この作品は、コラボレーティブ·イノベーション·アワードハワードヒューズ医学研究所（HHMI）によってサポートされていました。 LAMは、保健研修助成金（T32 GM008759）とNIHルースL.キルシュシュタインプレドクトラルフェロー（CA165349-01）のシグナリングと生体調節研究所によってサポートされていました。我々は彼らの非常に貴重なコメントのために教授のマイケル·ストーウェル（CUボールダー）、教授ダグラス·リース教授ロブ·フィリップス（カリフォルニア工科大学）に感謝したいと思います。

1。リポソーム調製<ol><li>テフロンライニングキャップ付き20mLのガラスバイアルを取得します。 </li><li>汚染を防止するために使用する前にクロロホルムですべてのガラス器具や注射器を清掃します。 </li><li> 250μL気密ガラスシリンジを用いてガラスバイアルに試薬グレードのクロロホルム100μLを転送します。 </li><li> 100μL気密ガラスシリンジを使用して、同じガラスバイアルに試薬グレードのメタノール30μLを追加します。 </li><li> 2mMの7:1.5:1.5ホスファチジルコリン（POPC）を準備するには：ホスファチジルエタノールアミン（POPE）：コレステロール脂質溶液は、10 mg / mLのPOPC、10 mg / mLのPOPEと11 mg / mLの20μLの42μL216μLを転送20mLのガラスバイアルにCHCl 3中コレステロールソリューションを提供しています。 </li><li>脂質の薄膜をバイアルの底に観察されるまでが遅い流量アルゴンまたは窒素ガスを用いた有機溶剤を蒸発させる。 </li><li>残留溶媒を除去するために少なくとも30分間、真空デシケーター中で未キャップのガラスバイアルを置きます。 </li><li> TRバッファのansfer 2 mLのは、以前水和物脂質のガラスバイアルに、0.2ミクロンのフィルターを通過した。 </li><li> 4℃で一晩混合物をインキュベートし、48時間以内に使用します。 </li></ol> 2。凍結と融解：30のリポソームのサイズについて - 100 nmでのみ<ol><li> 15秒間以上、液体窒素中でのリポソーム懸濁液を凍結します。 </li><li> 42℃の加熱ブロックを用いてリポソーム懸濁液を解凍°〜3分間の温度。 </li><li> 5サイクルの合計に対して、手順2.1と2.2を繰り返します。 </li></ol> 3。押し出し正しく彼らのガイドブックに楽器のアウトラインを使用して、Liposofast LF-50押出機を組み立てるためAvestinの指示に従ってください。 <ol><li>サポートフィルタベースの大規模ホールのサポート画面が表示されます（円形の穴を持つ）を配置し、円形の焼結皿（穴なし）、1本のドレイン·ディスク（直径25mm）、1つのポリカーボネート膜（直径25ミリメートル）が続いている。 </li><li>小さな、黒を配置サポートフィルタをベースにそれを確保するための膜の上にO-リング。 </li><li> 4対応する穴に4本のネジを締めて、上部フィルター押出機を取り付けます。 </li><li>大型押出機のバレルの下にフィルタ押出機ユニットを組み立てる。シリンダーバレルにリポソーム溶液を追加します。ために、押出バレルの上に次のように配置します。大きな円形のOリング、狭いキャップ、大きな円形のOリング、円形のキャップ。 </li><li>押出機バレル上部にガスレギュレータを取り付け、圧力リリーフバルブなど、空気漏れを防ぐためにすべてのバルブを閉じます。 20mLのガラスバイアルまたは押出機フィルターユニットの下に50 mLの三角フラスコを置きます。安全弁は、レギュレータに接続されており、圧力は600 psiを超えた場合に解放されます。窒素ガスをオンにして押出機に接続されたガスのバルブを開きます。 </li><li> 400nmのリポソームは、100 nmのリポソーム125 PSI、30 nmのリポソームの400から500 PSI、25 PSIへの窒素の圧力を増加させます。 </li><li>リポソームsuspを見る窒素に押されながらensionそれはコンテナに排出されるとして。あなたは、もはやガラスバイアルに押出機フィルターを介して任意の液体の通過を観察しなくなるまで窒素が流れ続ける。 </li></ol> 4。動的光散乱（DLS）の分析<ol><li> 20μMリポソーム溶液50μLを準備します。 </li><li>電源とランプの源をオンにします。 </li><li> DynaProソフトウェアを開きます。 </li><li> &gt; 100 nmのリポソームを検出するためには30nmと100nmとMS800アルゴリズムモデルのリポソームを検出するためにMS / Xアルゴリズムのモデルにソフトウェアを設定します。 </li><li>ハードウェアに接続します。 </li><li>セルホルダーに石英キュベットとインサートにリポソームサンプルのピペットで14μL。 </li><li>開始を押します。 </li><li> 30買収 - 約20後に停止を押します。 </li><li>ヒストグラムに記録されている平均的なリポソームの直径のピークを分析します。 </li></ol> 5。ナノ粒子のトラッキング分析（NTA） <ol><li> 500μL、0.1μMのリポソームを準備するソリューションを提供します。 </li><li>水とエタノールを含むサンプルコンパートメントをすすぎます。 </li><li>糸くずの出ないペーパータオルを使用してサンプルコンパートメントを乾燥させます。 </li><li>レーザー電源とコンピュータの電源をオンにします。 </li><li>サンプルコンパートメントに0.1μMリポソーム溶液300μLを提供します。 </li><li>温度制御とナノ粒子トラッキング解析ソフトウェアを開きます。 </li><li>レーザーをオンにキャプチャボタンを押します。 </li><li>ステージを移動し、顕微鏡のフォーカスを調整するために水平方向および垂直方向の調整を使用しています。 </li><li>所望の温度（20℃）と録音時間（少なくとも30秒）を設定します。 </li><li>指定した時間のためにリポソーム粒子の複数の画像フレームを取得するために録音ボタンを押してください。それは各粒子の運動を追跡するようにヒストグラムの直径リポソームサイズに対応するピークを分析します。 </li></ol> 6。代表的な結果押出法を概説する方式では、pである図1に憤慨した。最適な結果を得るために、30nmの直径を有するリポソームの調製は、100 nmの〜500 PSIと直径の高圧を必要とする125 psiの圧力が急速にフィルタ率を達成する必要があります。 400nmの直径については、〜25 psiの低気圧は、小胞が細長いと大きく、均一なリポソームを形成することができ低速フィルタ率を達成することをお勧めします。我々は、一貫したサブミクロンサイズのベシクルを製造するための最適な圧力を決定するために一連の実験を行った。我々は圧力と同様に押出孔30の大きさ、100、400 nmのポリカーボネートフィルターを通過する数を変化させ、それぞれ所望の大きさのために適切な圧力を発見しました。 30nmの細孔には、500 psiの下の圧力が伸び、その結果より大きな小胞の大きさを引き起こして、流量を減らすことができます。 100nmの細孔については、定常流は125 psiで達成された。 400nmの細孔については、低圧（25 PSI）は小胞が大きい小胞の中に細長いすることができますizes。ゆっくりと滴下ろ過流量が大きく、サブミクロンベシクル13を作成するには最適です。 我々は、3つの異なる直径の大きさ、すなわち30、100と400nmを通して押し出さリポソームのサイズを決定するためにDLSを行った。 DLSは、粒径を決定するために散乱光を収集し、確立された方法です。 5 500 psiでポリカーボネート30nmの膜を介して我々2 mMの押し出し水和リポソームフィルター細孔を通過し、フィルター細孔を介して5を通過し、25 psiで400nmのポリカーボネート膜125 psiで100nmのポリカーボネート膜2フィルター細孔を通過します。リポソームおよび30のDLSによって測定の直径は、100〜400 nmの細孔径は66±28、138±18および360±25 nmの（ 図2）であった。それは47の直径は±16 nmを記録し、 図2に示すように50nmのポリスチレンビーズの懸濁液は、校正標準として使用されていました。パーセントpolydispersityは、リポソームのサイズ内で重複がないことを示しています。これは、この楽器は大きな粒子12の方へ持って知られているバイアスに起因するDLS解析を使用している場合が30nm以上の直径を観察するのが一般的です。大小の粒子からの散乱光強度は、サスペンション12のリポソームを解決する1つの検出方法から同時に収集し、このように難しくしています。この楽器の限界にもかかわらず、検量線に近い直線的な相関を示しています。 NTAは、粒子の屈折率や密度の独立した液体培地中での拡散の直接観察から、各粒子のサイズを測定する新しい技術です。この高分解能技術はDLSでリポソームの測定を補完するために使用することができます。 NTAは、キャリブレーションのために使用された95の直径は±48および356±51 nmであり、2つの100 nmと400 nmのポリスチレン溶液を記録した。は30nmと100nmの脂質溶液は、より多くのお試し版を持っていることが観察された<html> DLSに耕地の直径の相対的な29の平均サイズは±14、95±17および359±73 nmの生産、 図3に示すように。 1000nmの - NTAは、その感度は50の粒子を測定することができますので、微細な粒子を定量化するための、より一般的な特性評価技術のかもしれません。検量線は、記録されたNTAの直径対ポリカーボネート膜の細孔間の線形相関を示しています。 <table border="1"><tbody><tr><td> リポソームサイズ </td><td> 検知閾値 </td><td> 予想される最小の粒径（nm）の </td></tr><tr><td> 30nmの</td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100nmの</td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400nmの</td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> 表1。Nanosightパラメータ。 ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 圧力と窒素の流れが異なるリポソームの直径の均一性を制御する方法を記述する押出法の図1のフローチャート。リポソーム水和後、サイズの異なる単層小胞は、異なる圧力で異なるポリカーボネートメンブレンフィルター孔を通って押し出されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> 図2：押出後に定量的なリポソームのサイズを記述した動的光散乱（DLS）のデータ。 （1）バーグラフは3リポソーム試料の直径を記述するために示されています。 50nmのポリスチレン（PS）ビーズの校正標準を基準として使用されていました。平均的なリポソームの直径は、各サンプルのバーの上に示されています。 x軸は、ソリューションが押し出された細孔径を示しています。 y軸は、DLSによって記録された直径を示しています。が、30 nmおよび100 nmのサイズの記録大きい400nmの大きさが若干低いのサイズを記録しながら、edは、その細孔径よりも高い値を、検量線（b）は、x軸はポリカーボネート膜の細孔のサイズを表し、y軸は説明して近くに線形相関を示していますDLSでリポソームの直径を記録した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> 押出成形後にリポソームのサイズを記述する図3。ナノ粒子トラッキング解析（NTA）のデータ。 （a）の棒グラフは、各リポソーム試料の直径を表しています。 x軸は、ソリューションが押し出された細孔径を示しています。 y軸はNTAによって記録されたサイズの直径を示しています。平均的なリポソームの直径は、それぞれのサンプルの上にラベルが付けられています。 （b）のNTAのキャリブレーション曲線が記録された直径対フィルター膜の孔径との間のDLSの較正曲線よりも直線的な相関を示しています。 x軸はポリカーボネート膜の細孔サイズを説明します。 y軸はNTAによって記録されたリポソームの直径を示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> 図4。押し出し、続いて各リポソームサイズ（500μM）を示すネガティブ染色透過型電子顕微鏡（TEM）画像。炭素Formvarメッシュグリッドは負の水に1％酢酸ウラニルは34000倍の倍率で乾燥し、イメージングの前にサンプルを染色するために使用されたサンプルの染色、前に退院した。サイズは30、100、400 nmは互いに明確に区別されます。倍率は25000倍に設定されています。スケールバーは0.5μmを表しています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> 図5。タイムコース実験を3リポソームのサイズで行われた。動的光散乱（DLS）は、それぞれのリポソーム溶液直後に押し出しを測定した。すべてのリポソーム溶液は4に格納されていました°Cで一晩。その直径は、一晩インキュベーションした後DLSによって記録された。変更なしにはほとんどが16時間のインキュベーション期間の後に観察された。

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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利害の衝突が宣言されません。

Avestin Liposofast LF-50押出機を用いて、我々は小型、合成リポソームは圧力制御システムを介して作成されている方法を紹介しました。多層小胞が小さいナノ粒子の製造につながる可能性がありリポソーム水和、以下の自発的に形成することに注意することが重要です。これらの小さな多層小胞は、必然的に大規模なフィルター細孔によって生成されたユニラメラベシクル溶液中で不均一性を引...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 02432-25ML </td><td> 95％の安定剤</td></tr><tr><td>ハイグレードのメタノール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50押出機</td><td> Avestin株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート孔</td><td> Avestin株式会社</td><td></td><td>直径25mmの</td></tr><tr><td>ドレインディスクPE </td><td> Avestin株式会社</td><td> 230600 </td><td>直径25mmの</td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

リポソームは人工的に広く、モニター薬物送達4,5、およびカプセル化4タンパク質-タンパク質及びタンパク質-脂質相互作用の3を勉強するためのプラットフォームを模倣して細胞膜として使用されている天然および合成のリン脂質からなる小胞を用意されています。リン脂質は当然ミセルから自分自身を区別し、湾曲した脂質二重層を作成します。6リポソームは、伝統的に二重層のサイズと数、すなわち大規模単層小胞（LUVs）、小型単層小胞（SUV）やマルチラメラベシクル（MLV）は7に分類されています。特に、さまざまなサイズの均一なリポソームの調製は、細胞シグナリング、エンドおよびエキソサイトーシス、膜融合、およびタンパク質輸送8に重要な役割を果たしている膜の曲率を研究するために重要である。 400 - いくつかのグループは、タンパク質は、膜の曲率を伴うため、径のリポソームを調製プロセスが&lt;100を変調するために使用されるかを分析細胞の機能3の行動を研究するためにnmである。その他の関心の9薬剤を運ぶ提供する媒体としてリポソームを勉強して、リポソーム薬物カプセル化に焦点を当てています。リポソーム形成9の間に報告された薬剤のカプセル化を達成することができます。私たちの押出工程はふたつの理由からカプセル化された薬に影響を及ぼしてはならない、すなわち、（1）薬物のカプセル化は、このステップの前に達成されるべきである、（2）リポソームは安全に水性コアに薬剤を運ぶ、その自然の生物物理学的安定性を保持する必要があります。これらの研究目標は、さらに安定したサブミクロンの脂質小胞を設計するために最適化された方法の必要性を示唆している。 それにもかかわらず、現在のリポソーム調製技術（超音波10、凍結と融解10、沈殿）が非常に湾曲した表面とリポソームの調製を許可していない（すなわち、直径&lt;100 nm）で高い一貫性と効率10,5と、生物物理学を制限するemergiの研究膜曲率センサーのngのフィールド。ここで、我々は生物学的に関連したリポソームの様々な堅牢な調製法を提示する。 ガスタイトシリンジとポリカーボネート膜10,5を使用して手動で押し出しが一般的ですが、適用されたマニュアルの圧力の変動に起因するために孔径&lt;100 nmを使用する場合は、異質性がしばしば観察される。我々は、直径30〜400nmの間の範囲の合成リポソームを調製するための一定の圧力制御の押出装置を採用しています。動的光散乱（DLS）10、電子顕微鏡11とナノ粒子トラッキング解析（NTA）12は、我々のプロトコルで説明したように校正標準として使用される市販のポリスチレン（PS）ビーズで、リポソームのサイズを定量化するために使用された。近くに線形相関が満たされている私たちの圧力制御リポソーム製剤の高忠実度を示す、自営業細孔の大きさと実験的に決定したリポソームの間に観察されたHOD。さらに、私たちは、この脂質ベシクルの調製法は、様々なリポソームサイズの独立した、一般的に適用可能であることが示されている。最後に、我々はまた、これらの準備されたリポソームは、最大16時間にわたって安定したことを時​​間経過の研究で実証されている。代表的なナノサイズのリポソーム調製プロトコルは以下に示されています。

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備<sup&gt; 1,2</sup&gt;、リポソーム押し出し、サイズの特性は、本明細書に表示されます。

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K ビュー.  University of Colorado Boulder. このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備 1,2、リポソーム押し出し、サイズの特性は、本明細書に表示されます。

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

生物工学

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

のフィルム押出<em&gt;ハマナabyssinica</em&gt; /小麦グルテンブレンド

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.