著者は、本論文で用いた細胞株を提供するためにペンシルベニア大学で博士ポールJanmeyに感謝します。 QWはまた、AFM技術に関する彼らの洞察に満ちた議論JF Byfieldさんとエヴァンアンダーソンを認める。

1。カンチレバーのバネ定数キャリブレーション<ol><li>製造元の指示に従って、AFMにカンチレバーをロードします。これは、任意の実験の前にエタノールでカンチレバーホルダーをきれいにすることが必要である。これはAFM測定中文化への細菌汚染を制限するのに役立ちます。 </li><li> InvOLS（逆光てこ感度）を校正します。このパラメータは、カンチレバーのたわみのナノメートルあたりのフォトダイオードの応答（ボルト）の量を示しています。 </li><li>試料ステージの上に清浄なガラススライドをロードし、製造元の指示に従ってAFMヘッドを取り付け、レーザビームと配置を調整。スライドガラス上のAFMチップを従事。 </li><li>撤回ピエゾで、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. +2のトリガーポイント（最大ダイオード応答）と力分光測定を行いV. </li><li>ピエゾは撤回で、-2のフォトダイオードの読み取りにミラーを再調整V. FOを実行+2 V. 注のトリガーポイント（最大ダイオード応答）とRCE分光測定：ここに電圧値はアサイラムAFMに固有のものです。この値は、製造業者によって提供された仕様に従って設定されるべきである。 データ収集後、フォースカーブをしっかり接触領域に、ズーム完了です。 V / NMになり斜面を見つけるために、この地域への線形フィットを実行します。この値の逆数がカンチレバーフォトダイオードアンサンブルの光感度を示しています。 </li><li> 0の自由たわみにミラー位置合わせをリセットV. </li><li>カンチレバーのバネ定数を校正します。熱調整方法は、カンチレバー28のバネ定数を決定するために使用される。 </li><li> InvOLSを校正した後、チップと試料の間には相互作用がないことを、サンプル段階からスキャナを離れて上げる。 </li><li>温度データのキャプチャを開始。このプロセス中に、片持ち梁の熱振動がrecordeであるD。 AFMソフトウェアは、熱振動をプロットしてデータ·ウィンドウ内のパワースペクトルを解析する。 </li><li>データ収集の数秒後に、ばね定数を決定するために、最も低い周波数（基本共鳴）のピークを中心とするデータ·セグメントへのフィットを行う。 </li></ol> 2。サンプルのロード<ol><li>すでに装備されていない場合には、AFMの舞台でディッシュヒーター付属品を取り付けます。 </li><li> 37℃に温度を設定し、安定した熱平衡に達するまでのシステムのための20分間待ちます。 </li><li> AFMステージ上に培養皿を置き、皿ヒーターに付属のクランプを使って固定します。インキュベーターから皿の除去までの時間を最小化し、ステージ上に置き、細胞への外傷を回避するためにすることが重要である。 30分より長い測定のために、CO 2の独立した媒体は、通常の培養培地を置き換えるために使用されるべきである。 </li><li>トンの先端まで37°C培地の小滴を適用彼AFMカンチレバーと先端が単に、液体に浸漬されるまで、AFMヘッドを下げる。 </li><li>トップビューのCCDカメラを使用して、カンチレバー（液体のアライメントが原因で媒質の屈折率の変化により、空気中よりも異なるものになります）にレーザビームを再調整してください。 </li><li>培養皿のクリーンエリアにAFMチップを掛けて。 </li><li>上記のような液体環境におけるカンチレバー感度、InvOLSのキャリブレーションを実行します。 </li></ol> 注：細胞はヒドロゲル上で培養された場合）、InvOLSのキャリブレーションを細胞培養培地を充填した培養皿の底面に対して事前に行うべきである。細胞サンプルに切り替えるときは、特別な注意は、カンチレバーにレーザービームアライメントを変更しないために支払わなければならない。 b）は、InvOLSは、レーザ配向変化があるたびに再較正されなければならない。 c）のそれはまた、いくつかの検量線、sから値の平均としてInvOLSを取ることをお勧めします各キャリブレーションが異なるInvOLSを生成インス、。 InvOLSのばらつきが平均値と比較して、しかしながら、小さい。例えば、100倍0.06 N液体中/ mのバネ定数をブルカーDNP-10カンチレバーを較正することのみが0.5nm /標準偏差は、66.3ナノメートル/ Vの平均InvOLS値を生成V. 3。セルインデントのフォースカーブの収集<ol><li>インデントのためのセルを選択します。光学顕微鏡を用いて、先端が周囲核領域内に位置するようにセルの上にカンチレバーを配置するために、ステージを移動します。カンチレバー位置の正確な調整がXとYスキャナにオフセットを適用することによって達成することができる。 注：AFMカンチレバーは、ターゲットセルを選択するために試料ステージを移動させながら試料表面から引き出さなければならない。試料表面が平坦でないかもしれないので、これは、試料中にノッキングからカンチレバーを保護する。 </li><li>分光モードを強制的に切り替えます。インデントを設定する流体力学的効果を回避するのに十分低い1-10ミクロン/秒の範囲内で評価する。 </li><li>細胞への損傷を避けるために最大の力を制限するインデント偏向トリガ·ポイントを設定する。偏向信号の任意のドリフトを修正します相対トリガオプションを選択します。 2 nNの最大の力は、ほとんどのサンプルのための良い出発点です。この値は、しかしながら、試料の剛性に応じて調整されるべきである。ソフトサンプルについて低い値は、試料に過度のインデントを回避するために使用されるべきである。硬いサンプルについて高い値が測定可能なインデントを生成するために使用されるべきである。 </li><li>先端が完全に力の測定値との間のセルから離脱されることを保証するのに十分な大きさの力の距離を設定する。通常、力距離は5μmとに設定されている。 </li><li>単一の力曲線を取るAFMを指揮。 </li><li>各セルの周囲の核地域の別の場所で少なくとも三つの力曲線を収集します。それは複数取ることは有益であるが、信頼性のある統計データについては、各セル上の曲線は、あまりにも多くの力曲線を取ることはAFMプローブからのストレスによる細胞剛性の変化につながることができます。 </li><li>データ収集が完了したら、先端を撤回し、一定のサンプル条件で細胞剛性に優れた統計データの必要に応じて、できるだけ多くの細胞のためのステップ3.1から3.6を繰り返します。通常は、30細胞は各条件で測定されます。 </li></ol>単一セル内の剛性の分布を特徴付けるために、力マップモードが適用される。フォースマップモードでは、関心領域を含むように、スキャンサイズを設定し、適切な解像度を設定し、単一のフォースカーブのために選択された、インデントパラメータを設定し、AFMは、定義された試料領域にわたってラスターされ、シングルフォースカーブを取る試料領域内の各画素における。 4。データ解析記録されたフォースカーブは、細胞剛性を計算するために、カスタムMATLABプロシージャを使用して分析される。以下は、MATLABの手順について簡単に説明します。 <ol><li> 。MATLABプログラムは、接触点がLin らにより公開された方法から採用されたアルゴリズム29を用いて（ 図1参照）z0をd0に座標を識別する。 </li><li>力曲線の各データポイントのために、興味のある点、右（接触の最初のポイントとして選択したポイントを使用）ヘルツモデルフィットの左へのデータの線形近似を行い、設定するには最大インデント（200-300 nmのを推奨）。 </li><li>各ポイントには、両方の発作の相対RMS誤差を計算し、これらの値を合計します。 </li><li>最小合計フィッティング誤差を達成する点は、接触開始点として選択される。 注：計算時間ではなく直線的に全体の力曲線を走査するより黄金分割探索を実施することによって低減することができる。 </li><li>サンプル変形δとインデント力Fは次のように計算されています： <img alt="式（1）"FO：コンテンツ幅= &quot;3.073in&quot; FO：SRC = &quot;/はfiles/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li>最小二乗フィッティングをFに適合するように適用される対ポスト接触領域におけるδデータ、zのヘルツモデルへ≥zは 0、ヤング率、セルのEを抽出するには： <img alt="式（2）" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> ここで、vはポアソン比である。 注：δは試料の厚さ（セルの高さ）の10％以上であると、測定されたセルの剛性は、基板剛性に影響される。核周囲領域の厚さは通常、数マイクロメートルのオーダーである。したがって、F-δ曲線の最初の200-300 nmのはヘルツモデルにフィットされています。 </li></ol>

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A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

AFMインデンテーション法は、生きた細胞の機械的特性を特徴付けるための利点を有する。ピコニュートンレベル32で力を測定することが可能な磁気ねじれサイトメトリーおよび光ピンセット、より敏感とはいえ、AFMは、その力の範囲に匹敵する、ピコニュートンの数十から数ナノニュートンの数百に及ぶサンプルから抵抗力を検出することができますマイクロピペットを用いて細胞19に適用することができる。この力の範囲は、セル19のすべてのタイプの測定可能な変形を作成するためのニーズに合った。高い空間分解能により、サブミクロンレベルで33組織中の単一の細胞内で不均質を特徴付けることができる。それはまた、リアルタイムの生細胞の測定を可能にする。生物学的サンプル用に設計されたいくつかのAFMモデルは、流体環境で動作することができ、精密な温度制御を提供する加熱された試料ステージが装備されている、ことができる生理学的環境を維持すること測定中の細胞を生きたために境。 AFMのインデントが正常細胞型、25,34-36範囲の機械的性質を測定するために適用されており、細胞分化に関連するセルの機械的特性および様々な病気のコンテキストで評価する変化のために広く用いられている。30,37 フォースカーブから剛性を計算するための重要なステップは、先端が最初のセルとの接触になりポイントを識別している。接触点における不確実性は、弾性率31に影響を与えることができる。硬い材料は、偏向信号は、チップと試料の接触後に急激に増加し、接点を容易に曲線でターニングポイントとして識別される。このような鋭い転機は、しかし、しばしば低い細胞剛性に起因する細胞（ 図2を参照）からの力-曲線には表示されません。 MATLABコードを正確にフォースカーブのコンタクトポイントを検索するために開発されているLin らによって提案されたアルゴリズムを使用してソフトサンプル。29からコードが自動的に接触点を探索し、ヘルツモデルにインデントデータをフィッティングすることによって、データ分析の過程を自動化することを可能に柔らかい試料からの力曲線を処理することができる。 MATLABコードは剛性がバルクレオロジー測定による7.2 kPaであることが測定されたそのうちのポリアクリルアミドゲルの同じ場所で撮影された60フォースカーブで接触点を決定するために適用されます。コー​​ドでは、これらの曲線の点にご連絡検出。接触点位置の変動範囲は15 nmよりも小さい。これらの接触点に基づいて、算出した平均剛性が6.9 kPaであり、標準偏差は0.2 kPaであり、変動0.6 kPaの範囲の最大値である。この実験の結果は、測定された剛性の不確実性を評価するための尺度を提供する。平均貴重の10％未満である剛性の不確実性で接点結果に15 nmの不確か電子。偏向信号の非常に低いレベルの軟らかいゲルは、接触点の不確かさは30nmで、30％という高い剛性の不確実性をもたらすほど高くすることができる。コー​​ドは、この記事を補完するものとして利用可能です。 AFMは、確実にほとんどの組織や細胞のための剛性の範囲をカバーする100未満のPAから10 6 Paの範囲の剛性を、測定することができます。信頼性の高い測定のために、それは試料ウェルの剛性に合わせたバネ定数をAFMカンチレバーを選択することが重要である。カンチレバーが硬すぎる場合には、その偏向を検出するには小さすぎると、細胞を損傷する恐れがあり、カンチレバーが柔らかすぎる場合、それは信頼性の高い材料特性を得るために十分な細胞をインデントされず、その熱振動力曲線を支配することができる。ピラミッド先端の0.06 N / mでカンチレバーが硬い培養皿上で培養したほとんどの種類の細胞に適用されます。これらのカンチレバーは、しかし、上で培養した細胞を測定するためには適用されません柔らかい基板。 図2に示すように、3,000 Paのポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞は3μmでのインデントはカンチレバー12.7 nmの偏向を生成するために必要とされるように柔らかい。力曲線は、事前接点と接触後の領域の間にはほとんど差があるように平坦である。これは、接触点における大きな不確実性、したがってその結果剛性値につながる。柔らかいカンチレバーを使用すると、少しだけ予備接触と接触後の地域間のコントラストを向上させます。測定にそのような柔らかい材料は、大きな球状の先端を持つカンチレバーを推奨します。直径10マイクロメートルの球形の先端が0.06 N / mのカンチレバーは、球状チップで100Paとのカ​​ンチレバーよりも低い剛性を有するサンプルを測定するために適用することができる多くのベンダーから市販されている。彼らはまた、チップレスカンチレバーに接着ミクロスでカスタムメイドすることができます。球状​​の先端を拡大偏向信号を提供し、細胞膜への損傷を防ぐ。 However、彼らは細胞との接触面積が大きいために高解像度の剛性へのマッピングは適用されません。 表1は、細胞剛性測定のために推奨されるAFMプローブのリストを提供します。 <table border="1"><tbody><tr><td> モデル </td><td> バネ定数（N / m）の </td><td> チップタイプ </td><td> 先端半径（NM） </td></tr><tr><td>ブルカーDNP10-D </td><td> 0.06 </td><td>ピラミッド</td><td> 20 </td></tr><tr><td>ブルカーMLCT-B/C/E </td><td> 0.01/0.02/0.03 </td><td>ピラミッド</td><td> 20 </td></tr><tr><td> Novascan PT.GS </td><td> 0.01/0.03/0.06 </td><td>ガラス球</td><td> 2,000 / 5,000 / 10,000 </td></tr><tr><td> Novascan PT.PS </td><td> 0.01/0.03/0.06 </td><td>ポリスチレン球</td><td> 1,000 / 4,500 / 10,000 </td></tr></tbody></table> 表1。SEセルのインデントに適用ばね定数及び先端形状を有するAFMプローブの日課。 提示方法の限界もマークする必要があります。インデントデータに適合するように適用されているヘルツモデルは単純なモデルである。これは、軸対称圧子によって純粋に弾性材料の無限小凹みのため力インデント関係を予測している。ヘルツモデルの仮定のいくつかは、セルのインデントには適用されません。 セルは異機種（ 図3を参照）、非線形弾性である間ヘルツモデルは、均質かつ直線的に弾性材料を想定しています葉状仮足の領域では、それが原因でアクチ​​ン細胞骨格の不均質構造のではなく、不均一である。セルの機械的剛性が比較的均質核周辺領域から取得した三つ以上の力曲線から抽出された平均的な剛性として報告されます。25,36再構成networはアクチンと中間径フィラメントのKSは、ひずみの補強材料である、 すなわち 、それらは、より大きな変形で硬めです。38,39このような非線形弾性を生きた細胞で観察されたが、ヘルツモデルで占めていないされています。報告されたセルの剛性に対する非線形弾性の効果を制限するには、インデントのデータの最初の300 nmのは、ヘルツモデルにフィットされています。 また、材料は純粋に弾性であることをヘルツモデルで仮定される。しかしながら、細胞とその細胞骨格は、測定の時間スケールに依存して剛性を有する粘弾性材料である。短い時間スケールでは、カンチレバーのたわみは、主に細胞の弾性応答から来ている。長い時間スケールでは、しかし、サンプルはcreepsと柔らかいレスポンスを提供します。 AFMの圧痕の時間スケールは、先端速度によって制御される。力曲線は同じインデントVELOで取得されたときしたがって、細胞剛性の違いが観察されたのみ意味があります都市。定量的に細胞の周波数依存粘弾性を抽出するために、AFM &quot;力変調&quot;方式は、より大きな窪み21,27により高周波小振幅振動を印加することによって開発された。 ヘルツモデルで無限の試料の厚さの仮定は、セルには適用されません。細胞は通常、核周辺領域における厚数μmであり、ラメラ地域で数百ナノメートルの厚さである。訂正は、有限サンプルの厚さを考慮して行われました。力マッピングから取得31,40データがインデントデータとセルの高さのデータの両方が含まれています。ローカル試料の厚さは、高さデータから計算することができる。今後の課題は、力マッピングデータに対して分析中のサンプルの厚さの補正を実施する必要がある。 要約すると、本論文ではアサイラムMFP3Dバイオ原子間力MICRを使用して、生きた細胞の機械的剛性を特徴づけるためにプロトコルを提示oscope。 AFMの動作原理とMATLABデータ解析手順は、他のすべてのAFMモデルに適用可能である。近年では、明視野、共焦点顕微鏡、および全反射蛍光顕微鏡（TIRF）を含む光学顕微鏡技術は、機械的刺激に対する細胞のリアルタイムイメージングのためのAFMと組み合わされている。41,42これらのセットアップもの同時測定を可能にする細胞力学と細胞骨格の構成要素のイメージング。地元の細胞骨格成分の分布に局所剛性データを相関させる細胞骨格の成分は細胞力学への貢献方法に洞察力に富んだ情報を提供します。

個々のセルとその周囲の細胞外マトリックスの機械的特性、特に剛性、（ECM）は、細胞増殖、運動性、分裂、分化、および組織の恒常性を含む多くの生物学的プロセスのために重要である。1これは、細胞機械的剛性は、主によって決定されることが実証されているアクチンと中間径フィラメントのインビトロでのネットワーク内で機械的試験から細胞骨格、アクチンと中間径フィラメントとそれらに関連付けられている他のタンパク質の特にネットワーク。2の結果は、セル力学における細胞骨格構造とプレストレスに大きく依存していることを示唆している細胞骨格は。生細胞の3-5剛性は、その後細胞骨格構造6、ミオシン活動7を評価する指標や他の多くの細胞プロセスとみなされている。さらに重要なことは、細胞機械的特性の変化は、しばしば密接associであることが判明している。生細胞の機械的剛性、したがって細胞生理学を監視するための新規な方法を提供することができる8-10監視などの腫瘍の形成および転移などの様々な疾患状態にated;疾患8を検出し、診断、および薬物治療の有効性を評価する11。 、12 粒子トラッキングマイクロレオロジー、13-16磁気ねじれサイトメトリー、17マイクロピペット吸引18,19とmicroindentation 20-22を含む複数の方法は、細胞の弾性を測定するために開発されてきた。粒子追跡のマイクロレオロジー、細胞骨格の内部細胞や基準マーカーに注入されたサブミクロン蛍光粒子のどちらかの熱振動をトレースします。細胞の23弾性と粘性特性が変動-散逸定理を用いて測定された粒子の変位から計算されます。14,23この方法により、地元の同時測定細胞内のさまざまな場所での高空間分解能での機械的特性。しかしながら、細胞に蛍光体粒子を注入して、細胞機能の変化、細胞骨格構造、ひいてはセル力学につながる可能性がある。マイクロピペット吸引法は、ピペット内に細胞膜の小片を吸引する1〜5μmの範囲の直径のマイクロピペットに負圧を印加する。セル剛性が印加された負圧と細胞膜の変形から計算される。18は 、この方法は、しかしながら、セル全体の剛性の不均一な分布を検出することができない。磁気ねじれサイトメトリー（MTC）は、細胞膜に付着超常磁性ビーズ上にトルクを発生させる磁界を印加する。17セルの剛性が加えられたトルクと細胞膜のねじり変形との関係から、この方法で導出される。これは、MTC法における磁気ビーズの位置を制御することは困難であり、またchallengiある高解像度のねじれ変形を特徴付けるためにNG。 Microindentationは、細胞内にパンチするために、明確に定義されたジオメトリーと圧子を適用します。インデント力と細胞内の結果インデントはしばしばヘルツモデルの予測に従ってください。細胞のヤング率は、ヘルツモデルにそれらを適合させることによって力 - 押込み曲線から算出することができる。この方法は、広くそのような接触点決定における不確実性、ヘルツモデルの適用可能性、および物理的に細胞を損傷する可能性として、その限界にもかかわらず、細胞組織の機械的特性をテストするために適用されている。 microindentaion 20のための多くのデバイス間で、原子間力顕微鏡（AFM）で市販されており、広く生体細胞および組織21,24-27の機械的性質を特徴付けるために適用されている。 本論文では、細胞の仕組みを特徴づけるためにアサイラムMFP3DバイオAFMを用いた手順を示しています。 AFMではないでLYは、細胞の高解像度のトポグラフィを提供するだけでなく、広く組織細胞の機械的特性を特徴付けるために適用されている。 AFMのインデントの原理は図1に示されている。 AFMカンチレバーは、上記数マイクロメートルからセルに近づく、カンチレバーの偏向は、予め選択された設定点に到達するように、インデントセルと、前記セルから引き離さ細胞と接触する。 図1に示すように、このプロセスの間、カンチレバーのたわみは、その位置の関数として記録される。セルとの接触を行う前に、カンチレバーは明らかなたわみを含まない培地に移動。細胞、カンチレバーの曲がりや偏向信号が増加するときにインデント。カンチレバーの偏向は、そのセルに適用される力に比例するように、弾性梁としてモデル化される。最大カンチレバーのたわみを設定することにより、試料に加えられた力の最大の大きさをdを避けるために制限される細胞へamage。細胞内への先端インデント図1のCは、ポイントツーポイントBからの力曲線の一部が細胞剛性を抽出するヘルツモデルにフィットされています。 <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> 図1。 AFMのmicroindentationと力曲線の解釈のイラスト。トップパネルには、ピエゾスキャナーによって駆動AFMカンチレバーの動きを示しています。カンチレバーzおよびカンチレバーたわみ信号dの垂直位置は、プロセス中に記録されています。カンチレバーは、セルの上に数マイクロメートルの点から始まる。セルに近づくつつ、先端が細胞に接触したb点に達するまで、試料押込みδはゼロのままである。プロット中のb点の座標が臨界値であるデータ解析のために、（zは0、dは0&gt;）で表される。 BからCへ、カンチレバーインデント細胞へのカンチレバーの偏向は、標的最大インデント力と片持ちバネ定数との比に設定される設定点に達するまで。偏向信号が予め設定された最大値に達すると、カンチレバーは、次いで、細胞からことが多いチップと試料の付着による下方に引っ張られるd点に引き出さセルを返しから電子におけるその最初の位置に切り離される。右側のパネルには、インデントや録画ZとD信号との関係を示しています。左下のパネル上で最大の力はインデントに印加されるように17ナノメートルに設定されているバネ定数が0.07N / mであることが測定されたそのうちの代表的なフォースカーブ、カンチレバーの最大押込み、プロットしたものであるサンプルは1.2 nNのです。インデント時にキー位置がマークされています。

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Atomic Force Microscope </td>
<td>Asylum Research</td>
<td>MFP3D-BIO</td>
</tr>
</tbody>
</table>

measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy

細胞外マトリックス（ECM）の機械的性質は、幹細胞の分化、腫瘍形成、および創傷治癒を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞とECMの剛性の変化は、多くの場合、細胞生理学や組織における疾患の変化の兆しである。したがって、セル剛性が細胞培養の状態を評価するための指標である。細胞および組織の剛性を測定するために適用された多数の方法のうち、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて微小窪みを確実生きた細胞の剛性を測定する方法を提供する。この方法は、広く金属表面から生体軟組織および細胞に至るまで、様々な材料のためのマイクロスケールの剛性を特徴付けるために適用されている。この方式の基本原理は、選択された幾何学的形状のAFMチップで細胞をインデントAFMカンチレバーの曲げから受ける力を測定することである。ヘルツモードに力インデント曲線をフィッティング対応するチップジオメトリのlは材料剛性の定量的測定を与えることができます。本論文では、AFMを用いた生細胞の剛性を特徴づけるための手順を示しています。 MATLABルーチンを使用してAFM校正、フォースカーブ取得のプロセス、およびデータ分析などの重要な手順が示されている。このメソッドの制限事項についても説明します。

図2aは、それぞれプラスチック表面、ヤング率3,000 Paないし17,000 Paでのポリアクリルアミドゲル上で培養した3T3線維芽細胞から採取した3つの代表的な力曲線を示す。注意深く曲線における接点を識別した後、細胞変形の関数としてのインデント力が図2bにプロットされている。 0.3 nNの、3 kPaのポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞にピラミッド形状の先端インデント3マイクロメートルより小さい大きさの力の下で。これとは対照的に、力以上1.6 nNのは、同じチップを使って、プレーン培養皿上に成長したセルに500ナノメートルをインデントするために必要です。それは柔らかいポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞は、硬い培養皿で培養した細胞よりも軟質であることがこのグラフから明らかである。ヘルツモデルに力-δ曲線の最初のセグメント（δ&lt;30 nm）を当てはめると、それぞれ、10 kPaで、1.2 kPaの、そして1.10 kPaのように、これらの3つの細胞のヤング率を与えます。 cultur上の細胞電子料理はポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞の100倍剛性です。ソロンらは同様の結果25を報告している。彼らは、線維芽細胞は積極的に彼らが付着する基板の剛性を一致させるために彼らの細胞骨格を補強することがわかった。多くの他の細胞型も剛性の高い基板30上に培養したとき硬くなることが報告されている。 それはインデントが細胞内で塑性変形を引き起こす可能性があることを注意することが重要です、それは紫の曲線に示すように、キンクを生じる。通常、このような曲線は、データ解析から除外されるべきである。ただし、曲線はまだキンクフィッティングデータの範囲を超えている場合は、セル剛性を計算するために使用することができる。例えば、紫の曲線のキンクは約400 nmで発生します。この曲線は依然として1.2キロパスカルの剛性値を得ヘルツモデルまでしかδまで= 30nmでデータをフィッティングすることによって分析することができる。それは目によると、 &quot;トリガ·ポイント&quot;を調整することも重要であるEサンプル剛性。例えば、青色曲線は3 kPaのポリアクリルアミドゲル上で培養ソフトセルから取り出される。細胞内には5nm、AFM先端インデント3マイクロメートルで相対偏向トリガポイントを設定する。それが破裂細胞膜と細胞を殺すことができるので、そのような大規模なインデントは、セルの剛性測定中に防止する必要があります。力曲線取込中先端速度とデータ取得速度を含む他の多くの要因が、取得したフォースカーブひいてはセル31の剛性が得られるの品質に影響を与えることができる。信頼性の高い測定を行うことは、非線形増大後の接触部に続いて平坦予備接触部を有し、 図2aに示すように、赤色の曲線と&quot;クリーン&quot;フォースカーブを取得するために、すべてのこれらのパラメータを調整する必要がある。 図3aは、細胞培養皿に3T3線維芽細胞からの蛍光画像を示す。セルは、GFPでトランスフェクトされビメンチン中間径フィラメントの一種。 AFMフォースマッピングは、32×32ピクセルの解像度で、80μmの面積でこの80程度で行われている。得られた剛性マップは、 図3bに示されている。剛性は、セル間で異なります。と、葉状仮足領域が硬い核を囲む周囲の核領域より硬く、より不均一である。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497fig2.jpg" /> 図2。力曲線データと、分析力-押込み曲線）ガラス（赤）、17 kPaのポリアクリルアミドゲル（紫色）、および3 kPaのポリアクリルアミドゲル（青）で培養した3T3線維芽細胞に対して取得3つの代表的なフォースカーブデータのセット。曲線は、接触点（zは0、dは0）を座標の原点（0,0）に位置するようにシフトされるシステムB）から計算されたインデント力曲線）とインデントの最初の300nmのを使用してヘルツモデルにインデントデータのフィッティング。 Bにはめ込み）インデントの最初の300nmのためのヘルツモデルへの適合度を示し、円は実験データですが、ラインはフィットデータを表します。カンチレバーのバネ定数は、この場合の0.062 N / mである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50497/50497fig3.jpg" /> 図3。 A）GFPビメンチンでトランスフェクションした3T3線維芽細胞の蛍光画像。セルの一部だけは、画像に表示されます。スケールバーは20μmで同じエリアの。b）は 32×32ピクセルの剛性マップを表します。各画素は2.5μmのを表しています。

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Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

39.8K ビュー.  Worcester Polytechnic Institute. 本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

生物工学

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

要約

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原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

海綿骨の機械的性質を測定するためミリスケール曲げテストシステム

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

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原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

海綿骨の機械的性質を測定するためミリスケール曲げテストシステム