Name: in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
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This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

HINWEIS: Für die Differenzierung von hES entweder oder hiPSCs in trophoblast Vorläufern, hPSCs auf embryonale Fibroblasten Maus gezüchtet (MEF) werden nicht umgestellt Zubringer freien Bedingungen für zwei Passagen vor Differenzierung Initiierung mit BMP-4 / A / P. Dieses Verfahren beseitigt die MEF Kontamination von differenzierten Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll für HES-Differenzierung, und das gleiche Protokoll kann zu hiPSCs angewendet werden. 1. Kultur und Gewinnung von hES-Zellen auf Bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) (Vorbereitung) <ol><li> Gamma-Bestrahlung von MEFs <ol><li> Machen 500 ml Medium zur Kultivierung der MEFs: DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA). </li><li> ein Fläschchen mit primären MEFs auftauen und MEF Medium verwenden für die Kultivierung von Zellen. Erweitern Sie die primären MEFs auf 30 Platten mit MEF Kulturmedium. HINWEIS: Sauerstoffkonzentrationen für diesen Schritt nicht kritisch sind, soentweder physiologische (4%) oder Umgebungs (20%) Bedingungen innerhalb des Inkubators verwendet werden. </li><li> Ernten Sie die MEFS. Verwenden 0,25% Trypsin die MEFs von den Platten zu entfernen und die Zellen in ein konisches Röhrchen übertragen. Legen Sie die MEFs in einem Bestrahlungsinstrument und setzen die Zellen zu 3500 Graustufen. HINWEIS: Die Zeit auf der Aktivität der Quelle innerhalb der Bestrahlungseinheit abhängen. </li><li> Resuspendieren der bestrahlten MEFs mit MEF Kulturmedium und zählen die Anzahl der Zellen, die eine Zählkammer. </li><li> Pellet die MEF unter Verwendung einer Zentrifuge und 50% MEF Kulturmedium hinzufügen und 50% Zellgefriermedium (80% FBS und 20% MEF Kulturmedium). Aliquot 1 x 10 6 Zellen pro Fläschchen. </li><li> Legen Sie die bestrahlten MEF Fläschchen in einem -80 ° C Gefrierschrank über Nacht, und übertragen sie dann in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung. </li></ol></li><li> Auftauen gefrorenen MEFs und hESCs für Kultur <ol><li> Machen Sie 500 ml hES-Medium: DMEM / F-12 mit 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-Glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-Mercaptoethanol und 1x Pen / Strep. </li><li> ein Fläschchen von MEFs 1 Tag auftauen, bevor Sie die hESCs Auftauen. Mantel eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine, unter Verwendung von 1 ml für jede Vertiefung. mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend die Gelatine zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie ein Fläschchen mit MEF aus Lagerung in flüssigem Stickstoff und tauchen Sie die Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad. Sehen Sie sich das Fläschchen mit Unterbrechungen, bis nur noch kleine Eiskristalle bleiben. Schnell wird der Inhalt des Fläschchens zu 9 ml MEF Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen bei 200 · g für 5 min zentrifugiert. Den Überstand aspirieren und resuspendieren in MEF Medium, welches das Zellpellet. Aliquot der MEF gleichmäßig auf eine 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht. </li></ol></li><li> Routine Kultur von hES auf MEFs <ol><li> Entfernen eines hESC Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und schnell das Fläschchen tauen unter Verwendung eines 37 ° C Wasserbad. Pipette vorsichtig die hES in einen 15 ml konischen Röhrchen 9 ml hES-Medium mit und Spin bei 200 xg für 5 min nach unten. Entfernen Sie das Medium und Resuspendieren der Zellen mit 1 ml hES-Medium. </li><li> Saugen Sie das MEF Medium aus der in Schritt hergestellten Platte 1.2.4 und 1 ml hES-Medium. In Rock-Inhibitor Y-27632 (10 &amp; mgr; M) an die hESC Medium. Übertragen Sie die hESCs auf MEFs. </li><li> Legen Sie die Zellen in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht. Ersetzen Sie die hESC Medium täglich. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteurpipette unter einem aufrechten Mikroskop mit 4x sichtbar gemacht. </li><li> Passage die hESCs alle 4-6 Tage, abhängig von der Zelle Konfluenz und der Größe der HES Kolonien. Bereiten Sie eine Platte von MEFs am Tag vor Passagierung. Wenn die Zellen bereit Passage sind, entfernen Sie die hESC Medium und waschen Sie die Vertiefung mit 1 ml PBS. </li><li> 1 mg / ml Kollagenase (vorgewärmt auf 37 ° C), bei 37 ° C für 5 Minuten, und entfernen Sie die Kollagenase. WAsche, die Zellen mit PBS, 1 ml hES-Medium pro Vertiefung, und kratzen Sie manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette. Übertragen Sie die suspendierten Zellklumpen in eine neue MEF-beschichtete Vertiefung (en). </li></ol></li></ol> 2. Übergang von hES von MEFs auf Feeder freien Bedingungen auf Extrazellulärmatrix beschichteten Platten <ol><li> Bereiten Sie MEF - konditioniertem Medium (CM) <ol><li> Platte, die die bestrahlten MEFs in einem T75-Kolben bei 90-100% Konfluenz; es ist wichtig, dass die MEFs dicht überzogen werden. Beachten Sie die Zellen mit einem Mikroskop, um festzustellen, ob sie mit dem Boden des Kolbens befestigt sind (MEFs befestigen etwa 6 Stunden nach der Plattierung oder am nächsten Tag). HINWEIS: Unattached Zellen in dem Medium schwimmen, wenn mit einem Mikroskop beobachtet. Am nächsten Tag, entfernen MEF Medium und 25 ml hESC Medium ohne B-FGF. </li><li> Sammeln Sie das konditionierte Medium nach 24 Stunden Inkubation. Ersetzen mit frischem Medium täglich für maximal 12 Tage. </li&gt; <li> Filtern des gesammelten CM unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor der Verwendung frischer B-FGF zum CM hinzuzufügen. HINWEIS: CM kann für bis zu 1 Jahr bei -80 ° C aufbewahrt und eingefroren werden. Alternativ speichern Sie die CM bei 4 ° C für 2 Wochen. </li></ol></li><li> Der Übergang der hES von Kultur auf den MEFs auf Feeder-freie extrazelluläre Matrix beschichteten Platten. <ol><li> Herstellung der extrazellulären Matrix für die Beschichtung von Gewebekulturplatten <ol><li> Tauen Sie eine aliquote Menge von extrazellulären Matrix auf Eis (ca. 3-4 h). Mit eiskalter Tipps, ein kaltes, 50 ml konischen Röhrchen und DMEM / F12-Medium, Transfer 2 mg der extrazellulären Matrix in 24 ml eiskaltem DMEM / F-12 (hängt die Verdünnung auf die extrazelluläre Matrix Konzentration vom Lieferanten ). </li><li> Unmittelbar übertragen die 50 ml konischen Röhrchen auf Eis und lagern bei 4 ° C. Für die Beschichtung von Gewebekulturplatten, fügen Sie die entsprechende Menge an verdünnten extrazellulären Matrix auf die gut (zB 1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well - Platte). Swirl zur Beschichtung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde. </li></ol></li><li> Passage hESCs von den MEFs (wie in Schritt 1.3) unter Verwendung von CM-FGF enthält, B (10 ng / ml). <ol><li> Aspirieren die extrazelluläre Matrix aus der neuen Platte zu entfernen und fügen Sie CM B-FGF enthält. Übertragen Sie die geschabt Zellklumpen aus dem MEF Platte mit einer Pipette und Aliquotierung es in die extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte. Inkubieren in der 37 ° C mit niedrigem Sauerstoff Inkubator über Nacht. </li><li> Ersetzen Sie das CM mit B-FGF Medium täglich; die Menge des Mediums auf der Größe des Kulturflasche ab. Verwenden Sie 2 ml Medium für eine 6-well gut. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteur-Pipette. </li><li> Passage hESCs alle 6-7 Tage, wenn Kolonien hell sind, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet. HINWEIS: hESC Kolonien auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten gewachsen wachsen größer als MEF-kultivierten Zellen. </li><li> Wenn der Feeder-freien Zellen der Passage fertig sind, entfernen Sie das Medium, waschen von adding 1 ml PBS mit einer Pipette, absaugen mit der PBS zu entfernen, mit 0,5 mg / ml Dispase (vorgewärmt auf 37 ° C) mit einer Pipette, und 5 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS durch Zugabe von 2 ml PBS pro Vertiefung und Aspirieren danach. 1 ml CM pro Vertiefung und kratzen manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette. </li><li> Platte um die suspendierten Zellklumpen in neue extrazelluläre Matrix beschichteten Platten; Die Zellen sollten nach 24 Stunden einzuhalten. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Differenzierung von hES Mit BMP4 / A / P <ol><li> Bereiten Sie das Differenzierungsmedium. Verwenden CM (fehlende B-FGF) und fügen Sie (frisch) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 &amp; mgr; M) und PD173074 (0,1 uM). Fügen Sie diese Inhibitoren an das CM vor dem Gebrauch. </li><li> Verwenden Feeder freie hESCs wächst auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten für 1 Passage, kultiviert innerhalb einem Inkubator bei 4% Sauerstoff eingestellt. Nach dem ersten Durchgang auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten,lassen sich die Zellen für 24 Stunden befestigen. Am nächsten Tag initiieren Differenzierung. Entfernen Sie die CM (mit B-FGF) und ersetzen Sie es mit CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Weiter Kultivierung der Zellen unter Verwendung von 4% Sauerstoffgehalt. </li><li> Ersetzen Sie das CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte) alle 2 Tage. Absaugen das alte Medium zu entfernen und neue CM mit einer Pipette hinzu. Am zweiten Tag nach BMP-4 und Entfernen von B-FGF (als Differenzierung Tag 2) Zugabe wird die Morphologie der Zellen zu ändern, erscheinen größer, wenn mit einem Mikroskop beobachtet. HINWEIS: undifferenzierte Zellen, die helle runde Kanten aufweisen, die nicht vorhanden sein wird. </li><li> Sammeln Zellen zu gewünschten Zeitpunkten. Differenzierte Zellen stoppt nach etwa 2 Wochen zu teilen. Transfizieren Zellen während dieser Zeit (siehe nächster Abschnitt). </li></ol> 4. Transfektion von Trophoblastzellen mit siRNAs oder Plasmid-DNA <ol><li> Bereiten Sie trophoblastic Zellen für die Transfektion </strong&gt; <ol><li> Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix, nachdem sie von den MEFs übertragen (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF. </li><li> Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, aufgeteilt, so dass die Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in der sauerstoffarmen Inkubator. HINWEIS: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF, unter Verwendung von 2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte). Entfernen Sie das alte Medium durch Absaugen und übertragen das neue Medium (2 ml) mit einer Pipette. Platzieren Sie die Zellen in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff) über Nacht. </li></ol></li><li> Transfektionen siRNAs mit für Genin oder unter Verwendung von Plasmid - DNA <ol><li> Differenzieren der Zellen, bis die gewünschte ZeitPunkt (zwischen den Tagen 1 und 14). Am Tag vor der Transfektion trypsinize die Zellen 0,05% Trypsin für 5 min mit. Platte an die gewünschte Konfluenz (je nach Transfektionsreagenz protocol) auf einen mit Gelatine beschichteten Platte (mit 0,1% Gelatine auf eine Gewebekulturplatte für 20 min und aspirieren zu entfernen). In CM enthält, BMP-4 / A / P (fehlende B-FGF) und über Nacht inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag, fügen Sie frische Differenzierungsmedium zu den Zellen. Transfektion von siRNAs eine siRNA Transfektionsreagenz verwenden. Für Plasmid-DNA, verwenden Sie ein geeignetes Lipofectamin Reagenz. </li><li> Folgen Sie dem Produkt-Protokoll wie für jede Transfektionsreagenz beschrieben. Übertragen Sie die siRNA-Lipofectamin-Komplexe in jede Vertiefung / Platte von Zellen, vorsichtig mischen und Kultur die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator. HINWEIS: Einige Transfektionsreagentien durch Antibiotika gehemmt werden, die CM erfordern Pen / Strep fehlt. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen mit frischen Differenzierung Medien. </li><li> Ernten Sie die Zellen auf den Wunschd Zeitpunkten (zB 24 h, 48 h und 72 h) , um die Genin Effizienz mittels quantitativer RT-PCR zu überprüfen. Zum Ernten von Zellen verwenden 0,05% Trypsin, Zugabe von 1 ml pro Vertiefung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. 5 ml MEF Medium pro Vertiefung um das Trypsin zu neutralisieren. Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min und verwenden Sie das Zellpellet zur RNA-Isolierung. </li></ol></li></ol> 5. Pathogen-Infektion von Trophoblastzellen: Sendai-Virus-Infektion <ol><li> Bereiten Sie hESCs zur Differenzierung <ol><li> Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix nach der Übertragung von der MEF (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF. </li><li> Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, so geteilte Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff). &lt;br /&gt; Hinweis: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF) und Kultur über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff). </li></ol></li><li> Sendai Virus-Infektion von Trophoblastzellen <ol><li> Einen Tag vor der Differenzierung Tag gewünscht, trypsinize die differenzierenden Zellen (auf einzelne Zellen) unter Verwendung von 0,05% Trypsin für 5 min und übertragen sie auf eine mit Gelatine beschichtete Platte. In Differenzierungsmedium und Inkubation über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag hinzuzufügen Medium für Infektion (das auf dem Virus variieren je). Verwenden CM fehlt Pen / Strep enthält, BMP-4 / A / P, unter Verwendung von 0,5 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. In Sendai-Virus für MOI 1. Inkubation für 8 h in einer sauerstoffarmen Inkubator =. </li><li> Wenn zusätzliche Zeit-Punkte notwendig sind, entfernen Sie das Virus enthaltenden Mediums nach 4 h und ersetzen Sie es mit BMP-4 / A / P CM. Sammeln Zellenfür die RNA-Isolierung mit einem Zellschaber. </li><li> Bestimmen Sie die Effizienz der viralen Infektion , indem qRT-PCR für Gene , die in der viralen Reaktion beteiligt 18. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir präsentierten die grundlegenden Schritte zur hESCs in trophoblast Vorläufern unterscheiden. Dieses Protokoll wurde kürzlich optimiert, um schnell hESCs mit der Zugabe von Activin / Nodal Signalisierungs Inhibitoren unterscheiden, die Differenzierung zu trophoblastische Zellen zu erhöhen und die Erzeugung von Mesoderm Progenitoren vermeiden, die mit BMP4 Behandlung werden in der Regel allein beobachtet. Das BMP-4-Modell-System ermöglicht die Prüfung der frühesten Stadien der menschlichen Trophoblasten Linie Sp...

Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen 1, 2, 3, 4 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereignisse des Säugetierembryo. Sie ergeben sich aus den äußeren extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste. Unser Wissen über die frühen Phasen der Entwicklung der Plazenta wird durch ethische und logistische Einschränkungen begrenzt auf frühe menschliche Entwicklung zu modellieren. Während der embryonalen Implantation Trophoblastendringen in das mütterliche Epithel und unterscheiden sich in spezialisierte Vorläuferzellen 5. Cytotrophoblasten (CTBs) sind einkernigen, undifferenzierten Vorläufern, die in Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen invasive Trophoblasten (EVT), die Anker, die Plazenta in die Gebärmutter verschmelzen und zu differenzieren. SYNs werden, terminal differenzierte Zellen mehrkernige, die Hormone notwendig für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu synthetisieren. Die frühe Differenzierung Ereignisse , die EVTs und SYNs erzeugen , sind von wesentlicher Bedeutung für Plazentabildung, wie Beeinträchtigungen in Trophoblastzellen in einer Fehlgeburt führen, Präeklampsie und intrauterine Wachstumsrestriktion 1. Die Typen der humanen Trophoblasten - Zelllinien , die entwickelt wurden , umfassen CTBs und Chorionkarzinome verewigt, die 6 Plazentahormone und Anzeige invasiven Eigenschaften herzustellen. Primäre trophoblastic Zellen aus menschlichen ersten Trimenon Plazenten isoliert werden können, aber die Zellen schnell difzieren und stoppen in vitro vermehren. Wichtig ist , transformiert und primären Zelllinien unterschiedliche Genexpressionsprofile haben, was darauf hinweist , dass tumorerzeugend und trophoblast immortalisierte Zelllinien nicht genau primäre Trophoblasten 7 darstellen. Darüber hinaus sind diese Linien unwahrscheinlich, dass der Plazenta Trophoblasten Stammzellen Vorläufern ähneln, weil sie von einer späteren Phase ersten bis dritten Trimester abgeleitet werden. Es besteht ein Bedarf für ein robustes in vitro Kultursystem im Frühstadium menschlichen Trophoblasten , um die frühen Ereignisse der Plazentabildung und Funktion zu untersuchen. Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die Eigenschaften mit der inneren Zellmasse des preimplantation Embryo zu teilen, werden häufig zur Modellierung der frühen menschlichen Entwicklung, einschließlich der Bildung der frühen Plazenta verwendet. Beide menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und HES - Zellen können in Trophoblasten in vitro differenziert werden unter Verwendung von Knochen Morphogenic Protein 4 (BMP - 4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Diese Umwandlung von pluripotenten Zellen zu Trophoblastzellen BMP4 Verwendung ist für menschliche Zellen spezifisch und wird weithin verwendet , um die Entwicklung der frühen menschlichen Plazenta zu studieren , weil sie den Zugang zu frühen menschlichen Embryonen nicht erfordert 9, 16. Kürzlich wurde entdeckt, daß die Zugabe der Inhibitoren A83-01 (A) und PD173074 (P), die die SMAD2 / 3 und MEK1 / 2 Signalwege blockieren, erhöht die Effizienz der Differenzierung in HPSC Trophektoderm artigen Vorläufern, hauptsächlich SYNs und EVTs, ohne die umfangreiche Erzeugung von Mesoderm, Endoderm oder Ektodermzellen 9, 17 </sup&gt;. Unter Verwendung dieser Medienbedingungen differenzierte hES für 12 Tage ähnliche Gen - Expression haben Profile als Trophektoderm isolierte Zellen aus menschlichen Blastozysten-Stadium Embryonen und verschiedenen Plazentaspezifische Wachstumshormone absondern, die Unterstützung , die Gültigkeit dieses in vitro Modellsystem 9, 11. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Differenzierung von hPSCs in menschliche Trophoblasten - Vorläufern unter Verwendung von BMP4 / A / P Kulturmedium. Diese Bedingungen erzeugen reichlich Anzahlen von Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Genzerstörung verwendet siRNAs, Pathogen-Infektionen und genetischen Modifikation unter Verwendung von Lipofektion-vermittelte Transfektion.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>This is referred to as &quot;serum replacement&quot; in this protocol.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i low oxygen incubator</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol is used to isolate total RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>This is referred to as &quot;extracellular matrix&quot; in this protocol.</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

Die Plazenta ist das erste Organ während der Embryogenese zu entwickeln, und ist für das Überleben der sich entwickelnden Embryo erforderlich. Die Plazenta besteht aus verschiedenen trophoblastic Zellen, die von den extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste unterscheiden. Als solches unser Verständnis der frühen Differenzierungsereignisse der menschlichen Plazenta ist begrenzt, weil der ethischen und rechtlichen Beschränkungen für die Isolation und Manipulation der menschlichen Embryonalentwicklung. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind eine robuste Modellsystem für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und können auch in vitro in trophoblastische Zellen unterschieden werden , die Marker der verschiedenen Trophoblasten - Zelltypen exprimieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für hPSCs in Trophoblastzellen mit knochenmorphogenes Protein 4 und Inhibitoren der Activin / Nodal Signalwege zu unterscheiden. Dieses Protokoll erzeugt verschiedene Trophoblastenzelle Typen, die mit siRNAs transfiziert werden könnenzur Untersuchung loss-of-function Phänotypen oder können mit Krankheitserregern infiziert werden. Zusätzlich werden kann hPSCs genetisch modifiziert und dann in Trophoblasten Vorläufern differenziert für gain-of-function Analysen. Diese in vitro Differenzierung Methode menschlichen Trophoblasten zur Erzeugung von hPSCs Ausgangswindet die ethischen und rechtlichen Einschränkungen mit frühen menschlichen Embryonen zu arbeiten, und dieses System kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Wirkstoffforschung und Stammzellforschung.

Überblick über die in vitro Differenzierung von hPSCs Diese in vitro Differenzierung Protokoll beginnt mit undifferenzierten hESCs auf MEFs gezüchtet , das umge sind zufuhrfreien Bedingungen für einen Durchgang (1A). Während wir die Differenzierung von hES in diesem Protokoll beschrieben, haben wir dieses Protokoll erfolgreich hiPSCs in trophoblastic Zellen differenzieren. Der Übergang zu ...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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8.6K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Serie: In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Forschung

Biotechnik

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Entwicklungsbiologie

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Trophoblast-Riesenzellen oder<em&gt; In Vitro</em&gt; Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Neurowissenschaften

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biologie

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...