我々は、 図1に概略的な画像を描画するための山口智子に感謝します。この研究は、自然科学のtheNational研究所の岡崎統合バイオサイエンス研究所の岡崎ORIONプロジェクト（自然科学研究機構）によってサポートされていました。自然科学研究機構の宇宙生物学センタープロジェクト（。なしAB281010）によります。 （ノー25102008）革新的な分野での科学研究（統合された機能の作成のための生体分子システムの動的秩序）日本学術振興会からのための費補助金（JSPS）によります。若手費補助金（B）による（KKに、15K17850ありません。）日本学術振興会から。 andby費補助金研究活動スタートアップのための（YNに、なし。15H06653）日本学術振興会から。追加のサポートは野口研究所、財団法人花王芸術・科学財団からの助成金、および栗田工業と環境財団からの助成金からの助成金によって提供されました。

W / Oエマルションの遠心分離法によるのGVの調製<ol><li> 1,2- dioleoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（DOPC、25 mM）のテキサスレッド1,2- dihexadecanoyl- のsn -glycero -3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（テキサスレッドのストック溶液の原液を準備クロロホルム中DHPE、0.20ミリモル）と-20℃でストック溶液を格納します。 </li><li> オイル溶液を準備します。 <ol><li> DOPC原液（51.0μL、窒素ガスを流し下テキサスレッドDHPEストック溶液（19.2マイクロリットル）の混合物を蒸発させることにより、5mLのガラスバイアルの内側表面上の脂質膜を形成します。 </li><li>一晩減圧下でフィルムをインキュベートした後、（グラム/ cm 3の0.86から0.89）バイアルに流動パラフィンの1.0ミリリットルを追加します。アルミホイルでバイアルを包み安静に80℃のCO / Nでそれをインキュベートします。 3 mMの- DOPCおよびテキサスレッドDHPEの最終濃度は1.3と3.8×10ですそれぞれ、およびDOPC：0.3：テキサスレッドDHPEのモル比は100です。 </li></ol></li><li> 内部の水分散液を準備します。 <ol><li> 1.5ミリリットル蓋付きマイクロチューブでは、1.0μmの非蛍光マイクロスフェア（2.5体積％）と、1.0μmの蛍光マイクロスフェア（2.5体積％）の分散の12.5μlと分散の237.5μLを混合します;蛍光マイクロスフェアへの非蛍光の5（v / v）の比：これは95に相当します。 </li><li>トリス緩衝液（TBS、1 M）と脱イオン水875μlを125μlのに続いて、ショ糖の64ミリグラムを追加します。ミクロスフェアの最終的な体積分率が0.5体積％であり、トリス-HCl（pH7.5）およびスクロースの最終濃度は、それぞれ0.1および0.15 Mです。 </li><li>渦30秒間マイクロチューブ、次いで10分間、それを超音波処理します。 </li></ol></li><li> 外側の水溶液を準備します。 <ol><li>トリス緩衝液（0.1MのTris-HCl [pHを7.5]、0.15 M Glucを10mlの調製後OSE）内水メディアと同じ手順で、1.5ミリリットル蓋付きマイクロチューブに溶液1mlを配置します。渦30秒間マイクロチューブ、次いで10分間、それを超音波処理します。 </li></ol></li><li> マイクロスフェアを含むAW / Oエマルションを準備します。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブ内の内部の水溶液300μlの油溶液（DOPCおよびテキサスレッドDHPEを含有する液体パラフィン）の1ミリリットルを混ぜます。 </li><li>マイクロチューブ内の2つの成分は、機械的ホモジナイザー（高速で回転する羽根を有する撹拌機）を用いて乳化を室温で2分間、10,000rpmで作動しました。 </li></ol></li><li> GVを沈殿させます。 <ol><li>静かに1.5ミリリットル蓋付きマイクロチューブに4℃で外水溶液1ミリリットルの上面には、W / Oエマルションの300μlのレイヤ。 4℃で10分間マイクロチューブを冷やします。 </li></ol></li><li> GVを収集します。 <ol><li>直ちにマイクロチューブを冷却した後、30分間18,000×gで、それを遠心します。画鋲でマイクロチューブの底を貫通し、滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブに1滴を収集することにより、沈殿のGVを取得します。 </li><li>得られたのGVが観察を困難にするのに十分な大量に得られた場合希釈沈殿したGVは、外側の水溶液を用いて容積で10から100倍に液滴。 </li></ol></li></ol> GVの2顕微鏡観察<ol><li> 顕微鏡標本を準備します。 <ol><li>顕微鏡カバーガラスの上にその場でポリメラーゼ連鎖反応およびハイブリダイゼーション（チャンバーサイズ、厚さ9ミリメートル×9ミリメートル×0.3ミリメートル） で用接着インキュベーションチャンバーを配置。 </li><li>マイクロピペットを用いて、希釈の堆積物25μlを検体エリアでのGVを沈殿させ、直ちにインキュベーションチャンバーの上に別のカバーガラス（厚さ約0.15ミリメートル）を配置します。 </li></ol></li><li> 録音微分干渉コントラGVのトン顕微鏡画像。 <ol><li> 12V100WHAL-Lのハロゲンランプを備えた顕微鏡（10X、20X、および40X目標）と小胞のレコード顕微鏡画像。 </li></ol></li><li> 蛍光顕微鏡観察を行っています。 <ol><li>顕微鏡にU-FBNAとU-FMCHE蛍光ミラーユニットを挿入します。それぞれ、470から495 nmおよび565から585 nmの励起フィルタとユニットを取り付け、それぞれ、510から550 nmおよび600から690 nmの光を透過する発光フィルターと。 </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+micrometer-sized+artificial+objects+into+live+cells:+a+method+for+cell-giant+unilamellar+vesicle+electrofusion.">Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion.</a> PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).</li><li>Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+robotics:+a+new+paradigm+for+artifacts.">Molecular robotics: a new paradigm for artifacts.</a> New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).</li><li>Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+robots+with+sensors+and+intelligence.">Molecular robots with sensors and intelligence.</a> Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

<html>内部の水性分散媒と外水溶液の比重は、慎重に選択する必要があります。 W / Oエマルションは、遠心分離中に、外側の水溶液中に沈殿させるために、内側の水性分散媒の比重は、外側の水溶液よりも大きくなければなりません。私たちは、糖なしで内側と外側のソリューションを使用してのGVを準備しようとしましたが、内部の水溶液は、2つの相の間の干渉を横断するのに十分な質量を持っていなかったので、我々は、これらの条件の下で何のGVを得られません。二つの溶液間に大きな浸透圧の差がある場合、外側の水溶液中に沈殿のGVは、縮小または破壊することができます。したがって、のGV内側と外側の浸透圧は等しくなければなりません。これを達成するために、我々は外水溶液中の溶質として、内側水分散液とグルコースの溶質としてショ糖を使用しました。両方の糖は、同じ濃度でした。両方の塩SS = &quot;外部参照&quot;&gt; 22と砂糖23、35、38は、このような目的のために使用されてきたが、それは塩よりも毒性が低い、より可溶性であるため、糖は、通常用いられています。あまりにも多くの砂糖を添加する場合は、のGVは、カバーガラスと崩壊の底部に接触することができます。これを回避するためのいくつかの方法があります。 1つの戦略は、のGVは、穏やかな条件下で沈殿するように、内側と外側の水溶液との比重差を低減することです。具体的には、沈殿したGV分散液の上清は浮力の結果としてのカバーガラスに接着することにより小胞の破裂の可能性を低減するために内側の水溶液と同じである溶液と交換することができます。別の戦略は、薄い脂質膜29とカバーガラスの両方をプレコートすることです。 エマルジョンの適切な準備とインキュベーションされています重要。我々は、油溶液を調製するために液体パラフィンを使用しました。鉱油26、31、21ドデカン、33、及びスクワラン33、39は、また、多くの場合、溶媒油として使用されます。これらの材料は、比重、粘度、及び表面張力が変化するため、小胞の異なる番号が同じ遠心分離条件は、33を用いても形成します。ターゲット特性を有する小胞を得るためには、比重内外水溶液の粘度、ならびに油相の遠心acceleration.For製剤を最適化するために不可欠であり、インキュベーションは、高温で、乾燥中に発生しなければなりません環境インキュベーターや脱水など。この研究では、我々は完全に脂質molecules.In加算を溶解するために80℃に流動パラフィンを加熱し、エマルジョンがすべき必要とそれを調製した直後に不安定であるため、すぐに遠心分離されるべきであるだけで調製された液滴は容易に互いに融合/ oをwです。エマルジョンは、超音波処理、ボルテックス、またはタップすることで、大量に調製することができます。しかしながら、ホモジナイザーを使用して高粘度の油中の乳剤の多量の迅速な調製および容易に乳化可能にします。エマルジョンを穏やかにかつ迅速に外側水溶液に積層した後、4℃で冷却することも重要です。乳化および遠心分離の間の時間を短縮するために、油 - 外側の水溶液系は、エマルジョンは、その上に積層される前に予備冷却することができ、白濁が速くまたは遅く通常よりも、機械的な表示immediately.Ifシステム全体は、次いで、遠心分離することができますホモジナイザーを徹底的にクリーニング用洗剤を除去するためにリンスしな​​ければなりません。また、乳化前に、油剤、内側の水溶液、および乳化剤は、rでなければなりません室温にeturned。 適切な遠心加速度も重要です。 18,000×gで遠心分離することによって、我々は、高濃度でカプセル化された単一の内装材とのGVを準備することができました。複数の材料のカプセル化が必要な場合には、遠心加速度を低減した方がよいです。例えば、7の化合物を封入アクチン組立システム未満350×gで35での遠心分離によって達成されました。遠心分離は望ましくないである場合には、のGVは、糖濃度を調整することにより、または、独自の質量38、40、41の影響下で乳剤を沈殿させることによって得ることができます。 本明細書に報告された方法は、2つの主要な制限があります。 Weitによって指摘されているように、1つは、GV膜中に可溶化することができる（この場合パラフィン）その油分子でありますzのグループ21。 GV膜への膜タンパク質の挿入が所望される場合、タンパク質上に共存する油分子の効果を考慮しなければなりません。他の制限は、体積分率の変化です。本研究では、のGV中の微小球の体積分率は4-30体積％の範囲であったと推定しました。体積分率は、GVの調製に使用される内部の水溶液の体積分率と同一ではなかったです。我々は、顕微鏡観察のために十分に高い体積分率でのGV内のミクロスフェアを封入することができたが、この方法は、均一な体積分率分布を有するのGVの製造には適していません。微小球の体積分率の分布は、遠心分離34中に変化することが報告されています。 W / Oエマルションの遠心分離法は、一般的にカプセル化された物質を含むのGVの形成に使用されます。しかし、いくつかの報告は、pを記載していますマイクロスケール材料34、42をカプセル化するのGVの賠償金。最近では、カプセル化されたDNAデバイスや分子デバイスを含む分子ロボットは43、44を構築されています。コンパートメントのGVは、この種のアプリケーションのための最初の選択です。従って、多様な表面官能化磁気マイクロスフェア及びマイクロスフェアを封入するために使用することができるような我々のような技術が、44有用であると期待することができます。

<html>建設的、または合成、生物学のアプローチは、リビングと非生物の物質との間の境界を探索するための魅力的な道です。細胞は、我々は現在、それを理解するように生活するために必要な最小単位であるため、様々な研究者が解明の究極の目標で、そのような人工細胞内で発生する現象を研究することができるようにシンプルな、よく理解の化学物質から人工細胞を構築しようとしました生命の起源と生細胞1、2、3の基本的な機能を研究。両親媒性分子からなる球状microcompartmentsであり、そのようなタンパク質5、 図6およびDNA 7、 図8、 図9のような生体分子をカプセル化することができ、特に、小胞4、小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 10は、多くの場合、生体膜のモデルとして使用されています。 小胞は、（&lt;100nmの直径を有するとして定義される）小大（直径&lt;1ミクロン）、または巨大な（直径&gt; 1ミクロン）に分類することができます。彼らは大きさ、形状、及び構造で生細胞と類似しているため、ジャイアントベシクル（のGV）が広く研究されています。 GVの大きさにより、GV膜における形態学的変化は、容易に光学顕微鏡下でリアルタイムで観察することができます。 GVを調製するためのいくつかの方法は、水和法12、13、凍結融解法14、電鋳法15、16、及び流体装置法17、18を含む、11に報告されています。しかし、タンパク質および他のMACROMを封入これらの方法により、高濃度でのGV中oleculesは困難です。特に、セル19,20の内部に混雑した環境を模倣するために十分な量（20〜30体積％）中の生物学的物質を封入することは極めて困難です。瞬時のGVを形成するために、ウェイツおよび共同研究者は、油中水型（W / O）エマルション遠心法21、22を確立しました 。この方法は、5重要な機能を備えています。この方法により調製のGVが低いラメラ23、24を持っているので、まず、それらの膜は、それらが容易に変形することができるように薄いです。 FtsZ（細菌の細胞分裂タンパク質）、チューブリン、および他の巨大分子によって誘導されるGV膜変形が25、26、27、28に研究されており、我々はpolyhe観察しました<html>マイクロスフェア29、30のカプセル化によって誘発されるGV膜のDRONのような変形。第二に、膜タンパク質は困難31とはいえ、この方法により、小胞の膜に挿入することができます。例えば、四方グループは、α溶血素32膜タンパク質のインビトロ合成と細孔形成活性を研究するために、このメソッドを使用していました。第三に、内側と外側のリーフレットの脂質成分は、22種類である、非対称のGVを生成することができます。例えば、Whittenton ら。毒性および非特異的な細胞取り込み33を減少させるために、負に帯電したポリヌクレオチドをカプセル化するための内部リーフレット中のカチオン性脂質と、そして外側のリーフレットに中性脂質非対称のGVを生成。第四に、のGV内部の物質の濃度および体積分率が比較的高くすることができますS = &quot;外部参照&quot;&gt; 28、34。第五に、材料の複数のタイプが35を封入することができます。例えば、西村ら。 GVへのインビトロ転写-翻訳系をカプセル化のGV 36内に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するようにシステムを使用します。これらの5つの特徴は、W / Oエマルションの遠心分離を細胞模倣のGVを生成するための不可欠な方法を作ります。 以前の研究では、遠心分離によって生成のGVは、最終的な水溶液22の一部を含む長16 Gステンレス鋼針を備えたシリンジを用いて回収しました。経験の浅い技術者の手で、このコレクションの方法は、簡単に油の一部とGVの汚染につながる可能性があります。本研究では、四方群23、37によって開発されたW / Oエマルションの遠心分離プロトコルを使用しましたここでのGVは、それらが調製された遠心分離管の底部に開口穴を通って回収される沈殿しました。我々は、細胞内小器官のサイズに似ている1.0μmのマイクロスフェアを、カプセル化のGVを用意しました。微小球の使用は、我々は、それらの体積分率を計算することによって、それらの濃度を推定することができました。材料が密に充填されているのGVの製造方法の確立は、人工細胞を作成するための重要なステップです。内側の材料の様々なタイプの我々のプロトコルの有用性を確認するために、我々はまた、GFPおよび小さな水溶性蛍光分子（ウラニン）はのGV中に封入することができることを実証しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Vesicular membrane molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid paraffin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>128-04375</td>
			<td>Oil, Density (20&#8451;) 0.86 -0.89 g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>Nippon Gene Co.</td>
			<td>318-90225</td>
			<td>Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>049-31165</td>
			<td>For outer water solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For inner water solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead carboxylate microspheres 1.0 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>08226-15</td>
			<td>Nonfluorescent, 2R = 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>15702-10</td>
			<td>Fluorescent, 2R = 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>16662-10</td>
			<td>Fluorescent, 2R = 0.10 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt (uranine)</td>
			<td>Sigma Aldrich Japan</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP standard (recombinant)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MB-0752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5409000233</td>
			<td>Centrifuge rotor: FA-45-48-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physcotron</td>
			<td>Microtec Co.</td>
			<td>NS-310EIII</td>
			<td>Handy micro-homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generator shaft</td>
			<td>Microtec Co.</td>
			<td>NS-4</td>
			<td>Homogenizer attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>SLF0201</td>
			<td>Hybridization chamber volume: 25 &#181;L 
			Chamber size: 9 &#215; 9 &#215; 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>SLF0601</td>
			<td>Hybridization chamber volume: 65 &#181;L&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Chamber size: 15 &#215; 15 &#215; 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microman E</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FD10006</td>
			<td>Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus Co.</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror unit</td>
			<td>Olympus Co.</td>
			<td>U-FBNA</td>
			<td>Excitation filter: 470-495 nm 
			Emission filter: 510-550 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror unit</td>
			<td>Olympus Co.</td>
			<td>U-FMCHE</td>
			<td>Excitation filter: 565&#8211;585 nm 
			Emission filter: 600-690 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion

建設的な生物学や人工生命を作成する合成生物学のアプローチは、生物学的または非生物材料のボトムアップアセンブリを伴います。このようなアプローチは、リビングと非生物の物質との間の境界の研究にかなりの注目を受けているし、過去20年間の人工細胞を構築するために使用されてきました。特に、巨大な小胞（のGV）は、多くの場合、人工細胞膜として使用されています。本稿では、高度に凝縮し、生体分子を含有する細胞のモデルとして非常にパックされたマイクロスフェアをカプセル化するのGVの調製を記載しています。 GVは、単純な油中水型エマルションの遠心分離法を用いて調製しました。具体的には、ホモジナイザーは、材料をカプセル化することを含む水溶液に溶解し、リン脂質を含有する油を乳化するために使用し、そして得られたエマルジョンは、他の水溶液の表面上に注意深く積層しました。階層化システムは、次に、Tを遠心分離しOのGVを生成します。この強力な方法は、小分子からマイクロスフェアに至るまで材料をカプセル化するために使用されました。

W / Oエマルションの遠心分離法は、 図1の写真及び概略的に示されています。 図1の模式的な画像は、この方法の成功の最も重要な決定因子でのGVは、遠心分離中に沈殿するように、内側の水溶液の比重は、外側の水溶液よりも大きくなければならないことであることを示唆しています。また、W / Oインターフェースにおける脂質単層の形成は、エマルションは、外側水溶液に積層された後に、システムが10分間冷却することが必要です。 W / O界面を横切るエマルジョン液滴の移動によるのGVの形なので、内側と外側の水層中の浸透圧は同じでなければなりません。対照実験として、プロセスによってない微小球を含有しない、我々もまた調製のGVは、 図1に示されており、内側の水溶液であったことを除いて、1.3ステップマイクロスフェアを用いずに調製。 遠心分離後の沈殿のGVのコレクションは、図2に示されています。マイクロチューブの最下部にある半透明相に加えて、我々はまた、外側の水溶液（ 図2a）の白、濁った中間相を観察しました。下相はのGVを含んでいたのに対し、この中間相は、マイクロスフェアと油の集計が豊富でした。したがって、プッシュピン（ 図2b）とマイクロチューブの底を貫通した後、我々はのGVを大量に含まれている唯一の最初のドロップ（ 図2c）を 、収集しました。 2つ以下の滴が収集されていないことを確認することが重要です。追加の滴がのGVの低密度になりますミクロスフェアおよび脂質の集計を含んでいてもよいです。 ofteのGVので、多くの場合のGVの外にカプセル化された材料を含んでいて得られた小胞分散物nは遠心分離中に破裂します。唯一のGVを得るために、例えば、透析、ゲル濾過、または蛍光活性化細胞選別などの選別方法は、カプセル化材料の大きさに起因して、選択されるべきです。沈殿のGVが使用される対象のために必要な場合、それらは外側の水溶液で希釈することができます。いくつかのケースでは、中間相が形成された小胞は油によって一緒に保持されたことを示唆し、チューブの底部に延長しました。 我々は、マイクロスフェアなしのGVの微分干渉顕微鏡および蛍光顕微鏡画像を得た（ 図3a、図3b）、およびミクロスフェア（ 図3c -3 f）を有します。以前の報告23、37と一致して、低ラメラとのGVは、当社のプロトコルにより形成しました。赤色の蛍光物質を放出するテキサスレッドDHPE、と結合した脂質小胞形成を直接薄膜の可視化により確認できるようにcenceを使用しました。我々が得160のGVのうち、55カプセル化されたマイクロスフェアおよび105は、34％のカプセル化の比率を与え、空でした。 我々は、以下の方法を用いてのGV中の微小球の体積分率（φ、体積％）を決定しました。各GVが数百マイクロスフェアへの数十が含まれているため、光学顕微鏡下ですべてのマイクロスフェアをカウントすることは困難です。したがって、我々は手動で蛍光顕微鏡下で計数した蛍光マイクロスフェアの少量で非蛍光1.0μmのマイクロスフェアを混合しました。カプセル化された微小球の総数（N）は （：蛍光ミクロスフェアに非蛍光の5 [V / V]比元の95に基づいて）20によって手動で計数し、蛍光マイクロスフェアの数（n）を乗じて算出しました。の値66;そして、vは微小球の体積であり、Vは 、個々のGVの体積であるのNv 100 / V、と推定されました。 nはNの推定は、計数誤差を生じる、とφを計算するときに 、これらのエラーを考慮に入れる必要があります。 φの値をそのまま20 nと計算されたN、から推定し、これが今度はそのφ確率をもたらしました 正確に真の値が50％&lt;で表します。実際には、Nは 20 のnの周りにある程度変動するので、我々はiが nに誤りである20（N Iを ±）、としてそれを考慮する必要があります。私たちは、n個の確率iはポアソン分布に基づいて得られた50％を超える可能性が±ようにするために私を推定しました 。私たちは、 私は順番に私たちは20を計算することを可能にした、推定（N Iを ±）との値66;それは、10〜15μmである （ 表1）の直径のGVのエラーをカウント含ま。この手順によると、 図3cに示されているGV中の微小球の体積分率は、11±3体積％であると推定されました。計算された体積分率の精度は10〜30％でした。 我々の結果は、我々は成功し、高い体積分率でのGVが1μmの微小球をカプセル化することを示します。我々はまた、同一の外水溶液と同じプロトコル（ 図4）を使用して、100モル％のDOPCとのGVに他の物質を封入することができました。具体的には、0.1μmの微小球を含むのGVは、0.1 Mトリス塩酸（pH7.5）を含有するTris緩衝液から調製した、0.15Mのスクロース、および0.5体積％の蛍光ミクロスフェア1.0ミクロン微小球を含有するのGVについて記載したプロトコルを用いて（ 図4a）。 abovを説明されたプロトコルに続いてE、GFP（0.1 Mトリス塩酸[pHが7.5]、0.15 Mショ糖、および100μg/ mLのGFP; 図4b）を含むDOPCのGVとウラニンを含むのGV（0.1 Mトリス塩酸[pHが7.5]、0.15 Mショ糖を、および30μMのウラニン; 図4c）も用意しました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n個</td><td> N </td><td> φ（10-μmの直径） </td><td> φ（15-μmの直径） </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60±20 </td><td> 6.0±2.0 </td><td> 1.8±0.6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80±20 </td><td> 8.0±2.0 </td><td> 2.4±0.6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100±20 </td><td> 10±2 </td><td> 3.0±0.6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120±30 </td><td> 12±4 </td><td> 3.6±1.2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200±32 </td><td> 20±3 </td><td> 5。9±0.9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400±45 </td><td> 40±5 </td><td> 12±2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600±55 </td><td> - </td><td> 18±2 </td></tr><tr><td colspan="4">本文中に記載されているようにエラーを決定しました。 n =手動でカウントマイクロスフェアの数。 N =カプセル化されたマイクロスフェアの総数。 </td></tr></tbody></table> 表1： マイクロスフェアの 数と体積分率（φ、 体積％）。本文中に記載されているようにエラーを決定しました。 n =手動でカウントマイクロスフェアの数。 N =カプセル化されたマイクロスフェアの総数。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> 図1： フローChの<html>芸術とW / Oエマルションの遠心分離法の概略図。 （a）は、DOPCおよびテキサスレッドDHPE（100：0.3のモル比）からなる油剤液体パラフィン中に。 （b）は、Tris-HCl緩衝液中のスクロースおよび微小球からなるインナー水性分散液。 （c）の Tris-HCl緩衝液中のグルコースからなるアウター水溶液。 （D）油剤と内側の水性分散液を300μlを1mlの混合物。ホモジナイザー（10000rpmで、2分）と（e）の乳化。 （f）は、W / Oエマルション。 （g）の外側の水溶液1ミリリットルにエマルジョンを300μlのレイヤリング。 （h）は単に遠心分離後のGVを沈殿させました。 （I）W / Oエマルションの遠心分離法の原理の概略図。黒い矢印は、遠心加速度の方向を示しています。.jpgの「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> 図2： マイクロチューブのピアス。 （a）は、単に遠心分離（また、 図1Hに示されている）後のGVを沈殿させました。赤い楕円が沈殿したGV分散液の液滴を示しています。画鋲でマイクロチューブの（b）のピアス。 GVを含むペレットは、プッシュピンと下部にマイクロチューブを貫通穴から液滴を収集することによって得ました。外側の水溶液で希釈した分散体（黄色の矢印で示されている）、沈殿のGVの（c）の液滴。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3： のGVの顕微鏡画像。 （a）は、マイクロスフェアなしでGVの干渉顕微鏡像から差動。 GVの直径は約10μmでした。 =10μmのスケールバー。 （b）は、マイクロスフェアなしGVの蛍光顕微鏡像。赤色蛍光は、テキサスレッドDHPEによって放出されました。ミクロスフェアを含むGVの（c）の微分干渉顕微鏡像。 GV内部1.0μmのマイクロスフェア（YGのカルボン酸マイクロスフェア）の（d）の蛍光顕微鏡画像。カウント蛍光ミクロスフェア（N）の数は、我々は、ポアソン分布に基づいてエラーを（I = 2）を推定6.ました。その後、我々は（（N Iを ±）N = 20）の内側微小球の総数を推定120±40でした。これは、ことを計算しました。GVは、Vは、微小球の体積であり、Vは、のGVの体積は約11±3体積％の体積分率（φ= Nvの 100 / V）で、1.0μmの微小球を含有していました。 GV膜の（e）の蛍光顕微鏡画像。赤色蛍光は、テキサスレッドDHPEによって放出されました。 （f）は、パネルdおよびeにおける画像の画像を吸収合併。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> 図4： 異なるカプセル化材料とのGVの微分干渉コントラストおよび蛍光顕微鏡画像。微分干渉コントラスト顕微鏡法（上）および蛍光顕微鏡（下）の画像（a）は、0.1μmのミクロスフィア、（B）GFP、および（c）ウラニンを含むのGV。スケールバー=10μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.3K ビュー.  Japan Women's University. Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials. 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

生化学

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein film electrochemistry, in which a protein is immobilized on an electrode surface such that the electrode replaces physiological electron donors or acceptors, has provided functional insight into the redox reactions of a range of different proteins. Full chemical understanding requires electrochemical control to be combined with other techniques that can add additional structural and mechanistic insight. Here we demonstrate a technique, protein film infrared electrochemistry, which combines protein film electrochemistry with infrared spectroscopic sampling of redox proteins. The technique uses a multiple-reflection attenuated total reflectance geometry to probe a redox protein immobilized on a high surface area carbon black electrode. Incorporation of this electrode into a flow cell allows solution pH or solute concentrations to be changed during measurements. This is particularly powerful in addressing redox enzymes, where rapid catalytic turnover can be sustained and controlled at the electrode allowing spectroscopic observation of long-lived intermediate species in the catalytic mechanism. We demonstrate the technique with experiments on E. coli hydrogenase 1 under turnover (H2 oxidation) and non-turnover conditions.

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Here, we describe a technique, protein film infrared electrochemistry, which allows immobilized redox proteins to be studied spectroscopically under direct electrochemical control at a carbon electrode. Infrared spectra of a single protein sample can be recorded at a range of applied potentials and under a variety of solution conditions.

タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...