工学物理科学研究会議からの資金（補助金1452230およびEP / M023915 / 1）、バイオテクノロジー・生物科学研究会議（BB / M024830 / 1を付与）および欧州理事会（FP7 CIG 631186）は深く感謝しています。

ツールと他の表面の1クリーニング注：高解像度を目指した場合、汚染の任意の形式は有害な結果を持つことができます。サンプル、基板やAFMチップを操作するために使用されるすべてのツールを徹底的に洗浄されていることを確認する必要があります。以下は、試料ステージ自体を含むサンプル、カンチレバー、またはAFM細胞と接触し得る任意の表面または器具（ 例えば、ピンセット）に適用されます。 <ol><li>再び10分間超純水に続いてイソプロパノール（純度99.7％）、続いて超純水中の楽器（18.2MΩ、&lt;5ppmの有機物）、、、それぞれのバスは、超音波処理します。可能な場合は、ヒュームの吸入を減らすためにヒュームフードの下でイソプロパノールを使用しています。 </li><li>窒素気流下で乾燥しました。 </li><li>フルイマージョンができない場合（ 例えば、カンチレバーホルダー/エレクトロニクス用）ultrapuに浸し、単層、低リント組織（軽組織ワイパー）で拭いて、物理的に清浄な表面順次、水、イソプロパノール、超純水を再。表面が（通常は15〜30分以内に）空気中で乾燥することができます。 </li></ol> 2.基板の準備注：基板が直接、通常、AFMスキャナおよびサンプルの両方と物理的に接触し、サンプルを支持する固体表面を指します。ほとんどのAFMは、磁気マウントを有し、鋼ディスクを使用することができるが、同一のプロトコルは、例えば、ガラススライドなどの基板に適しています。ここでは、マイカディスクが貼付されている鋼製のディスクを前提としています。この手順の目的は、画像形成に影響を与えることができ、汚染の可能性のある外部ソース限り制限することです。手袋を常に着用する必要があります。 <ol><li>バース・超音波処理続いてイソプロパノール超純水（18.2MΩ）の鉄鋼サンプルディスク、そして最後に超純水により再び、10分間それぞれ。 </li><li>窒素気流下でディスクを乾燥させます。 </li><li>十分に混合した試薬及び場所〜10で、エポキシ接着剤の少量を調製81;スチールディスク上リットル。 </li><li>基板に圧力を印加することによって、鋼ディスクに対して基板（白雲母、SiO 2の結晶、ガラス、 等）を貼り付けます。 （製造元の仕様を参照してください）エポキシは高温で数時間硬化させます。 </li><li>基板のエッジの周り、何のエポキシが直接空気に露出していないことを確認してください。これは、エポキシ樹脂の過剰量が使用される場合に発生し、汚染源となることができます。 <ol><li>マイカ基板の場合は、顔全体を覆うようにしっかりと、基板上に〜幅2.5cmの粘着テープを押して、スムーズに剥がします。穏やかに粘着テープを使用し、表面に平行に引いて、雲母の皮をむきます。除去された材料は、テープ上に表示されます。マイカが目に鏡面になるまで、このプロセスを2-3回繰り返します。 </li><li>ガラス/ SiO 2を、さらに化学的表面改質が必要な場合は、ステップ2.1~2.2の浴超音波処理ルーチンを繰り返します。また、Uを使いますV露光ユニット電力に応じて30〜60分間（18 W UV-C殺菌ランプ））表面上に残されてもよい任意の有機物を熱分解します。この手順は、かなりの粗さを増大させることなく、表面をより親水性にします。 </li></ol></li></ol>カンチレバー先端の調製<ol><li>超純水に続いてイソプロパノール浴中のカンチレバーチップ、60分間ずつ浸し。 </li><li>カンチレバー/先端が（ゲルボックスで長期間貯蔵した後など 、）大規模な清掃が必要な場合は、ステップ1の前にアセトン中で30分間浸漬（&gt; 99.5％の純度）を追加（セクションもアドレッシング汚染を参照してください）。ゲルボックスにヒントのストレージは、我々の経験では、非常に急速に59を発生することができ、汚染の主要な源の一つです。 </li><li>安定した水和サイト60の形成に有利にするためにUV光を簡潔に（&lt;5分）にヒントを公開します。それは、先端またはincに損傷を与えることができるよう、より長い露出オーバー時間を避けますその曲率半径をrease。 </li><li>カンチレバー上に（溶液の性質が調査されたサンプルに依存するが、この場合には、超純水中の塩化ルビジウムの10 mM溶液を使用します）イメージング溶液50μl〜AFMのカンチレバーホルダとピペットにカンチレバーを挿入し、プリウェットそれに先端;試料に接近するとき、これは、気泡の出現を制限します。 </li></ol> AFMセルの4セットアップ<ol><li>試料ステージ上にサンプルディスクと基板をマウントと撮像液の滴（その最高点で液体で、通常、2〜3ミリメートルの厚さ）を追加します。 </li><li> AFMにカンチレバーホルダーを接続します。 </li><li>カンチレバー/先端と試料上の流体間の毛細管ブリッジを形成するように近接さカンチレバーと試料を持参。 </li></ol> 5.初期化測定とカンチレバーのキャリブレーション<ol><li>先端-Eに近い測定レーザー（通常は赤）を合わせますカンチレバーのND。 AFMのモデルに応じて、ソフトウェア制御を介して、またはレーザー位置を手動で調整することによってのいずれかそう。液体中のカンチレバーの熱スペクトルを取得（ 図1A参照）。プロセスは、カンチレバーの主共振（基本固有モード）の周波数を見つけるために、レーザを用いてカンチレバーの熱変動を記録します。最も近代的なAFMでは、これはソフトウェア制御で自動化された手順を介して行われますが、詳細は、AFMからAFMに異なる場合があります。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> 図1：チューニングとカンチレバーを校正します。 ：基本的な固有モード（赤）の単純な高調波発振器（SHO）フィットとカンチレバーの垂直偏向（黒）の熱雑音スペクトル。ここで、共振が水に18.7 kHzです。最初の三つの曲げ固有モードに対応する最初の3つの共振周波数がhighliあります青い矢印でghted。 B：カンチレバーの逆光てこ感度の校正。 （非変形可能な）硬い表面に押し付けカンチレバーの線形偏向はボルトで測定された撓み及びナノメートルの対応する値との間の変換係数（InvOLS）を測定するために使用されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>硬い基板（ 例えば 、マイカ、ガラス）上のカンチレバーとの距離曲線対たわみを記録した （ 図1Bのように）線形偏向領域における曲線の傾きが団結61であることを課すことでたわみを校正- 63。 注：このプロセスは、（ボルトで）光検出器で測定したたわみとの間の変換係数を見つけ、（ナノメートル単位）カンチレバーの本当のたわみ - 自演逆光てこ感度（InvOLS）としてWN。キャリブレーションは、先端部が破損する恐れがありますので、すべての測定が完了した後、それを実施することをお勧めします。キャリブレーションの前に真の振幅の推定値（典型的には&gt; 90％正確な）を取得する前の実験中に同じタイプの別のカンチレバーについて導出InvOLS値を使用します。 </li><li>カンチレバーのバネ定数を得るために、66 -単純な調和振動子モデル64と熱的にスペクトルの共振ピークを合わせます。この手順では、ほとんどのAFMソフトウェアで自動化され、通常は問題になっているモデルの専門知識を必要としません。 </li><li>チューンカンチレバー。外部から駆動時にその公称共振周波数に近い周波数の範囲にわたって（ 例えば、音響や光熱励起による）カンチレバーの振幅応答を探します。わずかに左に、このスペクトルにおいて最大の近くに駆動周波数を設定します。カンチレバーはacouある場合stically駆動、多くの偽の最大値は、チューニングするとき表示されることがあります。 <ol><li>できるだけ近く（とのエンベロープ内）AFMを制御するソフトウェアの種類とバージョンに依存してもよいAFMが、仕様の制御ソフトウェアを使用することにより、熱スペクトルで同定された共鳴共振ピークを選択します。 </li></ol></li></ol> 6.アプローチと試料の初期チェック<ol><li>自由振動の振幅が約5nmとなるように、駆動振幅を設定します。これは通常、ほとんどのAFM上の0.2から0.8 Vに対応（場合にInvOLSが校正されていません）。自由振幅の〜80％に振幅設定値を調整します。 </li><li>比較的高いフィードバックゲインを設定します（絶対値はAFMによって異なります）が、不安定性やリンギングが発生しないことを確認してください。 </li><li> （〜1 Hzから10 nmのそれぞれに、 例えば ）小さな値に初期スキャン速度、スキャンサイズを設定します。これは、いくつかのフィードバックパラメータが不十分に調整されている場合に、チップを保持するのに役立ちます長い距離にわたってスキャンを回避することによって。スキャンサイズはその後スキャン条件が適切で現れる場合に大きな値（ 例えば、100 nm）に増加させることができます。 </li><li>アプローチする前に（これは光学的に行われなければならないいくつかのケースでは）表面のおおよその高さを決定します。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを用いて表面に先端のアプローチを開始します。このプロセスの細部を使用AFMやソフトウェアのモデルによって異なります。 <ol><li>ソフトカンチレバーを使用した場合のアプローチに問題がある場合、接触モードでのアプローチを行います。この場合、ゲインはAMモードの場合よりも低いことを確認し、チップを保持するために（光検出器にレーザーを中心とした後、0.1〜0.2 V）比較的低い値に設定値を設定します。 </li><li>先端がわずかに目標値（AMモードでの接触モードまたは減少の増加）を変化させることにより画像を開始せずに表面に到達したかどうかを評価します。先端が表面にある場合は、トンへの影響彼は、Zピエゾの延長は無視すべきです。 Z-ピエゾのライブの動きは、通常、ほとんどのAFMの制御ソフトウェアにグラフで表示されます。セットポイントの変化は、ピエゾの目に見える動きをトリガした場合、これは、偽の係合を示します。後者の場合には、わずかに高い（接触）または下（AM）の設定値を使用して、現在の先端位置からのアプローチを再起動してください。 </li></ol></li><li>先端が表面に到達すると、（通常は単に「停止」を押して）、Zピエゾを撤回し、カンチレバーを再調整（ステップ5.4を繰り返します。）;共振周波数は、おそらくチップと試料の相互作用に起因する低い値にシフトしています。 </li><li> （このチップ - 試料の距離で）、新たに調整された自由振幅の〜80％にセットポイントを変更します。 </li><li>カンチレバーをエンゲージし、撮像パラメータが適切であることを確認するために、AMモードで表面の10×10 nmの2スキャンを行っています。 <ol><li>トレース（左から右へスキャン）と帰（左に右スキャンする）ことを確認してくださいプロファイルは重ねます。さらに、設定値を減少させ、ゲインを大きくしてみてくださいない場合。 </li><li>画像にノイズになるとゲインを下げてください。 </li></ol></li><li> 1×1μmの2×5μmの2〜5 - -大規模で操作を繰り返したサンプルのスキャンは、これが可能である提供。ソフトまたは生物学的サンプルでは、​​これは先端の汚染をもたらす可能性があります。 </li></ol> 7.高分解能イメージング<ol><li>機能を可視化するのに適した値にスキャンサイズを減らす（ 例えば 、100×100 nmのタンパク質結晶のための2または雲母や方解石のための20×20 nmの2）。 </li><li>自動的にZ-ピエゾので、表面から先端を後退させるフィードバックループのための十分なカンチレバーの駆動振幅を減らします。カンチレバーが表面から離れている間、カンチレバーの振幅〜1-2 NM（ピーク・ツー・ピーク）となるように、駆動振幅を調整します。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを使用して、プログレZ-ピエゾが表面に向かって再び拡張し、元の画像が回復されるまで、異常に一度にセットポイントmVの数十を減らします。 75パーセントと新自由振幅の95％の間で設定値の振幅を保管してください。 </li><li> AFM制御ソフトウェアを使用してゲインを再調整してください。高い利得が大きなノイズを導入することなく、より低い振幅で使用することができます。 <ol><li>無料の振幅、設定値の最適な組み合わせを決定し、高解像度のために獲得するように、ステップ7.2から7.4を繰り返します。最適条件は、サンプル（溶媒和の風景や液体の濡れ性）だけでなく、カンチレバー（バネ定数、剛性）に依存します。 </li><li>撮影条件を最適化するために、振幅の異なる組み合わせを探索します。再び自由振幅42を増加させる必要があるかもしれません。このような場合には、第一のより高い値に設定値を調整し、ドライブ（振幅を減少させるために使用されるよりも、すなわち 、逆の手順）を増加させます。 </li><li> setpoiをキープ0.5 20nmの範囲の振幅のnt - 1.5 nmの（ピーク・トゥ・ピーク）設定値の比率では、（典型的には0.75から0.95）0.7以上に保ちます。 2 N / mの - 親溶媒インターフェイスの場合、0.5のバネ定数とカンチレバーを使用しています。これは、チップが表面に当たることなく、界面の液体の大部分を除去するのに十分です。経験則は式が提案されています。参照29の4。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

その発明以来、30年前、原子間力顕微鏡（AFM）1は、特に巨視的な表面領域にわたって平均ところ、ナノスケールでサンプルを調査するための選択肢の技術としての地位を確立していることは不可能であり、地域の情報が必要です。典型的なAFM測定では、フレキシブルカンチレバーの偏向は分子の少数カンチレバーの端部に取り付けられultrasharp先端との間の相互作用力を定量化するために使用されます。考え相互作用のタイプ及び時間スケールに応じて、情報の広い範囲は、ソフト生体膜2,3の粘弾性特性を含む、誘導することができる、単一の化学物質の強さまたは分子結合4,5の原子論的な詳細表面6から8、磁気9、容量10、サンプルの11、熱12,13および化学14導電特性を<sup&gt; 15。それは探針と試料との間の特定の力に依存しないため、AFMの成功の一部は、材料16の広い範囲に及び、真空17、ガス11,18または液体19,20などの複数の環境で動作する能力であります。 しかし、実際には、周囲以外の条件でAFMを動作させるのは、困難で、多くの公開された結果は、静止空気中で得られることができます。追加された困難は、大きな摩擦力を回避することにより、チップと試料の両方を保持するために動的モード（振動先端）でAFMを動作させるために通常必要であるという事実に由来します。より困難なものの、動的な動作は、原則的に分析し、空間分解能の損失なしに、サンプルに関する詳細な情報を提供することができます。多周波測定を、23 - 10年間で、液体の動的AFMのフィールドは、ビデオレートAFM 21の出現から、重要な進展が見られました<sup&gt; 24,25およびインタフェース26で水和構造のサブナノメートルイメージング- 31。 36、ポリマー研究37、電気化学38 - - 40固液界面41特徴付け- 44を液中に浸漬しながら、AFM動作について日常的に生物学および生物物理学32で使用されています。振動カンチレバーの周りの液体の存在はかなりそのダイナミクス45と同様に、先端と試料29,42の間の相互作用を変化させます。適切に使用されるとき、液体は、周囲条件46で達成最高の解像度と比較して、大きさのほぼオーダーの典型的な改善と、撮像解像度26,29を強化するために利用することができます。 AFMでは、特定の測定のために達成可能な最高の空間分解能は、AFM自体の品質とtの両方の性質に依存します彼は相互作用が20,47,48をプローブしました。現時点では、ほとんどのハイエンドは、熱限界12のそれに近い市販のAFM存在するノイズレベルはそれほど解像度のための決定要因は、通常、チップと試料の相互作用です。これは、効果的に解像度を決定し、この相互作用の空間勾配である：短距離、急速に減衰する相互作用に基づく測定は長距離相互作用が遊んでいるときよりも高い解像度の結果を生成します。彼らは離れて、試料49の表面から移動するときに液体のわずか数分子径（一般的に&lt;1 nm）を超える消滅する傾向があるため、液体では、溶媒和力は、撮像解像度を向上させることができます。これらの力は、液体分子と試料の表面との間の相互作用に由来します。表面に強い親和性を有する液体は、より規則およびサンプル29,42,50との界面におけるバルク液体未満の携帯になる傾向があります。結果として、それはナノスケール-the溶媒和の風景での界面の液体の特性の局所的な変化に非常に敏感な測定をレンダリング、バルク液体42よりも界面の液晶分子を変位させる振動AFMチップのために多くのエネルギーがかかります。 溶媒和力を利用するために、いくつかの実用的な側面を考慮する必要があります。まず、先端の振動振幅は&lt;一般的に、1 nmの溶媒和力の範囲に匹敵する必要があります。第二に、使用される液体は、試料の表面で明確に定義された溶媒和の景観を形成しなければなりません。肉眼、これは考えサンプルのための「濡れ」の液体を必要とすることと同じです。例えば、水に、疎水性グラファイト42,51よりも親水性の雲母の分子レベルの分解能を達成することが容易です。最後に、先端部を支持するカンチレバーのバネ定数を適切52,53選択する必要があります。これらの詐欺で作業する場合ditions、AFMは、界面の分子レベルの画像を提供しないだけでなく、試料表面54に関する化学的情報を得るために使用することができ、ローカルサンプル液親和性に関する情報を導出します。 液体中のAFMのための操作の最も一般的なダイナミックモードは、振幅変調（AM、また「タッピングモード &#39;）AFMと周波数変調（FM）AFMです。その振動振幅が連続チップ-試料間距離を再調整するフィードバックループによって一定に保たれつつ、第1ケース55には、チップサンプルをラスタ・スキャンします。試料のトポグラフィ画像は、フィードバックループによって適用される補正から得られます。 FM-AFM 28,41,56には、先端が試料を走査しながら、一定に保持されるカンチレバー/チップの発振周波数です。両方の技術は、液体36,57で同等の地形分解能を提供します。チップと試料の相互作用の定量化は、よりstraiになる傾向がありますghtforwardと正確なFM-AFMではなく、AM-AFMは、実装が簡単より堅牢で、より柔らかいカンチレバー、容易に変形やデリケートなサンプルを研究するために有用なものを扱うことができます。重要なことは、AM-AFMの一部は歴史的な理由だけでなく、原因、制御することが技術的に容易であるという事実のために、AFMユーザーの間でより広範囲です。 振幅AM-AFMイメージングの間のフィードバックループによって一定に保たれているが、先端振動と駆動振動との間の位相遅れを自由に変更することが許されます。位相遅れはサンプル58との界面における先端の振動中に消費するエネルギーに関連している、チップと試料の相互作用についての有用な情報を提供することができます。したがって、位相イメージングは​​地形イメージングに同時に取得することができ、多くの場合、試料表面の不均一性を強調で相補的です。位相イメージングは​​、ジ含む、相互作用の様々なマッピングのために利用されています付着エネルギー42、粘弾性特性58とインターフェース44の水和風景の矩形マッピング。 具体的には、液体中に高解像度の画像を得ることにより制御する多数のパラメータ、およびすべての状況で動作する単純な、系統的プロトコルが存在しないため、非自明なままです。画質は、典型的には、他の55のうち、カンチレバー形状および弾性、先端化学、振動振幅、およびサンプルの剛性に依存します。 AFM測定は、定義により、また、システムの摂動です。その結果、適切な配慮なしにイメージング変数や環境条件を変更すると、再現性の困難および/または不適当な観察と誤った結果につながることができます。 ここでは、AMPLで動作市販の装置を用いて、溶液中でのハードおよびソフトのサンプルの高解像度の画像を達成するための我々のプロトコルを提示しますitude変調。私たちの目標は、それぞれの場合にイメージングプロセスの基礎となる物理的原理からの私達の選択の根拠を説明する、異なるサンプル以上の解像度に影響を与える可能性が高い主なパラメータを最適化するための実用的な手順を提供することです。我々詳細は、基板洗浄及び準備から、カンチレバー、撮像パラメータの調整と共通の問題のトラブルシューティングの選択にステップ・バイ・ステップのアプローチ、。高解像度のための私達の選択や手続きの背後にある科学的根拠を説明することの方法論を適応させる際に合理的な選択をすることに役立ち、およびイメージング・小説・システムのための出発点となるべき。 このテキストを通して、私たちは、AFMの振幅変調動作モードを参照するためにAMを使用しています。我々は、 設定値のいずれかと、カンチレバーの偏向（接触モード）または振動振幅（AMモード）の間、フィードバックパラメータを一定に維持指します。 AMモードでは、カンチレバーは、外部から駆動されます。いずれかの音響振動によってまたはパルスレーザでは、カンチレバーの基部に焦点を当てました。 駆動振幅は、外部振動信号の強度です。カンチレバーの所定の振動振幅を達成するのに必要な駆動振幅の絶対値は、このような駆動方法（音響、磁気または光熱）、カンチレバーの固定及びパラメータ（剛性、幾何学）およびレーザアラインメントのような多くのパラメータに依存します。駆動振幅の正確な値は、したがって、関連しないが、カンチレバーの適切な（および定量化）の振動振幅を提供するようにそれを各実験に調整されます。駆動カンチレバーは遠く離れたサンプルからであり、その振動のない減衰がチップと試料の相互作用を介して発生していない場合には、その振動振幅は自由振動の振幅と呼ばれています。振動先端が試料表面に近づくと、その振幅が減少し始めます。フィードバックが有効になっている場合は、z軸ピエゾはconstでますantly選択した設定点の振幅をキールするように、その拡張子を再調整定数。目標値は、通常、無料の振幅よりも常に小さいです。自由振幅の上に設定点比 、セットポイントの振幅の比（撮像振幅）を参照するのが一般的です。目標比より小さい、厳しい撮影条件です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode IIIA AFM</td>
			<td style="width:121px;">Brucker</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td style="width:303px;">One of the machine used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cypher ES AFM</td>
			<td style="width:121px;">Asylum Resarch</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td>One of the machine used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM cantilever/tip</td>
			<td style="width:121px;">Nanoworld</td>
			<td style="width:171px;">Arrow UHF-AUD</td>
			<td>best for high frequency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM cantilever/tip</td>
			<td style="width:121px;">Olympus</td>
			<td style="width:171px;">RC800-PSA</td>
			<td>versatile and cheap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ultrapure water</td>
			<td style="width:121px;">Milipore</td>
			<td style="width:171px;">NA</td>
			<td>lab filtering systems can induce contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aaldrich</td>
			<td style="width:171px;">200-664-3&#160;</td>
			<td>standard chemical, no further purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monovalent salts</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aaldrich</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>standard chemical, no further purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lipids</td>
			<td style="width:121px;">Avanti polar lipids</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>lipid bilayers formed using stadard protocols</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystals</td>
			<td style="width:121px;">MTI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>polished crystals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:121px;">3M</td>
			<td style="width:171px;">Scotch Magic Tape</td>
			<td>Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-nanometer resolution imaging with amplitude-modulation atomic force microscopy in liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

前のセクションで説明したプロトコルは、正常molecular-または原子レベルの画像を達成するために、いくつかの市販のAFMを用いて適用されています。すべての画像は手順7.1から7.4ステップ以下、個々に調整0.5 nmから1.5 nmの作業振幅で得られました。結果は、ソフト（ 図2）と硬い（ 図3）試料の広い範囲を得ることができました。それぞれの場合において、関心の特徴が強調されています。技術の大きな利点の一つの小さな振動振幅と高設定点は、脂質の脆弱な自己アセンブリを可能にする、サンプルの先端によって加えられる力を最小限に抑えることである（ 図2A）、タンパク質（ 図2BおよびD）、および両親媒性分子（ 図2C）は 、溶液中の損傷を与えることなく撮像することにします。そのような鉱物硬い結晶性物質（ 図3A、B、D）とすべての場合において、それが効果的に記述されたプロトコルを用いて画像形成される界面の液体であるため、表面（ 図3C）に吸着させ、単一の金属イオンは、アプローチを使用して画像化することができます。溶媒和力は、 図2および図 3に示すサンプルに匹敵する：すべてのサンプルは、（より一般的に図2C、3B、3Dの場合は「親溶媒」）イメージングソリューションに関して親水性です。一貫して、同程度の剛性を有するカンチレバー（0.3 - 0.8 N / m）をすべての場合に使用しました。サンプルチップの両方が液体分子を画像化することができる明確に定義された溶媒和構造を形成することを確実にするために親溶媒であるべきです。これは必ずしも十分条件ではありませんが、ほとんどの場合、比較的少量の液体分子のために、サンプルの対称性を模倣する方法で、液体再構造そのもの。高解像度のメインドライバは、吸着した溶媒分子の親和性の局所的変動であります（ 図2A、3A、3Cの場合はオングストロームスケール）表面のため。技術は、溶媒構造が表面を横切って大幅に変化する材料にしたがって最適です。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> 図2：水溶液中でAM-AFMによって撮像されたソフトのインターフェイス。 ：ゲル相におけるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）脂質二重層は、150mMのKClの中で画像化しました。六角形にパックされた脂質頭部基は、水和における部位特異的な変化を示す局所的なコントラストとともに、地形や位相の両方で識別可能です。 B：150mMの塩化カリウム、10mMトリス、pH7.4中に結像好塩菌のsalinarumの紫膜。いくつかのバクテリオロドプシンタンパク質トリマーが強調表示されます。相が原因タンパク質上のローカル水和サイトへの地形とは異なるコントラストを示します。個々のタンパク質トリマー<html> （破線）を作製することができます。 C：色素増感太陽電池中のTiO 2ナノ粒子の表面に吸着された両親媒性色素（Z907）分子。画像は、エチル - イソプロピルスルホンで取得しました。スポンジ状の外観は、吸着色素分子によって生成されます。 D：B.アンアクアポリン四量体と同じバッファで撮像されたネイティブのウシレンズ膜におけるアクアポリンの結晶が強調表示されます。サブ構造は、ヘリックス間のループに対応する位相は、タンパク質の近くに異常な水の挙動に起因する著しく異なるコントラストを示している地形に表示されます。画像は、参考文献36（B）、参考文献38（C）及びREF 67（D）から適合されています。スケールバーは5nmの（A）、10nmの（B）、（C）3ナノメートル、15ナノメートル（D）カラースケール600、それぞれ200午後及び15°（A）の高さと位相の変化を示しています午後4°（B）、2.5 nmおよび2.5°（C）、及び1.6 nmおよび9.5°（D）。ロード/ 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> 図3：流体溶液中のハードのサンプルの代表AM-AFM像。 A：方解石結晶[ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" />平衡化した超純水の溶液に結像]表面。 B：ジメチルスルホキシド（DMSO）で得られた画像形成されたチタン酸ストロンチウム。高解像度を水に不可能でした。 C：3 mMのRbClをで撮像された白雲母-単一の吸着のRb +イオンは両方の相と高さのスキャンにおける雲母の格子サイトに表示されます。 D：DMSO中に撮像された中で炭化ケイ素。予想結晶構成は、画像Bに示されており、D.画像は、参考文献68（A）から参考文献42（BおよびD）に適合されていますそして、ref 44（C）。スケールバーは3ナノメートル（A、B、D）および5nmの（C）です。カラースケールは、それぞれ250午後と14°（A）、600午後及び5.5°（B）、800午後と15°（C）、および500午後と3.5°（D）の高さと位相の変化を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

我々は、液体中の振幅変調（タッピングモード）原子間力顕微鏡を用いて、サブナノメートルの解像度の画像を達成するための方法を提示します。この方法は、市販の原子間力顕微鏡で実証されています。私たちは、パラメータの私達の選択の背後にある理論的根拠を説明し、解像度の最適化のための戦略を示唆しています。

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

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16.6K ビュー.  Durham University. 我々は、液体中の振幅変調（タッピングモード）原子間力顕微鏡を用いて、サブナノメートルの解像度の画像を達成するための方法を提示します。この方法は、市販の原子間力顕微鏡で実証されています。私たちは、パラメータの私達の選択の背後にある理論的根拠を説明し、解像度の最適化のための戦略を示唆しています。 

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Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted significant interests across the research fields of materials science, physics, chemistry and biology. The key enabling technology is a liquid cell. We fabricate liquid cells with thin viewing windows through a sequential microfabrication process, including silicon nitride membrane deposition, photolithographic patterning, wafer etching, cell bonding, etc. A liquid cell with the dimensions of a regular TEM grid can fit in any standard TEM sample holder. About 100 nanoliters reaction solution is loaded into the reservoirs and about 30 picoliters liquid is drawn into the viewing windows by capillary force. Subsequently, the cell is sealed and loaded into a microscope for in situ imaging. Inside the TEM, the electron beam goes through the thin liquid layer sandwiched between two silicon nitride membranes. Dynamic processes of nanoparticles in liquids, such as nucleation and growth of nanocrystals, diffusion and assembly of nanoparticles, etc., have been imaged in real time with sub-nanometer resolution. We have also applied this method to other research areas, e.g., imaging proteins in water. Liquid cell TEM is poised to play a major role in revealing dynamic processes of materials in their working environments. It may also bring high impact in the study of biological processes in their native environment.

We have developed a self-contained liquid cell, which allows imaging through liquids using a transmission electron microscope. Dynamic processes of nanoparticles in liquids can be revealed in real time with sub-nanometer resolution.

液晶セルの透過型電子顕微鏡を使用して液体の材料の動的過程を明らかにする

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

工学

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses triangulation between matching points in two views of the same scene at different angles to compute depth.&#160;However, unlike a stereo-based method, DFP uses a digital video projector to replace one of the cameras1. The projector rapidly projects a known sinusoidal pattern onto the subject, and the surface of the subject distorts these patterns in the camera&#8217;s field of view. Three distorted patterns (fringe images) from the camera can be used to compute the depth using triangulation.
Unlike other 3D measurement methods, DFP techniques lead to systems that tend to be faster, lower in equipment cost, more flexible, and easier to develop.&#160;DFP systems can also achieve the same measurement resolution as the camera.&#160;For this reason, DFP and other digital structured light techniques have recently been the focus of intense research (as summarized in1-5). Taking advantage of DFP, the graphics processing unit, and optimized algorithms, we have developed a system capable of 30&#160;Hz 3D video data acquisition, reconstruction, and display for over 300,000 measurement points per frame6,7.&#160;Binary defocusing DFP methods can achieve even greater speeds8.
Diverse applications can benefit from DFP techniques. Our collaborators have used our systems for facial function analysis9, facial animation10, cardiac mechanics studies11, and fluid surface measurements, but many other potential applications exist.&#160;This video will teach the fundamentals of DFP techniques and illustrate the design and operation of a binary defocusing DFP system.

This video describes the fundamentals of digital fringe projection techniques, which provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;It also demonstrates the design and operation of a high-speed binary defocusing system based on these techniques.

デジタル干渉縞投影技術と高分解能、高速、三次元ビデオ画像

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

ポリマーブラシに反対非混和性の調製と摩擦力顕微鏡の測定、

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

シンクロトロン高速断層撮影法を使用した炭酸における反応の動的細孔スケール貯水池条件イメージング

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different materials show variability in resistive switching properties due to the intrinsic nature of the material used, leading to discrepancies in the field because of underlying operation mechanisms. This highlights a need for a reliable technique to understand mechanisms using nanostructural observations. This protocol explains a detailed process and methodology of in&#160;situ nanostructural analysis as a result of electrical biasing using transmission electron microscopy (TEM). It provides visual and reliable evidence of underlying nanostructural changes in real time memory operations. Also included is the methodology of fabrication and electrical characterizations for asymmetric crossbar structures incorporating amorphous vanadium oxide. The protocol explained here for vanadium oxide films can be easily extended to any other materials in a metal-dielectric-metal sandwiched structure. Resistive switching crossbars are predicted to serve the programmable logic and neuromorphic circuits for next-generation memory devices, given the understanding of the operation mechanisms. This protocol reveals the switching mechanism in a reliable, timely, and cost-effective way in any type of resistive switching materials, and thereby predicts the device&#39;s applicability.

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

Presented here is a protocol for analyzing nanostructural changes during in&#160;situ biasing with transmission electron microscopy (TEM) for a stacked metal-insulator-metal structure. It has significant applications in resistive switching crossbars for the next generation of programmable logic circuits and neuromimicking hardware, to reveal their underlying operation mechanisms and practical applicability.

混相a-VOxに基づく非対称クロスバーのバイアスと作製を用いたSitu透過電子顕微鏡

Resistive switching crossbar architecture is highly desired in the field of digital memories due to low cost and high-density benefits. Different ...

Nanoscale Characterization of Liquid-Solid Interfaces by Coupling Cryo-Focused Ion Beam Milling with Scanning Electron Microscopy and Spectroscopy

Physical and chemical processes at solid-liquid interfaces play a crucial role in many natural and technological phenomena, including catalysis, solar energy and fuel generation, and electrochemical energy storage. Nanoscale characterization of such interfaces has recently been achieved using cryogenic electron microscopy, thereby providing a new path to advancing our fundamental understanding of interface processes.
This contribution provides a practical guide to mapping the structure and chemistry of solid-liquid interfaces in materials and devices using an integrated cryogenic electron microscopy approach. In this approach, we pair cryogenic sample preparation which allows stabilization of solid-liquid interfaces with cryogenic focused ion beam (cryo-FIB) milling to create cross-sections through these complex buried structures. Cryogenic scanning electron microscopy (cryo-SEM) techniques performed in a dual-beam FIB/SEM enable direct imaging as well as chemical mapping at the nanoscale. We discuss practical challenges, strategies to overcome them, as well as protocols for obtaining optimal results. While we focus in our discussion on interfaces in energy storage devices, the methods outlined are broadly applicable to a range of fields where solid-liquid interface play a key role.

Cryogenic Focused Ion Beam (FIB) and Scanning Electron Microscopy (SEM) techniques can provide key insights into the chemistry and morphology of intact solid-liquid interfaces. Methods for preparing high quality Energy Dispersive X-ray (EDX) spectroscopic maps of such interfaces are detailed, with a focus on energy storage devices.

クライオ集束イオンビームフライス加工と走査型電子顕微鏡・分光法の結合による液体-固体界面のナノスケール特性評価

Physical and chemical processes at solid-liquid interfaces play a crucial role in many natural and technological phenomena, including catalysis, solar ...

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass optical fiber inserted into the electron column above the objective lens polepiece, and a laser, an adjustable light source, was used to fabricate the device. After the illuminator has been calibrated using an external measuring system, it allows one to adjust the intensity of the lighting to the needs of the observed process. This lighting system was utilized to image antimicrobial photodynamic therapy phenomena, which are currently the subject of intense research. The sample was prepared by spotting a suspension of bacteria on a carbon, graphene, or silicon nitride substrate, blotting the excess solution, spotting the photosensitizer solution, blotting the excess liquid again, and then assembling the liquid cell with a second substrate or graphene film. The process of the imaging experiment itself includes choosing the right place for observation with the use of low magnification and a minimum dose of electrons, and then cyclical activation of the light source to capture subsequent images at specified intervals with the minimum amount of electrons necessary. The electron dose of each exposure and the time and intensity of lighting used need to be carefully recorded due to the complexity of the observed phenomena as, at the same time, the process is both light- and electron-driven. After the actual experiment is performed, additional control observations must be made, in which the same doses of electrons are used but without additional light influence and smaller doses of electrons are used for higher doses of light. This makes it possible to distinguish light-induced microstructural effects from those caused by electrons in both the fields of life and materials science.

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

The present protocol describes transmission electron microscope (TEM) modifications with a light illumination system, the fabrication of liquid cells, and in situ TEM observations of light-induced interactions between bacterial cells and a photosensitizer. The sample preparation methods, electron beam damage, and imaging are also discussed.

液体-ソフトマター相互作用観察のための光誘起 In situ 透過型電子顕微鏡

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...