This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

注：栄養膜前駆細胞へのhESCまたはhiPSCsのいずれかの分化のために、マウス胚繊維芽細胞（MEF）上に成長したhPSCsをフィーダーを含まないために、2つの通路のための条件をBMP4 / A / Pと分化を開始する前に遷移されます。このプロセスは、分化した細胞のMEF汚染を排除します。ここでは、hESCの分化のためのプロトコルを提供し、同じプロトコルをhiPSCsに適用することができます。 1.照射マウス胚線維芽細胞上のhESCの文化と回復（のMEF）（準備） <ol><li> MEFののガンマ線照射 <ol><li> 10％FBS、2mM L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM、及び0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）のMEFを培養するための培地500mlを加えます。 </li><li>一次のMEFの1つのバイアルを解凍し、細胞を培養するためのMEF培地を使用します。 MEF培地を用いて30プレートに一次のMEFを展開します。 注：酸素濃度はそう、このステップのために重要ではありませんインキュベータ内の生理学的（4％）または周囲（20％）の条件のいずれかを使用することができます。 </li><li> MEFSを収穫。プレートからのMEFを削除し、コニカルチューブに細胞を転送するために0.25％トリプシンを使用してください。照射機器にのMEFを置き、3500グレーに細胞をさらします。 注：時間の量は、照射ユニットの内部ソースの活性に依存します。 </li><li> MEF培地を照射したMEFを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li>遠心分離機を使用したMEFをペレット化し、50％のMEF培地と培地を凍結50％の細胞（80％FBS、20％MEF培地）を加えます。アリコート1バイアルあたり1×10 6個の細胞。 </li><li>一晩-80℃の冷凍庫で照射MEFバイアルを置き、その後、長期保存のために液体窒素に転送します。 </li></ol></li><li> 文化のために凍結したMEFおよびヒトES細胞を解凍 <ol><li> 20％血清REPLACを含むDMEM / F-12：hESCの培地500mlを作りますement、0.1mMのNEAA、2mMのL-グルタミン、10ng / mLのbFGFを、0.1 mMのSSメルカプトエタノール、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン。 </li><li>ヒトES細胞を解凍する前に、MEFを1日1バイアルを解凍します。各ウェルは1 mlで使用し、0.1％ゼラチンでコート6ウェルプレートを、。室温で少なくとも20分間インキュベートし、その後、ゼラチンを削除します。 </li><li>液体窒素中で貯蔵からのMEFのバイアルを取り外し、37℃の水浴中でバイアルを浸します。唯一の小さな氷の結晶が残るまで断続的にバイアルをご覧ください。迅速に15ミリリットルコニカルチューブ内のMEF培地の9ミリリットルにバイアルの内容を転送します。 </li><li> 5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。上清を吸引除去し、MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 6ウェルプレート上に均等にしたMEFを等分。一晩37℃の低酸素（4％）インキュベーターにプレートを置きます。 </li></ol></li><li> MEFの上のhESCのルーチンの文化 <ol><li>液体窒素からのhESCバイアルを取り外し、すぐに3を使用して、バイアルを解凍7℃の水浴。ゆっくりのhESC媒体の9ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブにヒトES細胞をピペットし、5分間、200×gでスピンダウン。培地を除去し、ヒトES細胞培地1mlで細胞を懸濁します。 </li><li>ステップ1.2.4で製造したプレートからMEF培地を吸引し、ヒトES細胞培地の1ミリリットルを追加します。ヒトES細胞培地にROCK阻害剤Y-27632（10μM）を追加します。 MEFの上にヒトES細胞を転送します。 </li><li>一晩37℃で低酸素（4％）インキュベーターにセルを配置します。毎日のhESC媒体を交換してください。 4Xで正立顕微鏡下で可視化パスツールピペットを用いて分化した細胞を削り取ります。 </li><li>パサージュヒトES細胞ごとに4-6日、細胞集密度とhESCコロニーの大きさに応じて。継代前日のMEFのプレートを準備します。細胞は継代に準備ができているときは、hESCの培地を除去し、1mlのPBSでよく洗います。 </li><li> 1mg / mlのコラゲナーゼを追加します（37℃に予熱した）、37℃で5分間インキュベートし、コラゲナーゼを除去します。 WPBSで細胞をアッシング、ウェル当たりのhESC培地の1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。新しいMEF-コーティングされたウェル（複数可）に懸濁細胞塊を転送します。 </li></ol></li></ol>フィーダーなしに条件を細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上のMEFからのhESCの2推移<ol><li> 準備MEF馴化培地（CM） <ol><li>百分の90から100までの集密度でT75フラスコ中で照射したMEFをプレート。のMEFが密にメッキされることが重要です。彼らは、フラスコの底部に取り付けられているかどうかを判断するために顕微鏡を用いて細胞を観察し（MEFをメッキまたは翌日以降、約6時間を添付します）。 注：顕微鏡を用いて観察したときに未結合細胞が培地中に浮遊します。翌日、MEF培地を除去し、B-FGFを欠くのhESC培地25mlを追加します。 </li><li>インキュベーションの24時間後に馴化培地を収集します。 12日の最大のために毎日新鮮な培地と交換してください。 </l私&gt; <li> 0.22μmのフィルターを用いて収集したCMをフィルタリングします。使用前に、CMに新鮮なB-FGFを追加します。 注：CMは、-80℃で凍結し、最長1年間保存することができます。また、4℃で2週間CMを格納します。 </li></ol></li><li> トランジションのMEF上で培養物からヒトES細胞は、無フィーダーする細胞外マトリックスでコーティングされたプレートを。 <ol><li>被覆組織培養プレートのための細胞外マトリックスの調製<ol><li>氷（約3-4時間）に、細胞外マトリックスのアリコートを解凍します。氷冷DMEM / F-12の24ミリリットル中に氷のように冷たいヒント、1冷たい、50ミリリットルコニカルチューブ、およびDMEM / F12培地、細胞外マトリックスの転送に2mgを使用した（希釈は、サプライヤーからの細胞外マトリックスの濃度に依存します）。 </li><li>直ちに氷上に50ミリリットルを円錐管に移し、4℃で保存。被覆組織培養プレートのために、ウェルに希釈し、細胞外マトリックスの適切な量を追加する（例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり1ml）中。プレートをコーティングするために旋回し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。 </li></ol></li><li> B-FGF（10 ngの/ ml）を含むCMを使用して（ステップ1.3のように）のMEFからの通路のhESC。 <ol><li>吸引し、新しいプレートから細胞外マトリックスを削除して、B-FGFを含むCMを追加します。ピペットを用いて、MEFプレートから掻き取り、携帯塊を移し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに、それを分取。一晩37℃での低酸素インキュベーターでインキュベートします。 </li><li>毎日のB-FGF媒体とCMを交換してください。培地の量は、培養フラスコの大きさに依存するであろう。 6ウェル1のために2mlの培地を使用してください。パスツールピペットで分化した細胞を削り取ります。 </li><li>通路hESCを顕微鏡で見たときにコロニーが明るいごとに6-7日、。 注：細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上で増殖したhESCコロニーは、MEF培養細胞よりも大きくなります。 </li><li>無フィーダー細胞が通過に準備ができたら、培地を除去し、広告によって洗いますPBSを除去するために、ピペット、吸引を使用してPBSの丁1mlを、追加の0.5mg / mlのディスパーゼピペットを用いて（37℃に予熱）、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>ウェルあたり2mlのPBSを添加し、その後吸引することにより、PBSで細胞を洗浄。ウェルあたりのCMの1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。 </li><li>プレートの新しい細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに中断し、細胞塊。細胞は24時間後に接着する必要があります。 </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / Pを使用したhESCの3分化<ol><li>分化培地を準備します。利用CM（欠けているB-FGF）と（新鮮）BMP4（50 ngの/ ml）を、A83-01（1μM）、およびPD173074（0.1μM）を追加します。使用前にCMにこれらの阻害剤を追加します。 </li><li> 4％の酸素で設定したインキュベーター内部の培養1通過のための細胞外マトリックス被覆プレート上で増殖するフィーダーなしのhESCを、使用してください。細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に最初に通過した後、細胞は24時間添付してみましょう。次の日、分化を開始。 （B-FGFを含む）のCMを削除し、BMP4 / A / P（6ウェルプレート中のウェル当たり2ミリリットル）を含むCMと交換してください。 4％の酸素濃度を用いて細胞を培養することを続けます。 </li><li> BMP4 / A / Pを含むCM（2ミリリットル/ウェルのための6ウェルプレート）2日毎に交換してください。吸引し古い培地を除去し、ピペットを用いて、新しいCMを追加します。 B-FGF（考え分化2日目）のBMP4の追加や削除後の第2日目に、細胞の形態は顕微鏡を用いて観察したときに大きく表示されて、変更されます。 注：明るい丸い縁を呈する未分化細胞は、存在しません。 </li><li>希望の時点で細胞を収集します。分化した細胞は、約2週間後に分裂を停止します。この期間中にトランスフェクト細胞（次のセクションを参照）。 </li></ol> siRNAまたはプラスミドDNAと絨毛細胞の4トランスフェクション<ol><li> トランスフェクションのための栄養膜細胞を準備します </強いです&gt; <ol><li> MEFのからそれらを転送した後、細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。 </li><li> 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度はそれほど細胞1を分割し、重要です。低酸素インキュベーター中で一晩細胞をインキュベートします。 注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。 </li><li>次の日は、分化培地で培地を交換してください（CM 6ウェルプレートのためミリリットル/ウェルBMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く、2を使用して）。吸引によって古い培地を除去し、ピペットを使用して、新しい培地（2ml）に移します。一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）で細胞を置きます。 </li></ol></li><li> トランスフェクション遺伝子破壊のためにsiRNAを使用するか、プラスミドDNAを用いて <ol><li>希望のタイムまで、細胞を分化（1日目と14の間）のポイント。トランスフェクションの前日に、5分間、0.05％トリプシンを用いて細胞をトリプシン処理します。ゼラチンコートプレート上に所望の密集度（トランスフェクション試薬プロトコルに応じて）にそれらをプレート（除去するために20分を吸引するための組織培養プレートに0.1％のゼラチンを追加します）。 （B-FGFを欠く）BMP4 / A / Pを含むCMを追加し、一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、細胞に新鮮な分化培地を追加します。 siRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトするsiRNA。プラスミドDNAの場合は、適切なリポフェクタミン試薬を使用しています。 </li><li>各トランスフェクション試薬について説明したように、製品のプロトコルに従ってください。低酸素インキュベーターで一晩細胞を、各ウェルの細胞/プレートにsiRNAをリポフェクタミン複合体を移し穏やかに混合し、文化。 注：一部のトランスフェクション試薬は、CMがペニシリン/ストレプトマイシンを欠いている必要が抗生物質によって阻害されています。 </li><li>翌日、新鮮な分化培地と交換してください。 </li><li>願望で細胞を収穫Dの時点（ 例えば、24時間、48時間、および72時間）定量的RT-PCRを用いて遺伝子破壊効率を確認します。収穫細胞については、ウェル当たり1ミリリットルを添加し、37℃で5分間インキュベートし、0.05％トリプシンを使用します。トリプシンを中和するためにウェルあたりMEF培地の5ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、RNA単離のために細胞ペレットを使用します。 </li></ol></li></ol>絨毛細胞の5病原体感染：仙台ウイルス感染<ol><li> 分化のためにヒトES細胞を準備します <ol><li> MEFのからの転送後の細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。 </li><li> 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度は、そのように分割セル1が重要です。低酸素インキュベーター（4％酸素）で一晩細胞をインキュベートします。&lt;BR /&gt;注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。 </li><li>翌日、一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）に分化培地（CM BMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く）と文化で培地を交換してください。 </li></ol></li><li> 栄養膜細胞の仙台ウイルス感染 <ol><li>ある日、希望分化日の前に、5分間、0.05％トリプシンを用いて、（単一細胞）に分化する細胞をトリプシン処理し、ゼラチンコートプレートに移します。分化培地を追加し、低酸素インキュベーターで一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、感染のための培地を追加（これは、ウイルスによって異なります）。 6ウェルプレートの1ウェル0.5 mlで使用し、BMP4 / A / Pを含むペニシリン/ストレプトマイシンを欠く使用CM。 MOIは、低酸素インキュベーター中で8時間、1インキュベートを=のためにセンダイウイルスを追加します。 </li><li>追加の時点が必要な場合は、4時間後にウイルス含有培地を除去し、BMP4 / A / P CMと交換してください。細胞を回収RNA単離のために細胞スクレーパーを使用して。 </li><li>ウイルス応答18に関与する遺伝子のための定量RT-PCRを行うことにより、ウイルス感染の効率を決定します。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕?...

胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの1で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。 胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞5に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限1になるようEVTsとのSYNを生成する初期分化事象は、胎盤形成に必須です。開発されてきた人間の栄養膜細胞株の種類は胎盤ホルモンを産生のCTBと絨毛を、不死化および浸潤特性6を表示することを含みます。人間の妊娠第一期の胎盤を単離することができるが、細胞はすぐにDIFから初代栄養膜細胞ferentiateおよびin vitroで増殖して停止します。重要なことには、形質転換された、一次細胞株は、腫瘍形成および不死化栄養膜細胞株は、正確に一次栄養膜7を表していない可能性があることを示し、異なる遺伝子発現プロファイルを有します。さらに、これらの行は、それらが三学期を介して第1の後段に由来しているため、胎盤トロホブラスト幹細胞前駆体に似ている可能性は低いです。 胎盤の形成と機能の初期事象を研究するために、初期段階のヒト栄養芽細胞の体外培養系における堅牢なの必要性があります。着床前胚の内部細胞塊と特性を共有するヒト胚性幹細胞（hESC）は、しばしば早期胎盤の形成を含む、初期のヒトの発生をモデル化するために使用されます。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）およびヒトES細胞の両方は、骨モルを用いてインビトロで栄養芽細胞に分化させることができますphogenicタンパク質4（BMP4）8、9、10、11、12、13、14、15。 BMP4を使用して栄養膜細胞への多能性細胞のこの変換は、人間の細胞に特異的であり、それは初期ヒト胚9、16へのアクセスを必要としないため、広く初期のヒト胎盤の発達を研究するために使用されます。最近、SMAD2 / 3及びMEK1 / 2シグナル伝達経路を遮断する阻害剤A83-01（A）およびPD173074（P）の添加は、栄養外胚葉様前駆細胞、主にSYNのにHPSCの分化の効率を高めることが発見されました中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞9の大規模な発生がなく、EVTs、17 </suP&gt;。これらの培地条件を用いて、12日間分化ヒトES細胞は、ヒト胚盤胞段階の胚から単離された栄養外胚葉細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを有しており、種々の胎盤特異的成長ホルモンを分泌し、in vitroモデル系9、11本の妥当性を支持します。ここでは、BMP4 / A / P培地を用いて、ヒト栄養芽前駆細胞へのhPSCsのインビトロ分化のための詳細なプロトコルを提示します。これらの条件は、リポフェクション媒介性トランスフェクションを用いたRNA配列、siRNAを用いた遺伝子破壊、病原体感染、遺伝的改変を含む、多種多様な用途のための細胞の過剰数を生成します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>This is referred to as &#34;serum replacement&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-FGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>6001G</td>
			<td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i low oxygen incubator</td>
			<td>Heracell/VWR</td>
			<td>89187-192</td>
			<td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD173074</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3044/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol is used to isolate total RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365779001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>This is referred to as &#34;extracellular matrix&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。

hPSCsのインビトロ分化の概要このインビトロ分化プロトコルは、1の通路（ 図1A）のための無フィーダー条件に移行されたMEF上で増殖させた未分化ヒトES細胞から始まります。私たちはこのプロトコルでhESCの分化を説明したが、我々が正常絨毛細胞にhiPSCsを区別するために、このプロトコルを使用し...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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8.5K ビュー.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

発生生物学

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and iPSCs) across various lineages remain. Numerous differentiation protocols have been developed, yet variability across cell lines and low rates of differentiation impart challenges in successfully implementing these protocols. Described here is an easy and inexpensive means to enhance the differentiation capacity of PSCs. It has been previously shown that treatment of stem cells with a low concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) significantly increases the propensity of a variety of PSCs to differentiate to different cell types following directed differentiation. This technique has now been shown to be effective across different species (e.g., mouse, primate, and human) into multiple lineages, ranging from neurons and cortical spheroids to smooth muscle cells and hepatocytes. The DMSO pretreatment improves PSC differentiation by regulating the cell cycle and priming stem cells to be more responsive to differentiation signals. Provided here is the detailed methodology for using this simple tool as a reproducible and widely applicable means to more efficiently differentiate PSCs to any lineage of choice.

Generating differentiated cell types from human pluripotent stem cells (hPSCs) holds great therapeutic promise but remains challenging. PSCs often exhibit an inherent inability to differentiate even when stimulated with a proper set of signals. Described here is a simple tool to enhance multilineage differentiation across a variety of PSC lines.

DMSOを用したヒト多能性幹細胞の一過性治療による分化を促進

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical movement. The architecture of the NMJ structure influences the functions of the neuron, the muscle and the mutual interaction. Previous studies have reported many strategies by co-culturing the motor neurons and myotubes to generate NMJ in vitro with complex induction process and long culture period but have struggled to recapitulate mature NMJ morphology and function. Our in vitro NMJ induction system is constructed by differentiating human iPSC in a single culture dish. By switching the myogenic and neurogenic induction medium for induction, the resulting NMJ contained pre- and post- synaptic components, including motor neurons, skeletal muscle and Schwann cells in the one month culture. The functional assay of NMJ also showed that the myotubes contraction can be triggered by Ca++ then inhibited by curare, an acetylcholine receptor (AChR) inhibitor, in which the stimulating signal is transmitted through NMJ. This simple and robust approach successfully derived the complex structure of NMJ with functional connectivity. This in vitro human NMJ, with its integrated structures and function, has promising potential for studying pathological mechanisms and compound screening.

Here we provide a protocol to generate in vitro NMJs from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). This method can induce NMJs with mature morphology and function in 1 month in a single well. The resulting NMJs could potentially be used to model related diseases, to study pathological mechanisms or to screen drug compounds for therapy.