これらの方法は、主要な有害な産科の結果への洞察を提供することができるトロフォ芽細胞の侵略に影響を与える要因を決定するために利用することができます。この技術の利点は、増殖および移動を含むトロホブラストの侵入に影響を与える可能性のあるいくつかの要因の視覚的および定量的分析を提供することです。スクラッチアッセイを開始するには、適切な数の細胞を24ウェルプレートに播種し、48時間で100%合流を達成します。
翌日、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSを補ったフェノールレッドフリーメディアにメディアを変更する。スクラッチの日に、各ウェルの培地に所望の治療を加え、細胞を30分間退出させる。均一な創傷を作成するには、創傷メーカーツールのピンに無菌10マイクロリットルピペットチップを置きます。
先端を井戸の最初の列に下げ、ピペットの先端が井戸の反対側に届くまで、創傷メーカーのトラックに沿ってプレートを動かします。その後、プレートを開始位置に戻し、ウェルの直径を横切って一定の巻き傷を確保します。井戸の次の行にチップを下げ、すべての井戸が傷つくまで繰り返します。
顕微鏡で板を観察して、傷がウェルの幅を覆っていることを確認します。次に、慎重に培地を吸引し、1x PBSで細胞を2回軽く洗います。最後の洗浄の後、補充されたフェノール赤を無料で剥がしたり、所望の処置で低FBS培地を加えます。
次に、温度37°C、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を含むインキュベーターに収容された自動タイムラプスイメージャーに、傷ついた井戸を持つプレートを置きます。細胞が創傷治癒を完了できるように、必要に応じて一定の間隔で細胞を画像化します。侵入アッセイを開始するには、摂氏温度37°C、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターで、適切な数の細胞を6ウェルプレートに播種します。
細胞が48時間で90%の合流に達することを許可する。翌日、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSを補ったフェノールレッドフリーメディアにメディアを変更する。氷の上の冷蔵庫にミリリットル細胞外マトリックスあたり10ミリグラムのバイアルを置き、一晩解凍してみましょう。
翌日には、冷やしたピペットチップを使用して、フェノールレッドフリー血清フリー培地で細胞外マトリックス1ミリリットル当たり10ミリグラムを1ミリリットル当たり5ミリグラムの最終濃度まで希釈する。その後、希釈した細胞外マトリックスの100ミリリットルを、冷蔵24ウェルプレートに入れたチルドインサートに加えます。プレートを37°Cでインキュベートし、マトリックスを硬化させます。
細胞を浸潤アッセイ用に準備するには、1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。その後、PBSを吸引し、各ウェルに1xトリプシンEDTAの500マイクロリットルを追加します。すべての細胞がプレートの底から剥離するまで、摂氏37度の温度と湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに6ウェルプレートを置きます。
細胞が剥離したら、500マイクロリットルのフェノールレッドフリー血清培地をトリプシン化した細胞の各ウェルに添加する。その後、1,000マイクロ遠心分離チューブに1,000マイクロリットルの切り離された細胞を移し、摂氏4度で400倍gで5分間スピンダウンします。次に、培地を吸引し、フェノールレッドフリー血清フリー培地中の細胞を再懸濁する。
自動化されたセルカウンターを使用して細胞を数え、1ミリリットル当たり0.5百万細胞の最終的な濃度のために細胞懸濁液の体積を調整する。24ウェルプレートの各ウェルに完全な成長培地の600マイクロリットルを追加し、それに事前にコーティングされたインサートを置きます。その後、各プレコーティングされたセルインサートの上に200マイクロリットルの細胞を追加し、合計0.10万個の細胞を挿入します。
摂氏温度37度、湿度95%の雰囲気で24時間、24ウェルプレートをインキュベーターに入れます。一晩のインキュベーションの後、細胞外マトリックスを乱すことなく、上部および下部のチャンバーから残りの培地を吸引する。次に、綿棒でインサートの上部から細胞外マトリックスと非侵入細胞を慎重に除去します。
ウェルの上下のチャンバーに1x PBSを加えて各インサートを3回洗います。各洗浄後にPBSを吸引する。挿入物に取り付けられた細胞を固定するには、挿入物を摂氏4度の冷たいメタノール100%に30分間置きます。
1x PBSで3回挿入し、最終洗浄後にPBSを取り除きます。20%エタノール中に0.2%の結晶バイオレットを10分間用いった挿入物に付着した細胞を染色する。脱イオン水で3回リンスし、最後の洗浄後に脱イオン水を吸引します。
空気乾燥挿入物を室温で1時間挿入します。最後に鉗子とカミソリの刃を使用して、慎重に挿入物の底膜を切断し、底側を上に向けたガラススライドに取り付けます。20Xの目的を有する軽顕微鏡を用いて、サンプル当たり浸入細胞の少なくとも4つのユニークな画像を得る。
増殖アッセイを開始するには、フラスコからトリプシン化された細胞を数えるために、自動化された細胞カウンターを使用する。標準的な成長培地で1ウェルあたり0.2百万個の細胞の密度で6ウェルプレートに細胞を播種します。その後、摂氏温度37度、湿度5%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに細胞を4時間、または細胞が付着するまで置きます。
次に、熱不活性炭デキストラン剥がされたFBSおよび所望の処理を加えたフェノールレッドフリー培地に培地を変更する。摂氏温度37度、湿度95%の雰囲気で5%の二酸化炭素を維持するインキュベーターに6ウェルプレートを入れます。その後、48時間ごとに所望の治療で補充された新鮮な培地でメディアを交換してください。
24、48、または72時間の処理の後、1x PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄し、各ウェルに500マイクロリットルのトリプシンEDTAを加える。細胞がプレートから剥離するまで、インキュベーターに6ウェルプレートを入れる。細胞がプレートから剥離したら、補充されたフェノールレッドフリー培地の500マイクロリットルを加えてトリプシンを無効にします。
最後に、トリプシン化された細胞の5マイクロリットルを別のチューブのトリパンブルーの5マイクロリットルに加え、ピペットで混合します。自動セル カウンターを使用して、重複する各ウェルからセルをカウントします。不滅の人間の最初の三半期の栄養芽球白鳥。
71個の細胞を、スクラッチアッセイ中の合成グルココルチコイドデキサメタゾンの1xPBSまたは100マイクロモルの車両1x PBSまたは100マイクロモルで18時間処理した。白鳥の創傷の大きさおよび創傷の密度の測定。71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両または100ナノモルデックスで処理され、デックス治療が創傷閉鎖率を低下させ、グルココルチコイドが細胞遊動を阻害する可能性があることを示した。
侵襲アッセイに続いて、グルココルチコイド治療は、浸潤した白鳥の数を15%減少させることによって示されるように細胞侵襲性を低下させた。71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両で処理された細胞と比較して24時間100ナノモルデックスで処理した。細胞増殖アッセイに続いて、グルココルチコイド治療は、より少ない白鳥によって示されるように細胞増殖を減少させた。
71およびHTR-8/SVneo細胞は、車両で処理された細胞と比較して100ナノモルデックスで処理した。細胞死を評価する方法は、アポトーシスまたは壊死が変化した栄養芽細胞機能に寄与するかどうかを判断するために、この手順と組み合わせて使用することができる。私たちは、栄養芽細胞機能の研究のために癌生物学で日常的に使用される標準的な技術の使用を独自に採用してきました。
これらの方法に関連する危険はありません。視聴者が取るべき唯一の予防措置は、組織培養のための滅菌技術を使用することです.
