このプロトコルは、個々のヒト小胞体細胞の高スループット転写データを生成し、アノクロム細胞の異種性の研究、希少細胞タイプの同定、疾患における遺伝子調節に使用することができる。この手法は、より大きなスケールの単一セルデータを生成し、使いやすく、処理時間がかなり短い。この方法は、他の種からの小島に適用され、他の新たに単離された組織をプロファイルすることができます。
しかし、プロトコルは、組織固有の解離手順に合わせて最適化する必要があります。高品質の解体細胞を準備することが重要です。.単一セル分割前の細胞懸濁液のQCが重要であり、エマルジョンを慎重かつ迅速に処理している。
チップが詰まっているかどうかを知るようないくつかの品質のチェックポイントは、読み取りよりもよく見られます。ヒトの小島を得て一晩インキュベートした後、P200ピペットを用いて200~300個の小島をカウントし、ハンドピックする。5ミリメートルの完全な小島培地を含む15ミリメートルの円錐管に島を移し、摂氏37度に予め温めます。
チューブを200回Gの遠心分離機に2分間置きます。底部のペレットを邪魔することなく、上清を優しく吸引します。1ミリメートルの予熱セル解離液を加え、上下に軽くピペット処理してペレットを破壊します。
37°Cで9〜11分間、小島をインキュベートします。3分ごとにピペットを10秒間ゆっくりと上下させ、細胞を単一細胞に解約する。小子細胞が十分に解約され、溶液が曇ったら、完全な小子培地9ミリリットルを加え、30マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して新しい15ミリリットルの円錐管にフィルターを加えます。
5分間Gの400倍で遠心分離により細胞を回収する。上清を吸引し、1X PBS 04%BSA溶液の200〜300マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。今度は、10マイクロリットルの細胞培養液を0.5マイクロリットルのAO/DAPIと混合する。
ピペットを上下にして完全に混ぜます。スライドに10.5マイクロリットルをロードし、蛍光ベースの自動セルカウンターで細胞数アッセイを実行して、カウントと生存率を決定します。マイクロ流体チップをチップケースに入れる。
チップケースの向きを変え、油田が実験を行う人に最も近い位置に位置することを確認します。ピペットを使用して、計算された細胞の体積を準備されたチューブストリップに追加します。5回混合するピペット。
ピペットチップを捨てずに、90マイクロリットルの細胞混合物をチップの1つを漕ぐ。30秒間待ってから、ピペットを非常にゆっくりとピペットに入れて、40マイクロリットルのゲルビーズを2行にロードします。270マイクロリットルの分割オイルを3行目の井戸に分配します。
チップホルダーのタブにチップガスケットをフックします。組み立てたチップホルダーをシングルセルの分割デバイスに入れ、実行ボタンを押します。実行が完了したら、ホルダーからチップガスケットを取り出し、チップケースを45度の角度で開き、100マイクロリットルのエマルジョンをチップから青いプラスチック65ウェルプレートのウェルに移します。
ピンクエマルジョンの125マイクロリットルを各エマルジョンに割り込む試薬を分配する。1分間待ってから、各ウェルの全容を各0.2ミリリットルチューブに移します。チューブストリップに透明な層とピンクの層があることを確認してください。
ピペットを使用して、透明な層を乱すことなく、チューブストリップの底部からピンク層の125マイクロリットルを取り除きます。ピンク層の約15マイクロリットルの少量がチューブに残るのは正常です。その後、各チューブストリップに200マイクロリットルのクリーンアップミックスを加え、室温で10分間インキュベートします。
チューブストリップを磁気スタンドに移し、2分間待って溶液をクリアします。上清を取り除き、廃棄します。その後、80%エタノールでビーズを2回洗います。
ビーズを1分間乾燥させます。マグネットからチューブストリップを取り外し、ビーズに溶出液を35.5マイクロリットル加えます。ピペットは溶液中のビーズを再中断し、室温で2分間インキュベートする。
チューブストリップを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。精製した相補DNAをチューブストリップから0.2ミリリットルのチューブストリップに移します。相補的DNAを増幅するには、まず各サンプルに65マイクロリットルの相補的DNA増幅マスターミックスを加える。
チューブストリップをサーモサイクラーに入れ、原稿に従ってプログラムを実行します。サンプルは摂氏4度で最大72時間保存できます。相補DNAを15のアナグラムおよび20マイクロリットルに正常化した後、30マイクロリットルのタグメンテーションミックスを氷上の各相補DNAサンプルにアリコートした。
サンプルをサーモサイクラーに入れ、タグメントプロトコルを摂氏55度で55分間実行し、摂氏10度に減少して保持します。その後、サンプルインデックスPCRマスターミックスの60マイクロリットルと20マイクロモルフォルレゴールサンプルインデックスの10マイクロリットルを30マイクロリットル精製相補DNAサンプルに追加します。最終ライブラリ製品を増幅するために、チューブをサーモサイクラーに戻します。
各サンプルを水で1マイクロリットル当たり2ナノグラムに正規化し、正規化された各サンプルの3マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに一緒に引っ張ります。溶出バッファーを持つ希釈プールをマイクロリットル当たり 0.25 ナノグラムにします。希釈プールサンプルの12マイクロリットル、1つの動物またはDNA制御の1マイクロリットル、溶出緩衝液の2マイクロリットル、および5マイクロリットルの通常の水酸化ナトリウムを組み合わせることによってプールを変性させる。
混合物を5分間インキュベートし、pH8で200ミリモルトリスの10マイクロリットルを加え、混合物の4.05マイクロリットルをHTA-1の1345.95マイクロリットルにロードします。次に、シーケンサーのカートリッジに1.3ミリリットルをロードし、シーケンシングレシピを使用してメーカーのガイドラインに従って実行します。コンピュータで、セル Ranger を実行して、FASTQ ファイルのシーケンス処理によって生成された生のベースコールファイルを多重化解除します。
FASTQファイルをヒトb37.3ゲノムアセンブリに合わせ、CSC遺伝子モデルを使用して発現定量を得る。バーコードランクプロットを調べて、セルに関連するバーコードと背景が確実に分離されていることを確認します。細胞の品質を制御するには、検出された遺伝子が500未満、一意の分子識別子の総数が3,000未満、生存率スコアが0.2未満の細胞を除外します。
組織と細胞の種類に応じてカットオフを調整します。次に、Rパッケージmclustを使用して、複数のホルモン遺伝子を発現する細胞を除去する。Rパッケージseuratを使用して、遺伝子発現を一意の分子識別子の合計で正規化し、細胞レベルで10,000のスケール係数を掛けます。
そして、全ての細胞の平均発現と分散を用いて可変遺伝子を検出する。組織と細胞の種類に応じてカットオフを調整します。可変遺伝子を用いて主成分解析を行う。
選択した数の主成分を含むセルをクラスター化します。1つの細胞クラスターを残りの細胞と比較して、細胞クラスターを富化した遺伝子を導き出す。この単一細胞RNAシーケンシングプロトコルにおいて、獲得したヒト小島は、まず、RNA蛍光およびC2ハイブリダイゼーションにおいてαおよびβ細胞によって検証された解水解除した。
分割ステップに続くエマルジョンの成功例は、ゲルビーズから分離された最小の分配油を有する均一な淡い、曇りの溶液を示す。対照的に、ゲルビーズとオイルの間で明確な相分離を伴う品質の悪いエマルジョンは、チップの実行中に詰まりが原因である可能性があります。相補的なDNA増幅後、代表的な断片サイズ分布は、1,000~2,000塩基対付近に存在する良好な品質の相補DNAサンプルの典型的なピークを示す。
600塩基対付近のスパイクは、小海口相補性DNAに特異的であった。RNAシーケンシングライブラリの断片サイズ分布は300から500塩基対の間であった。クラスタリング分析では、T分散確率的近傍埋め込み寸法の空間に12種類の細胞が含まれるものが明らかになった。
アルファ細胞では3つのサブ集団、ベータ細胞では4個が明らかになった。この技術により、研究者はヒト島の包括的な細胞小島を構築することができます。非糖尿病および糖尿病ドナーからのより多くのデータで、それは治療標的発見のための資源のために使用される。
