この作品は（なし。0312040付与）マックス·プランク研究所、ドイツ癌研究センター、テュービンゲン大学、BundesministeriumエリーゼBildungウントForschungによってサポートされていました。 私たちは、私たちは、この原稿を注意深く読むための力曲線データと博士ヤコブSuckaleの分析を自動化を支援するためのエドゥアルドヘルマンに感謝します。

サポートされている脂質二重層の調製（SLB）11,12,21 <ol><li>脂質混合物および多層ベシクル懸濁液の調製<ol><li>事前に以下の緩衝液を準備します。 <ol><li> 2.7ミリモルのKClの濃度でPBS緩衝液を調製し、1.5mMのKH 2 PO 4、8ミリモルのNa 2 HPO 4、及び137mMの塩化ナトリウム、pHは7.2。 </li><li> 150mMのNaCl、10mMのHEPES、pHが7.4の濃度で、SLB（サポートされている脂質二重層）バッファを準備します。 </li><li> 1 MのCaCl 2の溶液を調製します。 </li></ol></li><li>所望の濃度でクロロホルム中、次の脂質を溶解：例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）25 mg / mlの、スフィンゴミエリン（SM）で25 mg / mlのコレステロールで（チョル）に10mg / mlで。 </li><li> 2：1 DOPC：SM：Cholをモル比2の総脂質1mgので溶液を作るためDOPCの18.38μL、SMとのChol 11.30μlに17.10μLを取ります。 conceに基づいて、それに応じてボリュームを変化させます1.1.2で調製した脂質のntrations。 2：1 DOPC：SM：Cholを、膜25の位相特性を変化さモル比の変更などが、2のモル比を維持しています。 </li><li>ボルテックスで完全に溶液を混合。一つは、蛍光顕微鏡によって二重層を可視化することを望む場合、0.05モル％の蛍光脂質色素を加えます。 注：長鎖dialkylcarbocyaninesのファミリーを行ったように、DIOとのDiIは波長の広い範囲に及ぶ、理想的には脂質膜を標識するために使用することができます。あるいは、ローダミンホスファチジルエタノールアミンまたはBODIPYコレステロールのような蛍光標識脂質を使用することができます。いずれの場合も、色素の濃度は、脂質に結合した蛍光体の高濃度は、脂質の挙動19を変更できることを念頭に置いて、顕微鏡の設定に応じて最適化する必要があります。 </li><li> N 2ガ ​​ス（または例えばArやHeなどの使用可能な任意の不活性ガス）を使用して、クロロホルムをオフに乾燥させます。 </li><li>さらにドライT彼は、少なくとも1時間真空下で混合物を脂質を含みます。 注：この脂質混合物を保存する場合は、不活性ガスで（N 2、ArやHeを）空気をパージし、-20℃で保存します。小さな茶色のバイアル中に過剰の脂質·イン·クロロホルムを等分。 -20℃で不活性ガスを（N 2、ArやHe）の、店舗の空気を置換する、脂質混合物と同様にして乾燥させます。 </li><li> 10 mg / mlの濃度にPBS緩衝液中で乾燥した脂質を溶解します。 </li><li>ボルテックス1分に約20秒間激しく混合物は、多層小胞を含む、濁った懸濁液を取得します。バイアルの側面に付着しない脂質膜がないことを確認します。 </li><li> 10μlのアリコート（脂質1mgの10アリコートを作る）にこの懸濁液を配布します。 </li><li>さらに使用するまで-20℃で保管してください。 </li></ol></li><li>単層小胞の調製 注：単層小胞のサイズは、様々な超音波処理法、押出法を用いて調製することができます。超音波処理は、Sを使用していますoundエネルギー混合物を攪拌し、多層懸濁液の層を分離します。これは濁った懸濁液の片付けで示されています。押出しは明確な孔径のメンブレンフィルターを通過する多重膜小胞を強制します。 <ol><li>超音波処理法<ol><li>多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。 </li><li> （2ミリリットル）小さなキャップされたガラスバイアルに混合物を移し、パラフィルムで密封します。 </li><li> 10分間、またはそれは小さな単層小胞（直径50 nm以下のSUV車を）得て透明になるまで浴ソニケーター中で室温で混合物を超音波処理。 </li></ol></li><li>押出法<ol><li>多重膜脂質懸濁液を10μlを取り、SLBバッファー150μlを添加します。 </li><li>極低温チューブに懸濁液を移します。 </li><li>液体窒素中で数秒間低温管を浸漬することによって脂質懸濁液をフリーズします。 </li><li>解凍数分間室温または37℃の水浴中で極低温管を浸すことにより、脂質懸濁液。凍結融解工程を少なくとも10回繰り返します。 </li><li>脂質懸濁液を押し出すために、200 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を使用して、商業的押出装置26（他の孔のサイズは、100ナノメートルまたは400ナノメートルのような利用可能です）。 注：現在、2押出機の装置は市販さがあります：マニュアル押出機は、少量（数mlに200μl）を利用可能です。この場合、サンプルは、手動で2つのシリンジ間で前後にサスペンションを押して、膜を通って押し出されます。製造業者によっては、脂質のアリコートをセットアップの最小体積に到達するために結合される必要があります。大きなボリュームの場合（最大50 ml）を、より洗練されたデバイスが使用される懸濁液は、圧縮ガスを用いてポリカーボネート膜を通して押し出されます。セットアップおよび押出条件は、MODに応じて変更することができますエル。使用前にメーカーの説明書を参照してください。このプロトコルは、小容量の手動押出機を指します。 </li><li>押出機に水を通過させることにより、水中の押出機を平衡化。水に膜を浸します。 </li><li> 2ピストン間の膜を配置し、装置を組み立て、一方のシリンジから他に、押出機を介してバッファを通過させることにより、バッファに平衡化。このステップは、さらに、システムの漏れやすさをテストすることができます。それが漏れた場合は、メンブレンを変えるそれを再度分解して組み立て直します。 </li><li>押出機（ &#39;汚い&#39;側）のいずれかの注射器を使用して、脂質懸濁液を取ります。 </li><li> 1室と対向室に空の注射器の脂質懸濁液を含む注射器を取り付けます。 </li><li>一方の端部に注射器を押してください。膜を介して対向シリンジにソリューションを渡します。これは、1 回目のパスです。 </li><li>このような31回の合計のための膜を通って、それを渡します解決策は、対向するシリンジ（「クリーンサイド」）で終わること。 注：押出成形した後、膜を確認してください。それが壊れていた場合には、押出プロセスは成功しなかったと繰り返される必要があります。 </li><li>小さなチューブに注射器を空にします。大型単層小胞（LUVを）は4℃に維持した場合に1〜2日間安定です。 </li></ol></li></ol></li><li>マイカとカバーガラスの作製<ol><li>洗浄は、最初に水で、次いでエタノール中でカバースリップ。空気乾燥。 </li><li>マイカディスクを取り、粘着テープを使用して、外側の層を剥がします。 </li><li>カバーガラス上にマイカディスクを取り付けます。一つは蛍光顕微鏡で二重層を確認できるように透明な光学接着剤が最適です。 </li><li>光学接着剤/グリースを使用したプラスチック製のシリンダーインチ（2.5cm、外径、2センチメートル内径、及び0.5センチ高さ）を取り付けます。すべてが封入されていることと、漏れがないことを確認します。それらは容易に目から取り外すことができるように、シリンダを再利用したいときにグリースを使用Eのカバーガラスと洗浄。プラスチックシリンダーの寸法は、AFMのカンチレバーホルダーの大きさに依存し、それに応じて調整されるべきです。 </li></ol></li><li>固体支持体上の単層小胞の沈着<ol><li>ピペットでマイカ上に直接全体リポソーム溶液。 300μLの体積に到達するために、よりSLBバッファを追加します。 </li><li> 3ミリモルのCa 2+の最終濃度に達するように1 M塩化カルシウム溶液の0.9μLを加えます。 </li><li>少なくとも10分間、2分間37℃でインキュベートし、次いで65℃で。常に緩衝液で二重層をカバーしています。空気と気泡との接触は、それを破壊します。必要に応じてインキュベーションの間に、より高い温度でインキュベートする場合は特に、より多くのバッファを追加します。 注：インキュベーション温度は、必要な脂質混合物との相に応じて変化します。少なくとも10分間のインキュベーション時間が支持された二分子層​​を形成するために必要とされるが、それは、温度及び組成に応じて、長くなる可能性があります。 </li><li>ウォッシュカルシウムと融合していない小胞を除去するためのホット（65°C）SLBバッファーで二重層15-20回。バッファの下に二重層を維持するために、洗浄工程の間に特別な注意を取り、そっと二重層を壊さないように洗浄溶液をピペット。 </li><li> AFM測定前に室温に支持された二分子層​​を冷却します。これは、膜の異なる相を形成するだけでなく、機器の熱ドリフトを最小化するために必要とされます。 </li></ol></li></ol> 2.原子間力顕微鏡の測定11,12 <ol><li>イメージング 注意：接触モードまたはタッピングモードで原子間力顕微鏡イメージングを実行します。溶液中の画像支持された二分子層​​;これが二重層を破壊するように溶液が完全に蒸発することはできません。一つは、バッファで作業されるように、任意のAFM部が液体流出から保護されていることを確認することで安全上の注意事項を守ってください。 <ol><li>柔らかいカンチレバーを選択します（N 0.2以下/ m個のばね定数をお勧めします）とtにマウント彼AFM。カンチレバー剛性の選択は、力分光法のためのより重要である（これについては後述します）。 </li><li> AFMステージにサンプルをマウントし、すべての振動分離モジュールがオンになっていることを確認してください。平衡化し、システムの熱ドリフトを低減するために、少なくとも15分間待ちます。 AFMのセットアップに応じて、チューニングおよびイメージング仕様が異なる場合があります。メーカーのハンドブックを参照してください。 </li><li>接触するまで、AFMチップを試料にアプローチ。 </li><li>脂質二重層は、通常、高さが4 nmであるため、最高のz解像度（例えば1.5μm）を与える器具のZ範囲を使用しています。 </li><li>画像の領域を選択します。脂質二重層の概要を取得するには、50ミクロン×50ミクロンまたは25ミクロン×25​​ミクロンの領域は、画像への良い出発点になります。小さい特徴が表示された場合は、小さな領域内の1つの缶の画像（10ミクロン×10ミクロン、または2ミクロン×2ミクロン）。撮像領域の選択は、作業rに依存します圧電スキャナのアンジュ。このため、機器のマニュアルを参照してください。 </li><li>二重層は非常に壊れやすいように、試料との接触を維持しながら、熱ドリフトを最小限にし、正しい力を維持するために撮像中にAFMチップのセットポイントを調整します。接触モードでは、設定値を最小にします。タッピングモードでは、設定値を最大化します。 </li><li>多項式レベリング機能への各走査線に当てはめることにより、プロセスイメージ。 AFM製造会社の独自のソフトウェアを使用して膜との接触を失うスキャンの行の削除を実行します。 </li></ol></li><li>フォーススペクトロスコピー<ol><li>製造業者のプロトコルに従って指示に従って、カンチレバーを校正。キャリブレーションは、フォトダイオードの電気信号の変換は（ 図1B）を強制することができます。 <ol><li>ボルトのZピエゾ（長さの単位）の移動の代わりに電気信号としてたわみを測定するために、先端の感度を調整します。 <bR /&gt;注：AFMは、カンチレバーの背面で反射されたレーザを用いて、カンチレバーのたわみの変化を検出します。レーザは、空間的にレーザスポットの位置を検出することができるフォトダイオードに達します。それは、サンプルとの接触時に曲がるようにカンチレバーのたわみの変化は、「垂直偏向」としてこのフォトダイオードによって検出され、これは電圧の単位です。カンチレバーは、Zピエゾによって移動されるので、垂直偏向をzピエゾの動きに関連しています。垂直偏向およびZ移動の間の比率は、感度と呼ばれ、距離に電圧を変換します。 </li><li>通常、AFMソフトウェアに組み込まれた熱雑音周波数法を用いてカンチレバーのバネ定数を計算します。この方法では、パワースペクトル密度のプロットを作成する、発振周波数に対するノイズの振動の振幅をプロットします。このプロットは、共振周波数付近のピークが表示されます。周波数、振幅I最大の共振周波数であるです。自動的にソフトウェアによってバネ定数を計算するために、ピークの周りにローレンツ関数を取り付けます。熱雑音の方法論のためにいくつかの有用なリソースを参照27-30に示されています。 </li></ol></li><li>二層の領域を画像化した後、力分光法を実行するために二層に5ミクロン×5ミクロン領域を選択します。 </li><li>それは、その領域の16×16のグリッドに力曲線となるように、AFMを設定します。これは、地域ごとに256の力曲線になります。隣接する二つの点の間の空間は、1ポイントプローブさの膜面積は次のポイントと一致することを回避するのに十分であるべきです。これは、先端半径に依存しています。 2点間の100 nmの距離が理想的であろう。 16×16のグリッドに5ミクロン×5ミクロンの領域に分割します。相の大きさに応じて、1つは、より小さなまたは大きな領域を選択し、それに応じてグリッドサイズを調整することができます。 </li><li>に設定し、Zピエゾ変位400 nmの。これは、zピエゾの最大移動範囲を決定します。それは、カンチレバーが完全に測定値間にサンプルから離れて後退していることを確認してくださいするのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li> 800 nmの/秒にアプローチ速度を設定し、200 nmの/秒の速度を撤回。二層組成物及び6,16を検討する脂質相に応じて400〜6,000 nmの/秒の間の接近速度を使用します。 </li><li>すべてのパラメータを設定した後、AFMソフトウェアの「実行」ボタンを押すことによって、力曲線を取得します。 </li><li>高さ曲線（Zピエゾの動きの測定値）対力として力曲線を保存します。これは、アカウントにするとき、試料と接触しているカンチレバーの曲がりを取ることはありません。データ処理ステップの間、AFMソフトウェアは、二層の厚さのために適切な値を与えるチップと試料の分離曲線（ 図1C）、対力を得るために曲げカンチレバーの補正を可能にします。補正値は、通常calibrに組み込まれています各力曲線と一緒に保存されているエーション、。ある時点で、ピエゾ動きから垂直偏向を減算することにより、先端と試料との分離を計算します。 注：アプローチ力​​曲線のピークは（カンチレバーの動きがアプローチサイクルに残っている場合でも、力の値がダウンする）膜の画期的な力である、このピークの位置と点の位置との差ながら、力が再び上昇し始めるところ、膜の厚さを提供します。 </li><li>良好な統計情報を取得する条件ごとに、少なくとも500の力曲線を取得します。起源か、MATLABなどのプログラムを使用して値のヒストグラムをプロットし、分布のピークと幅を取得するためにガウス分布にヒストグラムをフィット。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy:+Application+to+Biology+and+Technology.">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li><li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+of+biological+complexes:+What+can+we+learn.">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li><li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes.">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Bar&#243;, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes.">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li><li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating.">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li><li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy.">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li><li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+.">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. .</a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li><li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics.">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane.">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Caba&#241;as, M. E., Teresa Montero, M., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases.">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes.">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li><li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers:+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation.">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li><li>Butt, H. -. J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory.">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601 (2002).</li><li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy.">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li><li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide:+a+combined+AFM+and+FCS+study.">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li><li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes.">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide:+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM.">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li><li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+future+of+scanning+probe+microscopy:+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques,+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques.">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Systems,+Lipid+Rafts,+and+Cell+Membranes1.">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li><li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafts+defined:+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function.">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li><li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

DOPCから成るのSLB：SM：Cholを（2：2：1）塩化カルシウムにより誘導される小胞の吸着および破裂後雲母上に形成されました。この脂質組成物は、L dとLのO相に分離しました。 LのO相は、スフィンゴミエリンとコレステロールに富むとL D相 11未満の流体/より粘性（ 図1A）です。 LのD相からL Oの分離は、周囲（ 図1B、C）<...

原子間力顕微鏡（AFM）は、非常に鋭い先端を有するカンチレバー1を用いて、試料の領域を横切って走査することにより、表面の画像を生成します。カンチレバーの動きは、試料の表面形状をプローブ。液体2-5に空気やネイティブに近い状態で固定したサンプルを分析することで、その汎用性のために、タンパク質、DNA、および膜を含む- AFMは、広く生体分子に適用されています。 別にナノメートルの範囲内の高解像度の撮像能力から、AFMカンチレバーは、相互作用力（粘着力と反発力）と、試料5,6の機械的特性を調べるために、ばねとして作用します。これは、力分光法として知られています。このモードでは、プローブは、最初のサンプルに近づき、それに力を及ぼし、それはサンプル（ 図1A）との接触を失うまで、後退します。生成された曲線は、アプリの両方のためのカンチレバーの距離の関数としての力を見せますゴキブリと後退。弾性率を含むいくつかの特性は、材料の硬さを測定し、そして接着力を導出することができます。 サポートされている脂質二重層は、固体支持体の上に横たわっている生体モデル膜である-通常マイカ、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス、またはシリコン7を酸化しました。これらは、小胞の沈着、ラングミュア-ブロジェット法及びスピンコーティング8,9のような様々な技術を用いて調製されます。 AFMイメージングは、これらのサポートされている二重層10の形成は、次のとおりと異なる組成物11〜15の膜によって形成された異なる構造を探査するために使用されています。 アプローチ曲線のピークに支持された二分子層​​の結果に力分光法を行います。このピークは、二重層を貫通するのに必要な力を示しており、画期的な力と呼ばれています。二重層の厚さはまた、力曲線6を用いて測定することができます。二重層の代表的な画期的な力NN 6 1-50の範囲。これらの特性は、脂質充填（液体またはゲル相）と構造（アシル鎖長及び不飽和度）に依存し、膜活性剤16によって変更します。破裂の背後にある理論は、17を説明したが、そのようなカンチレバー柔らかさ、先端半径と接近速度などの他の実験パラメータも画期的な力15,16,18に影響を与えます。力分光法は、膜21の安定性に、異なる脂質相11,19、ペプチドのような組成的変化12,20、ならびに他の生体分子の効果の特性を分析するために使用されてきました。 サポートされている二重層のオリエンテーションフラットは、より良い構造および膜の性質を特徴づけるために、表面プラズモン共鳴、蛍光顕微鏡22と11,19等の他の方法でAFMを組み合わせるために有利で ​​す。 この詳細なビデオプロトCOLは、小胞の沈着を使用してサポート脂質二重層を調製し、AFMおよび力分光法を用いてそれらを分析することを意図しています。様々なサイズの小胞は、二重層を調製するために使用することができるが、このプロトコルは、小規模および大単層ベシクルに焦点を当てています。相が液体注文（L 0）と液体無秩序（L d）が相に分離支持された二分子層は11,15を特徴づけました。 2：1の比率で膜を2にジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、スフィンゴミエリン（SM）、およびコレステロール（Cholで）から構成されています。この組成物モデルタンパク質輸送および選別、細胞シグナリングおよびその他の細胞プロセス23,24のための重要なプラットフォームとして動作するように提案されている脂質ラフト、。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), 88%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), &#62;99%</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 24x60 mm, 1mm thickness</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>2355036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica blocks</td>
			<td>NSC Mica Exports Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&#160; Always handle mica with gloves or tweezers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch and Die Set</td>
			<td>Precision Brand Products, Inc</td>
			<td>40105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA 88</td>
			<td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Equipment Grease</td>
			<td>Borer Chemie AG</td>
			<td>Glisseal N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome Extruder</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>LiposoFast-Basic</td>
			<td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Bandelin Sonorex Digitec</td>
			<td>DT-31</td>
			<td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Nitride AFM Cantilever&#160;</td>
			<td>Bruker AFM Probes</td>
			<td>DNP-10</td>
			<td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>JPK</td>
			<td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

DOPCからなるサポートされている脂質二重層：SM：チョル（2：2：1）AFMで画像化した（ 図2 AC）。ための脂質組成物、SM / CholをリッチL oおよび DOPCリッチL d の相が観察されました。 AFM画像から高さプロファイルは、膜構造に関する重要な情報を提供することができます。高さプロファイルを見ることによって、二層の厚さを提供することができる膜（ 図2B）?...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K ビュー.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

ビデオ: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

生物工学

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...