押出技術によるリポソームナノカプセルの調製は、コロカシア・エスキュレンタから精製された親水性タンパク質中の48キロダルトンのタリンの捕捉において段階的に行われることが実証されるであろう。ナノカプセルの特性評価のためのすべての手順は、走査電子顕微鏡を含み、動的光散乱も従う。カプジュレーション手順は、脂質の選択から高効率カプセル化の達成に、閉じ込められた分子の生物活性を維持するいくつかの課題に直面する可能性があります。
記述されるプロトコルは、これらの困難のいくつかを克服することができます。分析バランスを使用してリポソーム成分の重量を量る。ロータリーエバポレーターに収まる体積フラスコを使用して、脂質成分をクロロホルムに溶解し、材料の損失を防ぐ。
150 RPMで15分間かき混ぜます。ロータリーエバポレーターを使用してクロロホルムを取り外します。加熱浴から水に接触しながら、最高の効率のために、最良の位置に容積フラスコの口を調整します。
説明したプロトコルに従ってパラメータを設定します。約25分後、フラスコを取り出し、蒸発した溶媒を適宜捨てる。薄く、不透明なフィルムが形成され、容易に視覚化することができる。
1ミリリットル当たり1ミリグラムでタリンを含む硫酸アンモニウム溶液中の脂質膜を水和する。混合物を40分間かき混ぜ、摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、25°C、室温で1分間懸濁液を超音波処理します。
小胞のサイズを小さくし、凝集を避けるために、2つのプリウェットフィルターサポートの間にポリカーボネート膜を置き、ホルダーに置きます。1つの空の注射器をデバイスに挿入し、もう一方をリポソーム懸濁液の1ミリリットルで満たし、反対側に挿入します。2マイクロメータのポリカーボネート孔膜を通して12サイクル押し出しを行います。
サンプルを1つの注射器から別のシリンジにゆっくりと押し込む。最後に、リポソーム懸濁液は、サイズの減少の結果として、遠足プロセス中に明確になる必要があります。サンプルの約2ミリリットルは、このステップ中に失われる可能性があります。
リポソームを超遠心分離で分離する。まず、サンプルをチタンチューブに計量し、チューブのバランスを取ります。充填する最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでボリュームを調整します。
チタンチューブをスイングバケットに取り付けます。遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れます。遠心分離機のドアを閉め、真空を押し、真空が200から20ミクロン未満になるまで待ちます。
超遠心分離機ディスプレイのパラメータを調整します。リコールを押し、条件を確認し、実行を開始します。90分後、真空ボタンをクリックして真空を放し、遠心分離機のドアを開けます。
ローターを内側から取り外します。氷の上に超遠心分離剤サンプルを維持し、その後、ペレットから上清を分離し、チューブを逆さまにして、ペレットから上澄み剤を分離するために使い捨ての59ミル遠心分離機に。非カプセル化タンパク質を含む上清を摂氏4度で保存します。
これは、カプセル化の効率を決定するために使用されます。ペレットは半透明のゼリーとして提示されます。ペレットを懸濁し、HEPES緩衝生理液を加熱します。
詳細については、プロトコルを確認してください。タンパク質定量における脂質干渉を避けるために、Peterson のプロトコルによってカプセル化効率を決定します。サンプルは三重で分析する必要があります。
マイクロフュージチューブでは、リプソーム上清またはBSAを1ミリリットル当たり1ミリグラムで水で希釈し、最終体積1ミリリットルにします。DOC を追加して 10 分間インキュベートします。72%TCAの1ミリリットルを加え、よく混ぜます。
室温で15分間3,000gで遠心分離機。上清を慎重に下向きに逆にして、吸収性の紙の上に置いて乾燥させます。ペレットを1ミリリットルの水に入れます。
ペレットが溶解していることを確認するために十分に混ぜます。次いで、サンプルを試験管に移します。試薬Aを1ミリリットル加え、室温で10分間混ぜ合わせてインキュベートします。
試薬Bを5ミリリットル加え、混合し、光から保護された室温で30分間インキュベートします。750ナノメートルで吸光度を決定し、カプセル化効率を計算します。サイズ平均分布とサイズ分布は、動的光散乱によって決定されます。
リポソームナノベシクルを使い捨てサイジングキュベットに移します。装置の中にキュヴェットを合わせる。機器パラメータを設定します。
安定性を測定するには、リポソームを摂氏4度で保存し、サイズ分布とサイズ平均を定期的に確認します。走査型電子顕微鏡によるリポソーム特性は、ムルタとラマサミーによる三重化で行われる。ペトリ皿の底にガラスカバースリップをテープで固定します。
カバースリップにポリL-リジンを塗ります。ペトリ皿の中に湿ったろ紙を入れて水分を維持し、1時間インキュベートします。蒸留水ですすります。
サンプルを1滴加え、室温で1時間乾燥させます。サンプルを固定するには、リン酸緩衝液で調製したグルタルアルデヒドでそれらをカバーします。ペトリ皿の中に濡れたフィルターペーパーを入れます。
ペトリ皿を密封することが重要です。摂氏4度で48時間インキュベートします。カバーをそれぞれ5分間3回、同じリン酸緩衝液ですすいでください。
エタノール濃度の上昇液を35%から絶対エタノールに洗浄して以下のようにして試料を脱水する。ヘキサメチルジシラザンでサンプルを10分間化学的に乾燥させます。ヘキサメチルジシルラザンは、フームフードの内部で慎重に操作する必要があります。
サンプルは、デシケータの内部または室温で煙フードの内側で一晩乾燥させるべきです。乾燥したサンプルを、カーボンの導電性粘着テープでスタブに取り付けます。金でスタブをスパッタ。
走査型電子顕微鏡SEMで、低真空モードと低電圧、20キロボルトでSEM画像を記録します。図1は、ナノリポソーム製剤について説明する。リン脂質、ドープ、ペグ、およびケムは、主なリポソーム成分を、まずクロロホルムに溶解して脂質膜を得た。
次いで、脂質膜を塩基緩衝液中で再水和し、親水性タンパク質を含む、タリン、封じ込めされ、インキュベーションは一晩前に形成されるべきである。その後、超音波処理および押出しが適用され、小さな単層小胞を生成する。超遠心分離工程は、リポソーム製剤を遊離脂質、および非カプセル化タンパク質から分離する。
上清は、封入効率の決定のために使用される間。上記の方法論を用いて製造されたナノリポソームは、51~396ナノメートルのサイズ分布と、平均155ナノメートルの分布を示す。ポリ分散指数は168であるため、調製は均質である。
リポソームが2マイクロメートルの孔サイズの膜を通って押し出されると、83%の高い封じ込め効率に達する。形態学的ナノリポソーム特性は走査型電子顕微鏡法により評価した。リポソームは、最終的に、より良い品質の画像を得るために、生きている細胞と同様に処理されるべきです。
固定および乾燥のプロシージャは真空条件の下で20キロボルト以上を支えるより小さい無傷の小胞の視覚化を保障するために重要である。図2A及び2Bは、121ナノメートルの範囲で円形のリポソーム小胞を表示し、20キロボルトで分析した。図2Cおよび2Dに対して、不十分に調製されたサンプルを表示する。
誤処理されたサンプルは、真空およびまたは電圧条件に抵抗できない大きく、または損傷した小胞の観察のためにだけ可能である。ここで説明するプロトコルは、円形形状、小表面、および約150ナノメートルの平均サイズを示す再現可能な小胞の製造を可能にする。この方法は、複雑で大きな分子を封じ込め、四量体タンパク質として、親水性矯正剤を呈する。
欠損自己封じ込めは80%より高く、漏れ率は非常に低く、ナノカプセルが摂氏4度で保存されると1.5%に劣る。このビデオが、teriのような大きな分子のカプセル化に役立つことを願っています。
