このプロトコルは、放出速度と関心のあるタンパク質であるアミロイドの量を制御するために使用されるマイクロビーズの製造について説明します。マイクロビーズは、適切な生体材料で細胞を固定化し、周囲の環境から保護するだけでなく、副産物や栄養素を周囲の環境と交換できるようにします。この技術を用いて細胞をカプセル化することで、マイクロビーズのサイズと細胞数の厳密な制御が保証され、様々な製造パラメータを調整することでこれを行います。
したがって、このプロトコルに記載されている細胞をカプセル化すると、インビトロ系とインビボ系の両方で使用するアミロイドの慢性的な放出が増え、病気のメカニズムをよりよく理解し、新しい治療法をテストすることも可能になります。この方法は、制御系を処方し、単独でも組み合わせでも、多くの細胞タイプの生体分子の放出を研究するために使用することができます。まず、インキュベーターからコンフルエントに近いフラスコを取り除きます。
0.25%トリプシン-EDTA溶液で細胞を処理し、細胞を取り外すために5〜10分間37 Cでインキュベートします。DMEM/F12培地を添加した後、50ミリリットルのチューブに細胞を集めます。細胞を1000RPMで5分間遠心分離する。
上清を取り除き、HEPES緩衝生理生理にペレットを再懸濁し、最終的に所望の細胞濃度を2倍にします。50ミリリットルの遠心分離管に、この細胞懸濁液を4%重量および体積アルギン酸溶液と1対1の比率で混合し、2%重量および体積アルギン酸溶液中の所望の細胞濃度を含む最終的な懸濁液を得る。カプセル化パラメータを設定するには、カプセル化機の速度を最大押し出し速度に設定し、電圧と周波数を設定します。
マイクロビーズを製造するには、20ミリリットルのシリンジに、5ミリリットルの細胞アルギン酸懸濁液をロードし、封入器に注射器を取り付ける。カプセル化器を起動するには、セルアルギン酸懸濁液をフィーダに押し込む流れを活性化し、ノズルを通して液滴の流れが押し出されます。最初の不均一な流れを避けるために、廃棄物ビーカーに最初の1ミリリットルを収集します。
その後、残りの4ミリリットルを実行し続け、液滴が塩化カルシウムゲル化浴に落ちるようにします。ゲル化浴に接触すると、液滴中のアルギン酸は、ゲル化浴中のカルシウムイオンと瞬時に交配し、球状マイクロビーズを形成する。1分後、ゲル化ビーカーを磁気プラットフォームから取り出し、マイクロビーズを攪拌することなくさらに4分間休ませて室温でゲル化を完了させます。
マイクロビーズを取り出すために、まず滅菌ピンセットを使用して、大きなアルギン酸破片またはアーティファクトを除去します。プラスチックピペットの端部を切断した後、それを使用して、ゲル化浴から、廃ビーカーの上に保持された74マイクロメートルのメッシュフィルターにマイクロビーズを移します。成功を確実にするために、マイクロビーズの損傷を避けるためにプラスチックピペットの端を常に切断し、カプセル化後にビーズを1隻から別の容器に移すたびにこれを行います。
遠心管の上にメッシュフィルタを反転させます。その上に適切な培養培地をピペットしてビーズをチューブに洗い、その培地内で5分間平衡化させます。次に、インキュベーションおよびさらなる実験のために適切な培地で満たされたフラスコにそれらを移します。
カプセル化および培養後の細胞生存率を評価するには、溶解ミックスを加えてマイクロビーズを穏やかに破壊し、カプセル化した細胞を放出する。細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cで5%の炭酸ガスを10分間穏やかな攪拌でインキュベートする。トリパンブルーで染色し、血球計室を使用して、これらの細胞の細胞生存率を推定する。
マイクロビーズの安定性を評価するには、顕微鏡およびイメージングソフトウェアを使用して、各マイクロビーズ集団からのサンプルの平均直径を経て測定します。調製後、このプロトコルを用いて均一および球状のアルギン酸マイクロビーズが正常に生成された。標準的な細胞培養条件で1日後、7PA2細胞をカプセル化し、マイクロビーズ中に均等に分布した。
MTSアッセイを用いて7PA2細胞増殖を試験した場合、7日間にわたってアルギン酸の有無にかかわらず増殖した7PA2細胞の挙動に有意な差はなかった。7PA2細胞の2Dおよび3D培養物から分析されたコンディショナラな培地は、両方の培養においてアミロイド-β1-42レベルの一定の増加を明らかにした。マイクロビーズ(3D培養)からのアミロイドベータ1-42の放出速度は、2D培養物から放出されるプロファイルと類似している。
アルギネートマイクロビーズにカプセル化された7PA2細胞は、アミロイドベータの持続放出に有効に使用することができる。ラット脳に生着するためのマイクロビーズは、大きな病変を生じることなく埋め込まれるほど小さくなければならない。生体内の目的のために脳内にミリメートルスケールのビーズを埋め込むのは機能しませんが、このプロトコルを使用して製造されたマイクロビーズはラットの海馬内に挿入するのに適したサイズを有する。
最終製品の細胞の分布が均一であることを確認するには、細胞アルギン酸懸濁液中の細胞を徹底的に混合することが重要であり、これは各マイクロビーズからのアミロイドの均一な放出を保証します。
