This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

細胞培養のための1.準備<ol><li>ヒト細胞の市販の株式を購入します。 注：このプロトコルは、HCT116結腸直腸癌および初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）を利用します。 </li><li> HCT116の培養のための500ミリリットルの媒体を作る：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ 7.5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した高グルコース培地。 </li><li> HRPTECの培養物を500 mlの培地を加える：5％FBS、1％の上皮細胞成長サプリメント、1％P / Sを補充した上皮細胞培地。 </li><li> 140mMのNaClを、3のKCl、10mMののNa 2 HPO 4、15mMのKH 2 PO 4：1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の500ミリリットルを準備します。 pHを7.4に調整し、121℃で40分間オートクレーブで滅菌します。 </li></ol>細胞培養の2開始<ol><li>慎重トンを乱すことなく、80〜90％のコンフルエント皿から培地を吸引彼は細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 90秒間4000×gで15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に剥がれた細胞を転送します。 </li><li>完全DMEM 1ml中に再懸濁細胞ペレット。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を計測します。 100mMの細胞培養皿は、1cm 2あたり約2,500〜5,000細胞の初期播種密度を達成するために必要とされるどのように多くの非発熱性及びポリスチレン計算します。 </li><li>ステップ30から45分間、37℃の水浴中で1.2または1.3で行われたプレ暖かい完全な細胞培養培地。 </li><li> 70％エタノールを含む培地ボトル細胞バイアルを除染。この点から前方すべて操作は無菌的に行われるべきです。 </li><li>ステップ2.6で述べた播種密度内で凍結細胞のボリューム全体を使用するために必要な限り多くの100mmの細胞培養皿にアリコート完全DMEM 6ミリリットル。 </li><li> 100mm培養皿のそれぞれに、ステップ2.6で算出された細胞懸濁液の量を転送します。均等にプレートの表面上に細胞を分配するために、手動で各プレートを揺らし。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター内でシードされた100ミリメートル細胞培養皿を置きます。細胞は、次のステップの前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 3.継代<ol><li>細胞集密度の割合（皿の面積をカバー％細胞）を決定するために、顕微鏡下で各細胞培養皿を表示します。インキュベーターとプリ暖かい完全培地および1×PBSに細胞を返します。細胞は、80から100までパーセントのコンフルエントであれば次のステップに進みます。 </li><li>慎重に乱すことなく、使用済み培地を吸引各培養皿中の細胞。 </li><li>アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。 </li><li>各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン-EDTAの3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの間に、多くの培養皿にアリコート完全培地10mlを1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために必要とされます。 </li><li>細胞がプレートから剥離したら、すぐに1×定義されたトリプシンインヒビターの3ミリリットルを追加し、穏やかにトリプシンEDTAの全てが中和されていることを確認するために、1分間の皿を旋回。 </li><li>無菌の15mlの遠心管に剥がれた細胞を移し、脇に置きます。残りの細胞を収集し、同じ15ミリリットルの遠心管にそれを転送するために皿にPBS 1×3ミリリットルを追加します。 </li><li> 150 XGを遠心分離して細胞をペレット化5分間。 </li><li>上清を吸引し、完全培地3mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>血球計を用いて細胞を計数し、1cm 2あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために完全培地15 mlを含むの150mm培養皿に播種。各キャップ結合アッセイのための2つの150ミリメートルを使用してください。 注：液体培地を介して細胞への酸素の拡散は、ボリューム36に依存しています。懸濁液中の接着細胞や細胞を使用するかどうかの実験の間で一貫性のメディアの容量を維持することが推奨されています。メディアが拡散でこれらの変動性を回避するために、（議論で説明したように24時間のワークステーションでインキュベート）予め調節することができます。 </li><li> 5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーターで播種し、培養皿を置きます。細胞は、次のステップに進む前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。 </li></ol> 4. Physioxic露出<ol><li>顕微鏡下で細胞を見ます。 BESのためのトンの結果は、細胞が24時間の暴露70〜80％コンフルエント、48時間の暴露50〜60％コンフルエント、および72時間の暴露40〜50％コンフルエントであることを確認してください。 </li><li>所望の時間（24、48、または実験に応じて72時間）のための低酸素ワークステーションにセルを配置します。 </li><li>適切なphysioxiaにワークステーションを設定します。 注：たとえば、3％O 2設定は、5％のCO 2および92％N 2を伴うことになります。 注：ダイナミックレンジ内の酸素変動が機器内に特定のタイムライン、プログラムのスケジュールを超える希望するか、手動で任意の間隔で酸素の設定を調整している場合。 </li><li> 60％の湿度を設定します。ワークステーションの雰囲気は、それにもかかわらず、非常に乾燥している、とメディアが著しく長い実験（&gt; 48時間）の間に蒸発します。 （メディアは、ワークステーションの雰囲気で平衡化されるように）細胞培養DISのメディアを補充するためにワークステーション内の細胞培養フラスコ内のメディア予約を保ちます彼は。 注：溶存酸素は大気中の酸素36と均衡するような（例えば、PBSおよびトリプシンEDTAなど）、溶解前に細胞と相互作用する任意のソリューションは、低酸素ワークステーション内で使用する前に24時間事前に調整されなければなりません。 </li><li>溶解するまでワークステーション内の細胞を保管してください。 </li></ol>キャップ結合アッセイ5.準備バッファ<ol><li>調製1×トリス緩衝食塩水（TBS）。 <ol><li> dH 2 Oの800ミリリットルで、8.76グラムのNaClおよび6.05グラムトリス塩基を溶解します。 </li><li> 1 M HClを用いて7.4の最終pHに対する解決策をもたらします。 </li><li> dH 2 Oを使用して、1リットルに最終容量を持参</li></ol></li><li>非変性溶解バッファーを準備します。キャップ結合アッセイの日を緩衝溶解準備します。空白のアガロースビーズとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ（7.9および7.13ステップ）を洗浄するために余分な溶解バッファーを作成します。 <ol><li> dH 2 Oの7ミリリットルで、160μlの5 MのNACを追加リットル、160μlの1 Mトリス塩酸pH7.4の、40μlの200mMのNaFを、40μlの1 MのMgCl 2、および40μlの1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム。 </li><li> 7ミリリットル溶液にイゲパールの40μLを加えます。それは非常に粘性があるようイゲパルを取得支援するためにピペットの先端をカットします。 </li><li>イゲパルの全てが溶解するまで、ピペッティング、またはボルテックスによって7ミリリットルの溶液を混ぜます。 </li><li> 8ミリリットルの溶液の最終容量を上げ、氷上に保ちます。 </li></ol></li><li> 4xのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEサンプルバッファーを準備します。 <ol><li>ビーカーに、16ミリリットルの1MのTris-HCl pHが6.8、12.64ミリリットルグリセロール、および8ミリリットルジチオスレイトール（DTT）を組み合わせます。 </li><li> SDSの3.2グラムとブロモフェノールブルーの0.16グラムを追加します。粉末が完全に磁気攪拌棒を混合することにより溶解させます。 </li><li> -20℃で1.5 mlマイクロチューブに小分けし、店舗。 </li></ol></li></ol> 6.細胞溶解<ol><li>非変性溶解緩衝液を準備し、氷の上で目の日を保ちます電子キャップ結合アッセイ。 </li><li>前加温1×PBSと30分間37℃の水浴中でトリプシン。 </li><li>各キャップ結合アッセイ1.5 mlマイクロ遠心チューブに溶解緩衝液のアリコート980μlを行っています。 </li><li>溶解緩衝液980μlに、4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩および100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを10μlの10μLを加えます。氷の上に保管してください。 </li><li>低酸素ワークステーション内の廃棄物容器内の各150ミリメートル皿からメディアを破棄します。 </li><li>暖かい1×PBS 3-4 mlの細胞を洗浄し、液体のすべてを捨てます。 </li><li>各皿に暖かい0.05％トリプシンEDTAの1ミリリットルを加え、2分間、または細胞がもはやプレートに接着されるまで放置します。 </li><li>ピペットを用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1プレートの細胞を移します。必要に応じてセルの各プレートが別々の1.5mL微量遠心管に転送されるように繰り返します。 </li><li> 90秒tの6000×gで1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを遠心O細胞をペレット。 </li><li>ペレットを乱すことなくピペットを用いてトリプシンを吸引します。ペレットを1.5 mlのマイクロ遠心チューブは、90秒間6000×gで再遠心分離、乱された場合。 </li><li>優しくちょうどペレット上記チューブに200μlのPBSをピペットで暖かい1×PBSで細胞を洗浄。再び遠心分離し、ペレットを乱されている場合。 </li><li>ペレットを乱すことなくPBSを吸引します。 </li><li> 1ミリリットルからピペット500μlを最初に携帯ペレットに溶解緩衝液を調製しました。ピペッティングにより完全にペレットを再懸濁。 </li><li>第二の細胞ペレットに再懸濁された細胞を組み合わせて、上下にピペッティングすることにより、第2のペレットを再懸濁。すべてのペレットを合わせ、各サンプルのために再懸濁されるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブに溶解バッファーの残りの500μlの溶解液を兼ね備えています。 </li><li>低酸素ワークステーションからのサンプルを削除します。 注：溶解緩衝液を添加した後、LL以降の工程は、低酸素ワークステーションを37℃に設定し、次のステップは、冷（4℃または氷上で）実行されるべきであるよう、周囲空気中で実施されます。 </li><li>溶解1.5-2時間、4℃でサンプルを回転させることにより、穏やかな攪拌を使用して細胞。 </li><li>細胞破片を除去するために、4℃で15分間12,000×gで溶解した細胞を遠心します。 </li><li>新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移し、ペレットを捨てます。 </li><li>将来のウェスタンブロット分析のための全細胞溶解物の入力制御として使用される上清の一部（5~10％）を予約します。 </li></ol> 7.キャップ結合アッセイ<ol><li>各サンプルについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを分離するために、ブランクアガロースビーズ制御スラリー50μlのとγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズスラリー50μlのを転送します。ビーズスラリーの収集を容易にするために、ピペットの先端を除去するために、はさみを使用してください。 </li><li>ビーズbをペレットyが30秒間500×gでスラリーを遠心分離します。 </li><li>慎重に上清を除去し、TBS500μlのビーズを再懸濁します。 </li><li>繰り返しは、7.2と7.3を繰り返します。 30秒間500×gでビーズをペレット化し、上清を除去します。 </li><li>空白のアガロースビーズを含む1.5 mlマイクロチューブにステップ6.19からの溶解物を含有する上清を移します。 注：空白のアガロースビーズは非特異的にビーズと相互作用する溶解物からタンパク質を除去するためのプレクリアステップとして機能します。 </li><li>穏やかに攪拌しながら4℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、ブランクのアガロースビーズをペレット化。 </li><li> γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブにライセートを移します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離し、supernaを廃棄することによりビーズをペレット化し、溶解緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、ブランクアガロースビーズを洗浄タント。 5回の洗浄の合計のために、この4回繰り返します。 </li><li> 1×SDS-PAGEサンプル緩衝液中でブランクアガロースビーズを再懸濁し、そして95℃で90秒間のビーズを沸騰させます。将来のウェスタンブロット分析のために-20℃で保存は、目的のタンパク質は、ビーズに非特異的に結合するかどうかを観察しました。 </li><li>キャップ結合タンパク質を捕捉するために4℃で1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズと溶解液をインキュベートします。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。上清を捨てます。 </li><li>ステップ7.9を繰り返して、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズを洗ってください。 </li><li>溶解緩衝液600μlの中でビーズを再懸濁します。 </li><li> 1mMの最終濃度にGTPを加えます。 </li><li> 4°Cで1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズ+ 1 mMのGTPをインキュベートします。注：このを非特異的（ すなわち、非メチル化GTPとの相互作用）は、m 7 GTPと相互作用するタンパク質の関連付けを解除します。 </li><li> 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル7 GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。 </li><li>新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、4×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）の200μLを加えます。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でのGTPコントロールサンプルを保管してください。ステップ7.9を繰り返してビーズを洗浄します。 </li><li> 1×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）中でビーズを再懸濁し、90秒間、95℃で沸騰します。将来のウェスタンブロット分析37のために-20℃でメートル7 GTP結合画分を保管してください。 </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers.">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery.">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li><li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy.">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation.">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li><li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation:+the+impact+of+ambient+oxygen+availability.">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li><li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers.">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394 (2002).</li><li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hypoxia. , (2001).</li><li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi's+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling.">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium:+assumptions+and+pitfalls.">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1:+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E.">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li><li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+(eIF4G)+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E.">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li><li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 &#39;キャップのためのこれらの因子の親和性がm 7 GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を?...

翻訳制御は、特に細胞ストレス1の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E（のeIF4E）の結合を伴う開始の律速段階（メートル7 GTP）のmRNA 2の5 &#39;キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは3リボソームの募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10％が1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5&#39;UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に5-8となっています。 様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1（mTORC1）の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質（4E-BP）の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2（または4EHP）という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP 11のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G 12との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス6,13の間にそれらの3 &#39;UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する（HIF）2α、またはeIF4F H 6,13との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 14と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M 7 GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ 20として、S.ポンベ 21は 、Dは 22 ショウジョウバエ 、およびCは 23 エレガンス 。 証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理24に関与することを示唆しています。 （微小電極を介して測定）（キャピラリー端で）または組織内の組織への酸素供給は、脳25で2から6パーセントから変化し、肺26内の百分の3から12まで、腸27、4％でで3.5から6パーセント肝臓28、腎臓29内の7から12までパーセント、筋肉30で4％、および骨髄31で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3％未満の酸素32を含んでいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F H </suP&gt;積極的に生理学的な酸素または「physioxia」24に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育33を駆動し、細胞は、一般physioxia 34においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。 ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は35（1または2分）生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル7 GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:380px;">&#947;-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads</td>
			<td style="width:151px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:165px;">AC-1555</td>
			<td style="width:205px;">Agarose-linked m7GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>877222</td>
			<td>10-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm culture dish</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>130183</td>
			<td>15-cm culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AEBSF Hydrochloride</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0356829</td>
			<td>AEBSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose Beads</td>
			<td>Jena Bioscience&#160;</td>
			<td>AC-0015</td>
			<td>Agarose bead control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP112-25</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>1210-00S</td>
			<td>Used to centrifuge small volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495970C</td>
			<td>Used in culturing primary cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined trypsin inhibitor</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>R007100</td>
			<td>DTI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreital</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172-25</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epithelial cell medium (complete kit)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4101</td>
			<td>Includes serum and growth factor supplements)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Guanosine 5&#39;-triphosphate, 1 mL</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>272076-0251M</td>
			<td>GTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 colorectal carcinoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td>Human cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human renal proximal tubular epithelial cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-010</td>
			<td>HRPTEC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone DMEM/High Glucose</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Standard media for human cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Antibiotic component of DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H35 HypOxystation</td>
			<td>Hypoxygen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Hypoxia workstation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Igepal CA-630</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2198596</td>
			<td>Detergent component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monopotassium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5299-100</td>
			<td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disodium phosphate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5369-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail (100 x)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>58715</td>
			<td>Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56508</td>
			<td>Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td>Component of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>2500-067</td>
			<td>Trypsin used to detach adherent cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

メートル7 GTPアフィニティーカラムでのeIF4EとeIF4E2の酸素に応答したキャップ結合能の解析 Fのigure 1及び結腸直腸癌において、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）（： 図1および2は、2つのヒト細胞株中での酸素の変動に応じて二つの主要なキャップ結合タンパク...

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K ビュー.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

ビデオ: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

遺伝学

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.