このプロトコルは、APP/PS1トランスジェニックマウスからの脳切片における関心の全切片および関心部分のサブ領域におけるアミロイドβプラーク負荷を比較する。この特定のプロトコルで提示された方法および結果は、読者または研究者が、マウス脳セクションにおけるベータ負荷を決定するために、関心領域全体またはサブ関心領域分析のいずれかを選択することを可能にする。まず、画像解析ソフトウェアをダウンロードします。
インストール時に、ソフトウェアを起動してファイルをクリックし、分析するイメージを開いて選択します。ソフトウェアツールバーから直線ツールを選択し、スケールバーの長さに沿って直線を描きます。分析をクリックし、設定されたスケールタブをクリックします。
ここでも、分析をクリックしてからタブを測定し、スケールバーの長さまたは距離をピクセル単位でメモします。ポップアップウィンドウで、距離をピクセル単位で入力し、スケールバーの既知の距離を入力し、長さの単位をマイクロメートルとして入力します。次に、グローバル ボックスをオンにして、複数の画像が処理されている場合、新しい縮尺設定を後続のすべての画像に適用します。
「OK」をクリックして設定を適用します。目的の測定値を断面の面積に設定するには、分析に進み、測定値を設定し、面積を選択してラベルボックスを表示します。分析する画像が [リダイレクト先] タブで選択されていることを確認します。
海馬や皮質の視覚化を容易にするために、画像に移動し、明るさまたはコントラストを調整します。最大スライドバーを徐々に左にドラッグして、関心のある脳領域またはROIが識別可能になるまで、組織の明瞭さを高めます。ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使用して、海馬領域の輪郭を描きます。
領域が輪郭を描いたら、明るさまたはコントラスト設定のリセットオプションをクリックして、元の明るさに戻ります。選択した領域の総組織面積を測定するには、編集をクリックして外側をクリアします。選択した領域が画面上の唯一の画像になったら、分析をクリックしてからタブを測定し、ポップアップウィンドウで分析された組織領域の合計を取得します。
次に、データを Excel ファイルに保存します。6-E10 の染色された陽性領域を測定するには、画像、調整、および色のしきい値タブを順番に表示します。しきい値設定方法の下で事前に作られたフィルタは、最も強い信号を赤で強調表示する望ましい結果を提供します。
適切なしきい値を選択した後、暗い背景をチェックして、黒い背景のアミロイドベータスポットを強調表示します。選択をクリックしてから、オリジナルをクリックし、もう一度選択して、白い背景にアミロイドベータ堆積物の暗い信号を与えます。ポップアップウィンドウが生成されたら、[パーティクルの解析と解析]タブをクリックし、[OK]をクリックします。ソフトウェアによって生成された要約出力を、編集ボタンとコピーボタンをクリックしてコピーします。
次に、以前に開始したExcelファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。式を使用してパーセント6E−10陽性面積を計算する 画像解析ソフトウェアをダウンロードした後、先に実証したように、脳ROIが識別可能になるまでステップを実行する。次に、長方形のツールを使用して、皮質または海馬のROIを選択します。
ツールバーで、[編集]をクリックし、高さと幅を定義済みの値に変更するタブを選択して指定します。箱が組織によって完全に覆われるように箱を調整します。明るさまたはコントラストを元の明るさにリセットします。
選択したROIを複製するには、ボックスを右クリックし、複製をクリックします。選択した地域を含む新しいウィンドウが開きます。複製されたイメージの名前を変更して、そのイメージが配置されている領域を表示します。
ツールバーを使用して画像をクリックして複製画像タイプを調整し、8ビットキーを入力して複製されたRGB画像を8ビットに変換し、プラークを最適に分析します。編集をクリックして画像を反転し、反転します。6E-10ポジ領域を測定するには、画像に移動し、調整してしきい値を設定します。
しきい値指定法の下で事前定義されたフィルタは、所望の結果を提供し、最も強い信号を赤色で強調表示する。適切なしきい値を選択したら、適用を押します。6E-10 の正の領域を解析するには、ツールバーを使用して [パーティクルの解析と解析] タブをクリックし、[集計結果] がオンになっていることを確認します。
編集タブとコピータブをクリックして、パーセント領域を含む要約出力をコピーします。次に、サマリー出力を、以前に開始した Excel ファイルにそれぞれのラベルを付けて貼り付けます。組織内の異なる領域についてこの手順を繰り返し、ROIを輪郭を描くための各ボックスの配置が各画像間で一貫していることを確認する。
この代表的な評価では、皮質および海馬脳組織における6E−10陽性領域を定量化するために、完全およびサブROI分析方法が比較される。完全なROI分析には、ROI全体の概要が含まれます。対照的に、サブROI分析は、ROI内の事前定義された領域を選択することを含む。
完全およびサブROI 6E−10正面積定量のための段階的な手順を、サブROI定量のためのROI回転と共に、ここに示します。ここでは、完全ROI分析とサブROI分析の相関関係を示します。皮質および海馬のサブROI分析を行う2人の読者によって報告された6E−10陽性領域の間に有意な正の相関が観察された。
また、平均化されたサブROI 6E−10陽性領域は、完全ROIを用いて得られた領域と強く有意な正の相関を共有した。サブROI解析における完全による平均6E-10陽性領域については、皮質と海馬に有意差は認められなかった。Elizaによる全脳ホモジネートと可溶型アミロイドβ1-42測定との間に有意な相関が観察され、研究からの完全なROI分析閾値選択が正確なデータ定量を得る上で重要である。
選択したフィルターで陽性の汚れが正確に選択されるようにするには、ユーザーの介入が必要です。アミロイドβ定量とは別に、この方法は他の蛍光免疫染色に使用することができる。例えば、Iba-1は、ミクログリア陽性面積定量から。
