、および15分間、最後に70％ - followe3倍PBS洗浄[光攪拌しながら室温で5分、]により、D。一方、95への熱の抗原回復溶液 - 磁気攪拌棒でホットプレート上で97°C。 </li><li> 30分間97°C - 95での抗原回復溶液に脳切片をインキュベートします。その後、PBSで3回洗浄（光攪拌しながら室温で5分間、）。 </li><li>組織の乾燥を避けるため、および疎水性バリアペンで組織領域の周りに疎水性の障壁を描画するために繊細なタスクワイパーを使って素早く乾燥スライド。ブロッキング緩衝液で囲まれた組織領域を埋める[PBS 0.3％トリトンX-100および10％正常ロバ血清（NDS）を含む]、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。 </li><li>単核食細胞を標識し、加湿チャンバー内で4℃でO / Nインキュベートし（ブロッキング緩衝液で希釈）IBA1一次抗体でブロッキング緩衝液交換してください。抗体のホストと作業希釈液については、 表1および材料の表を参照してください。 </li></ol> 5日目： <ol start="6"><li>リンス3倍PBS風呂で一次抗体（光攪拌しながら室温で5分）。 3倍PBS浴場（光攪拌しながら室温で5分間）に続いて（暗所で室温でブロッキング緩衝液中で）1時間（594 nm放射蛍光団と結合した）蛍光二次抗体とインキュベートします。このとき、蛍光シグナルの漂白を避けるために、暗闇の中でセクションを維持します。 </li></ol> DAY 6から7： <ol start="7"><li>繰り返しは、ファゴリソソームを標識するCD68（ラット脳）またはLAMP1（マウス組織）抗体および（488nmの発光蛍光体で結合された）適切な二次抗体を用いて2.5＆2.6を繰り返します。 </li></ol> DAY 7から8： <ol start="8"><li>繰り返しは、Aβ沈着を標識する（647 nmの蛍光団に結合された）OC（ラット組織）または4G8（マウスの脳）抗体および適切な二次抗体と2.5＆2.6繰り返します。 注：また、6E10抗体は、マウスおよびラット組織で正常に両方を使用することができます。適切な抗体の組み合わせについては、 材料の表を参照してください。 </str&gt;オング。 </li><li>セクションでは、暗所で室温で完全に乾燥O / Nすることを可能にします。その後、DAPIを含む蛍光マウント媒体によって封止されたカバースリップで標本をカバーしています。 </li></ol>大Zスタック共焦点データセットの3買収注：このプロトコルは、60X対物レンズと405 nmの、488 nmの、594 nmの、および647 nmのレーザーを搭載した完全に自動化されたレーザー走査型共焦点顕微鏡を必要とします。すべての装置は、画像及びレーザ制御ソフトウェアで制御するコンピュータです。撮影プロトコル、コンピュータの電源をオン、落射蛍光ランプ、顕微鏡、レーザーとカメラを開始する前に。 DAY 9： <ol><li> 60X顕微鏡の対物レンズを選択します。レンズにイマージョンオイルを追加し、顕微鏡ステージのスライドホルダーにサンプルを配置します。オイルがスライドに接触するまで目的を上げます。接眼レンズを通して落射照明を使用して、海馬や大脳皮質におけるアミロイド斑を見つけるために焦点面を調整します。 </li><li>共焦点イムを買収共焦点顕微鏡によって、げっ歯類の海馬や大脳皮質におけるアミロイド沈着を囲む活性化した単核食細胞の年齢（60X倍率、zスタックのステップ：0.25μmの&lt;Z &lt;0.40μmで、ステップ25 &lt;N &lt;35の数）。 </li></ol> 4. q3DISM 注：有意な結果を得るために、我々は、関心のある動物/領域当たり3画像の最小値を分析することを示唆しています。各画像について、分析する細胞の存在量は、実験パラダイムによって異なる場合があります。この報告書に示されている代表的な結果では、我々は（ 例えば 、単核食細胞から離れまたはプラークに関連した、 図1Cを参照してください- Dおよび2C - D）3細胞/条件を分析しました。 DAY 10： <ol><li>科学的な3D画像処理と解析ソフトウェア共局在（coloc）同時にすべてのz平面でIBA1 / CD68（ラット組織）またはIBA1 / LAMP1（マウス組織）染色の空間的に近接するためのモジュールとの共焦点データセットを分析します。伊庭+ / CD68 +または活性化単核食細胞内のファゴリソソームに対応伊庭+ / LAMP1 +共局在化チャネルを作成します。 <ol><li>チャネルB（CD68または488 nmの蛍光体で結合されたランプ1染色に対応する）のために、チャネルA（594 nmの蛍光体で結合されたIBA1染色に相当）およびFITC用のTRITCを選択します。 「モードチェック、「選択」のしきい値を、 &#39;のとするためのソフトウェアのウィンドウの右側には「coloc強度、&#39; &#39;ソースチャンネル」を選択します。 </li><li>ソフトウェアのウィンドウの右側にある「coloc色」を選択する[編集]をクリックします。 </li><li>独立チャネルごとに、特異的な染色を含み、バックグラウンド/非特定の信号を除外するようにしきい値を調整します。調整後は、公平な分析を確実にするために、画像間のしきい値を変更しないでください。共局在ボクセル（すべてのz-スタックからのピクセル）は、すべてのzスタックSIMのステップ4.1.2で選択した色で表示されますultaneously。 </li><li> 「colocチャネルを構築する」をクリックします。作成された共局在チャネルが表示調整ウィンドウに表示されます。 </li><li>チャネル統計を開くためにcolocチャンネルをクリックします。 「共局在閾値以上のボリューム/材料Aの％は、「LAMP1またはCD68のシグナル（488 nmの蛍光団に対応するボクセル）と共局在IBA1信号（594 nmの蛍光団に対応するボクセル）の％を表します。より簡単には、これは、ファゴリソソーム（ 図1Cおよび2Cを参照）によって占有される単球の体積です。 注：「共局在した閾値以上のボリューム/材料Bの％は「IBA1と共局在LAMP1またはCD68シグナルの％に相当します。ファゴリソソームは細胞内構造であるので、これは、100％に近いものでなければなりません。値は、共局在しきい値以上のすべてのz-スタックからの信号の比に基づいています。 </li></ol></li><li> colocモジュールを使用して、OC（ラットTIと空間的に近接するため、ステップ4.1で作成したcolocチャネルを分析しますssue）または4G8（マウス組織）Aβ信号。これは、ファゴリソソーム内にカプセル化Aβの定量を可能にします。 <ol><li> （647 nmの蛍光団に結合されたOCまたは4G8染色に対応する）チャネルBのためのチャネル（ステップ4.1で作成したIBA1 / CD68またはIBA1 / LAMP1のcolocチャンネルに対応する）colocデータセットおよびCy5を選択します。 </li><li>ステップ4.1.5に4.1.2で説明したようにcolocチャネルを構築します。 </li><li>チャネル統計を開くためにcolocチャンネルをクリックします。 「共局在閾値以上のボリューム/材料Aの％は「IBA1 / LAMP1またはIBA1 / CD68の％を表す（ステップ4.1.5で構築されたcolocチャネルに対応するボクセルを。）OCまたは4G8信号と共局在（647に対応するボクセルnmの蛍光団）。これは、Aβ（ 図1Dおよび2Dを参照）によって占有されるファゴリソソームボリュームです。 注：「共局在した閾値以上のボリューム/材料Bの％は、「ファゴリソソームと共局在総Aβシグナルの％に相当します。これは、ファゴリソソーム内でカプセル化された総Aβ沈着物（本代表的な結果は示されていない）の一部を評価することができます。 </li></ol></li><li>共焦点画像スタックを再構築し、単球のファゴリソソーム内に封入されたAβの3Dモデルを生成するために上回るモジュールを使用してください。 <ol><li> 「表示調整」ウィンドウで、（のみIBA1染色を示すために）TRITCを選択します。 「ボリュームのプロパティ」ウィンドウで、「新しい面を追加」をクリックします。 </li><li> 「1/5のアルゴリズム」、ステップで「設定」、「表面を]を選択します。また、中に「色、 &#39;（赤が図1Bおよび図2Bに60％の透明度に設定されている）、パレットまたはRGBの色の種類を選択して、透明度を調整します。ボックスにチェックを入れ「関心領域を選択します」。 [次へ]をクリック。 </li><li>ステップの関心の2/5の領域、「xは、yの調整することにより、目的の細胞の周りに窓を描き、z座標は、（ 図1A中の白いボックスを参照してください</stroNG&gt;および2A）。 [次へ]をクリック。 </li><li>ステップ &quot;3/5ソースチャンネル」では、TRITCのソースチャンネルを選択します。 &#39;、スムーズ」ボックスをチェックし、0.4μmの表面積の詳細レベルを設定します。 「しきい値、 &#39;の絶対強度を選択します。 [次へ]をクリック。 </li><li>ステップ &quot;4/5しきい値、「作成されたボリュームは、TRITCチャネル信号と完全に重なるようにしきい値を調整します。 [次へ]をクリック。 </li><li>ステップに含めるか、または作成されるボリュームから除外されるように、その大きさに応じてオブジェクトを選択」、フィルタタイプ」セクションの「5/5の表面を、分類します」。 、[完了]をクリックし、すべての創造のステップを実行し、ウィザードを終了します。 </li><li>繰り返しは、FITCチャネル（LAMP1 +またはCD68 +ファゴリソソーム）用の3D表面を作成するために、4.3.6に4.3.1を繰り返します。 </li><li>繰り返しは、Cy5のチャネル（OC +または4G8 +Aβ沈着）のための3D表面を作成するために、4.3.6に4.3.1を繰り返します。 </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li><li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、単核食細胞によりin vivoでのAβ食作用の真の3D定量化のために、この報告書に記載したプロトコルは、特定の細胞と細胞内区画の標識だけでなく、Aβ沈着に依存しています。具体的には、脳単核食細胞を染色するためにIBA1（イオン化カルシウムの結合アダプター分子1）、細胞の活性化18、19時に細胞膜の波打ち現象および食作用に関与するタンパク質を?...

アルツハイマー病（AD）、最も一般的な加齢に関連する認知症1は 、「老人」βアミロイド斑、慢性低レベルの神経炎症、タウオパチー、神経細胞の喪失、および認知障害2などの脳アミロイドβ（Aβ）の蓄積によって特徴付けられます。 （末梢起源対それらの中心は依然として不明であるものの、ミクログリアと呼ばれる）は、AD患者の脳では、神経炎症がAβ沈着物3を取り囲む反応性星状細胞および単核食細胞によって計上されています。 CNSの自然免疫番人として、ミクログリアは中心部の脳Aβをクリアするように配置されています。しかし、Aβプラークのミクログリアの募集は、もしあれば、非常に少ないのAβ貪食4,5を伴っています。 1つの仮説は、ミクログリアがAβの小さなアセンブリをphagocytozingことで、最初は神経保護的であるということです。しかし、最終的にこれらの細胞は圧倒的なAβ負荷および/または年齢関連機能dと神経毒性になりますecline、神経毒性および認知機能の低下6に貢献し、機能不全の前炎症性表現型へのミクログリアを引き起こします。 最近のゲノムワイド関連研究（GWAS）貪食8-11を調節コア先天性免疫経路7に属するADのリスク対立遺伝子のクラスターを同定しました。その結果、脳アミロイド沈着に対する免疫応答は、ADの病因を理解するという点で、および12月14日 、新しい治療法を開発するために、両方の、関心の主要なエリアとなっています。しかし、 生体内でのAβ食作用を評価するための方法論のための重要な必要性があります。この満たされていないニーズに対処するために、我々は、アルツハイマー様疾患のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳のAβ食作用の真の3D定量を可能にするためにシリコモデリング（q3DISM） で定量的な3Dを開発しました。 それらは、動物モデルは、疾患を有する再現する程度によってのみ制限ADのpathoetiologyを理解するために、実験治療法を評価するための貴重な実証済み。プレセニリン（PS）及びアミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子における変異は、独立して、常染色体優性ADを引き起こすという事実のため、これらの変異導入遺伝子は、広範ジェニック齧歯類モデルを生成するために使用されてきました。同時に「スウェーデン」変異ヒトAPP（APPのSWE）と加速脳アミロイドーシス及び神経炎症15,16を備えた本Δエクソン9変異ヒトプレセニリン1（PS1ΔE9）を共発現するトランスジェニックAPP / PS1マウス。さらに、我々は、（フィッシャー344背景にラインTgF344-AD）のAPP SWEとPS1ΔE9構築物で同時注入二重トランスジェニックラットを生成しました。脳アミロイドーシスのトランスジェニックマウスモデルとは異なり、TgF344-ADラットはタウオパチー、神経細胞のアポトーシス損失、および行動障害17の前脳アミロイドを開発します。 本稿では、IMMのためのプロトコルを記述しますミクログリア、APP / PS1マウスとTgF344-ADラットからの脳切片におけるファゴリソソームおよびAβ沈着物、および大のz次元共焦点画像の取得をunostaining。 シリコ世代とミクログリアのファゴリソソームにAβの取り込みの定量化を可能にする共焦点データセットから真の3D再構成の分析で私たちは、詳細。より広義には、ここでは詳細を、我々の方法は、 インビボでの食作用の実質的に任意の形状を定量化するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors Blunt tip</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic pump FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x</td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Various concentrations, see protocol</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Embedding and Infiltration Paraffin</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Microtome Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Water bath Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Caution: Toxic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Working concentration 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic PAP pen</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Rack</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Wako</td><td>019-19741&amp;nbsp;</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Working concentration 1:100</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>OC antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Working concentration 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 rat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1 Confocal microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research software</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Bitplane software version 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&quot;coloc&quot; and &quot;supass&quot; modules are used.&amp;nbsp;Alternatively, the open-source freeware&amp;nbsp;ImageJ can be used for colocalization&amp;nbsp;analysis of confocal z-stacks datasets.</td></tr></tbody></table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

神経炎症は現在、神経変性疾患の主要な病因因子として認識されています。単核食細胞は、破片や残骸の食作用およびクリアランスを担当する自然免疫細胞です。これらの細胞は、CNS常駐ミクログリアとして知られるマクロファージ、および周囲から浸潤性単核食細胞が含まれます。光学顕微鏡は、一般に、齧歯類またはヒトの脳標本で食作用を視覚化するために使用されています。しかし、定性的な方法は、in vivo食作用の決定的な証拠を提供していません。ここでは、 シリコモデリング（q3DISM）、げっ歯類アルツハイマー病（AD）モデルにおける単核食細胞によるアミロイドβ（Aβ）食作用の真の3D定量化を可能にする堅牢な方法で定量的な3Dを説明します。この方法は、蛍光齧歯類の脳切片におけるファゴリソソーム内にカプセル化Aβを可視化することを含みます。大型のz次元共焦点のデータセットは、その後、3Dは、A＆の定量のために再構築されます＃946;空間的にファゴリソソーム内で共局在。我々は、マウスおよびラットの脳にq3DISMの適用が成功を実証したが、この方法論は、任意の組織で事実上すべての貪食イベントに拡張することができます。

上記で詳述しq3DISMのための多段階方法論を使用して、我々はAPP / PS1マウス（ 図1）とTgF344-ADラットの脳における単球のファゴリソソーム（ 図2）にAβの取り込みを定量化することができます。したがって、q3DISMの方法論は、ADのマウスおよびラットモデルにおける単核食細胞の解析を可能にしました。興味深いことに、CD68 +ファゴリソ?...

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Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ（Aβ）食作用のインシリコモデリング （q3DISM） で定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。

定量的3D<em&gt;インシリコ</emアルツハイマー病の齧歯類モデルにおける脳アミロイドベータ食作用の&gt;モデリング（q3DISM）

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K ビュー.  University of Southern California (USC). 私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ（Aβ）食作用のインシリコモデリング （q3DISM） で定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。 

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Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

行動学

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid peptide (A&#946;) and intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. Because cerebrospinal fluid (CSF) is in direct contact with the extracellular space of the brain, it provides a reflection of the biochemical changes in the brain in response to pathological processes. CSF from AD patients shows a decrease in the 42 amino-acid form of A&#946; (A&#946;42), and increases in total tau and hyperphosphorylated tau, though the mechanisms responsible for these changes are still not fully understood. Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for CSF sampling from the mouse. This extremely gentle sampling technique allows serial CSF samples to be obtained from the same mouse at 2-3 month intervals which greatly minimizes the confounding effect of between-mouse variability in A&#946; or tau levels, making it possible to detect subtle alterations over time. In combination with A&#946; and tau ELISA, this technique will be useful for studies designed to investigate the relationship between the levels of CSF A&#946;42 and tau, and their metabolism in the brain in AD mouse models. Studies in Tg mice could provide important validation as to the potential of CSF A&#946; or tau levels to be used as biological markers for monitoring disease progression, and to monitor the effect of therapeutic interventions. As the mice can be sacrificed and the brains can be examined for biochemical or histological changes, the mechanisms underlying the CSF changes can be better assessed. These data are likely to be informative for interpretation of human AD CSF changes.

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse

Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses in human patients. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for serial CSF sampling from the mouse.

大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid ...

生物学

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

神経科学

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

アミロイド-βおよびタウのトランスジェニックマウスモデルにおける自発的交互作用の評価、新規対象の認識および肢の把握Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

医学

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of the only FDA-approved disease-modifying treatment for AD. Accordingly, the use of transgenic mouse models that overexpress the amyloid precursor protein and thereby accumulate cerebral A&#946; plaques are widely used to model human AD in mice. Therefore, immunoassays, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunostaining, commonly measure the A&#946; load in brain tissues derived from AD transgenic mice. Though the methods for A&#946; detection and quantification have been well established and documented, the impact of the size of the region of interest selected in the brain tissue on A&#946; load measurements following immunostaining has not been reported. Therefore, the current protocol aimed to compare the A&#946; load measurements across the full- and sub-regions of interest using an image analysis software. The steps involved in brain tissue preparation, free-floating brain section immunostaining, imaging, and quantification of A&#946; load in full- versus sub-regions of interest are described using brain sections derived from 13-month-old APP/PS1 double transgenic male mice. The current protocol and the results provide valuable information about the impact of the size of the region of interest on A&#946;-positive area quantification, and show a strong correlation between the A&#946;-positive area obtained using the full- and sub-regions of interest analyses for brain sections derived from 13-month-old male APP/PS1 mice that show widespread A&#946; deposition.

The present protocol describes and compares the procedure to perform a full-region or sub-region of interest analysis of sagittal mouse brain sections to quantify amyloid-beta load in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.

マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Establishing an Alzheimer's Disease Rat Model Through an Amyloid-Beta Peptide Injection

Source: Xiaoguang, W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56157">Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer&#39;s Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the procedure for injecting amyloid-beta peptides, aluminum chloride, and a neuroinflammatory growth factor, which collectively aids in toxic amyloid plaque formation in the hippocampus region. This causes memory impairment in the rat, characteristic of Alzheimer&#39;s disease.

アミロイドβペプチド注入によるアルツハイマー病ラットモデルの確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

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