Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
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CGは、欧州連合（EU）の地平線の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（マリー・キュリーのキャリアの統合n˚8304162）からと欧州研究評議会（ERC）から、アジャンス国立デラRECHERCHE（ANR-13-JSV1-0008）からの助成金によってサポートされています2020年の研究と技術革新プログラム（ERC開始グラントn˚639300）。

磁気ビーズに1リガンド抱合注：リガンド結合は、2.8μmの直径（原液濃度が10 8ビーズ/ mLで、30mgのビーズ/ mL）で超常磁性トシル活性化ビーズを使用して実行されます。以下のプロトコルを、60 mm組織培養プレートにおいて80％コンフルエンシーまで増殖させたMRC-5細胞に相当する約2×10 5細胞のサンプルに基づいています。それに応じて異なる合流で異なるサイズまたは細胞のプレートを使用している場合は、ビーズおよび試薬の音量を調整します。セル当たり2ビーズを持っているために、超常磁性ビーズの量を使用してください。したがって、4×10 5ビーズを60mmプレートに必要とされます。 <ol><li>徹底的に少なくとも30秒をボルテックスすることにより、元のバイアル中のビーズを再懸濁します。 1.5 mLのマイクロチューブに小分けし再懸濁し、超常磁性ビーズ（4×10 6ビーズに相当）の40μLを。 </li><li> 磁気separatiにチューブを置きます溶液から磁気ビーズを分離するためにスタンドに。 、上清を捨て磁気分離スタンドからチューブを取り外し、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。 <ol><li> 1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウム（pH7.4）で二回繰り返して洗浄ステップ。 </li></ol></li><li>最終洗浄後、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。 </li><li>ビーズを含有する1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4に100μgのウシフィブロネクチン（FN）、または任意の他の細胞接着受容体リガンドを結合し、ピペッティングにより混合します。 </li><li> FNまたは陰性対照のためのBSA、ポリ-D-リジンまたはアポトランスフェリンと他の特異的リガンドを置換することによって、前の手順を繰り返します。 </li><li>必要に応じて、ゲル分析のために、架橋効率の分析のためのリガンド溶液の10μLのアリコートを取り、濃縮Laemmliサンプルバッファーの適切な量と混合。 </li><li>ロータに37℃で12〜24時間のためのソリューションを含むリガンドとビーズをインキュベートします。 </li><li>反応はせいぜい10から20秒間、超音波処理（連続39 Wの電力）を発生した後、ビーズ凝集体が現れた場合。 </li><li>磁気分離スタンドを用いてビーズを分離し、残りの溶液を吸引し、1mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6ソリューションを追加します。 37℃でローター上で1時間インキュベートします。 </li><li> 1mLのPBS / 0.2％BSAをpHが7.6で二回磁石を用いた洗浄ビーズ。 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6で再懸濁ビーズ。 </li><li>超音波処理ビーズは、凝集物はせいぜい20〜30秒間表示されます。 </li><li>必要に応じて、（濃縮されたLaemmliサンプルバッファーの適切な量と混合）ウエスタンブロットによって結合効率を分析するために、10μLのアリコートを削除します。 </li><li> 1ヶ月まで4℃で細胞アッセイまたはストアビーズに​​進みます。 </li><li>必要に応じて、磁気ビーズにFN架橋を分析するためにクーマシーブルーでSDS-PAGEゲルおよび染色を実行します。 </li></ol>背に接着受容体に結合したリガンドでコーティングされたビーズ上の張力軍の適用に関する事項細胞の表面<ol><li>適切な成長培地（10％FCSを補充したDMEM通常4.5グラム/ LのD-グルコース）、60ミリメートルの組織培養皿上で培養接着細胞が80％コンフルエントに達するまで。 </li><li>調製非変性非イオン性溶解緩衝液（20mMのトリスHCl pH7.6の、150mMのNaCl、2mMのMgCl 2を、0.1％NP-40）及びチルマイクロチューブ。 </li><li> 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6でセクション1.10を再懸濁からリガンドでコーティングしたビーズをペレット化。暖かい培地と渦の5ミリリットルへのリガンドでコーティングしたビーズ溶液100μLを加えます。 </li><li> 60mm培養皿中の培地を吸引し、5mLにビーズを補充した暖かい増殖培地を追加します。 </li><li>ビーズが沈降し、細胞に接着することを可能にする細胞培養条件（37℃、5％CO 2）下で20分間インキュベートします。ビーズは、食作用によって内在化することができるので、20分を超えないことが重要です。 </li><li>必要に応じて、10倍または20倍オブジェを使用して光学顕微鏡でビーズを観察ctiveと少し取り付け、フローティングビーズとを区別するための皿を振とうすることにより、ビーズの付着を確認してください。 </li><li>インキュベーター内で培養皿を維持しながら、上面に取り付けられたラウンド38ミリメートルのネオジム磁石と蓋のための通常の皿のふたを交換します。磁石は、蓋の下面に配置された2つの小さい13ミリメートルネオジム磁石によって適所に保持されます。磁石は非常に強力であるため、慎重に操作します。 </li><li>細胞培養条件で所望の時間ポイントの張力（37℃、5％CO 2）に供した細胞をインキュベートします。 </li><li>処理後、氷の上に皿を置き、慎重に皿から媒体全体を吸引。 </li><li>細胞溶解緩衝液の300μLを追加し、氷上で10分間インキュベートします。予め冷却し1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞スクレーパーと転送を使用して、溶解物を収集します。 </li><li>磁気分離スタンドを用いた磁気ビーズをペレット化し、新しいプレチルに、全細胞溶解物を転送1.5 mLのマイクロ遠心チューブを編。さらなる分析のために-20℃でこの画分を保管してください。 </li><li> 1mLの氷冷溶解緩衝液でビーズを3回洗浄。 、ビーズペレットに50μLのLaemmliサンプルバッファーを追加し、乾燥ブロックヒーターを使用して、95℃で5分間ピペッティングし、沸騰によって混ぜます。この画分は、単離された接着複合体が含まれています。 -20℃での生化学的解析や店舗に進みます。 </li><li>ビーズ分離（約300μL）後に得られた全細胞溶解物から、ウェスタンブロット分析のために、50μLのアリコートを削除します。 注：そのようなタンパク質 - タンパク質相互作用の研究（免疫沈降、GSTプルダウンアッセイ）またはGTPアーゼ活性実験などのさらなる生化学的研究のために使用することができる左250μL（溶解緩衝液を変更は、関心のGTPアーゼに応じて必要であり得ます）。 </li></ol>

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著者には、競合する金融利益を宣言しません。

ここで説明する方法は、細胞表面接着受容体に張力を適用し、それらのその後の精製を可能にする簡単な方法を構成しています。しかし、いくつかのステップは、効率的な接着精製および潜在的な最適化を行うことが重要である標的接着受容体に依存して行うことができます。私たちは、ユーザーが以下の発生する可能性のある潜在的な問題を提示します。 我々は、2.8μ...

後生動物では、機械的張力は、増殖、分化および生存1、2などの細胞プロセスの無数の調節を介して組織発達および恒常性を指示します。機械的張力は、細胞外マトリックスから生じ得るか、接着性細胞、サンプル細胞外マトリックス上に引っ張ると緊張に敏感な分子を介してその剛性をプローブアクトミオシン収縮機構を介して、それらの細胞外環境を生成することができます。張力に応じて、機械受容接着タンパク質は、複雑なシグナル伝達カスケードを誘発する立体配座の変化を受けます。次に、これらのシグナル伝達経路は、細胞外環境への細胞の挙動を調節、増殖、分化および生存を包含するmechanoresponseを調整します。このようなプロセスはすぐにメカのループにフィードバックするために短期的な期間（数秒から数分）で決済することができます<html>機械受容の構造を変更することによってnotransduction。例えば、インテグリンベースの接着は、Rho GTPアーゼによって媒介される細胞骨格リモデリング3、4、5を介して張力に応じて強化します。並行して、他のシグナル伝達経路は、最終的に細胞の運命6に影響を与える遺伝的プログラムを制御するための時間と日にわたって活性化されます。 、多くの研究は、細胞の決定論と病気の発症1、2上にマトリックス剛性の効果を強調しているのに対し、接着媒介メカノの正確な分子メカニズムはまだとらえどころのないまま。 様々なアプローチは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-tensionセンサ7、流れシステムを含む細胞挙動に対する細胞発生力又は外力の影響を研究するために開発されていますLASS = &quot;外部参照&quot;&gt; 8、コンプライアント基板9、磁気ピンセット、光ピンセット10と、原子間力顕微鏡（AFM）11。ここでは、特定の接着レセプターに適用引張力に応答してメカノ経路を特徴付けるために超常磁性ビーズを使用してプロトコルを提示します。超常磁性ビーズを磁場中に置かれたときに可逆的に磁化粒子です。いったん特定の受容体のリガンドでコーティングされ、これらのビーズは、細胞外加力の影響を研究するための強力なツールを提供します。 17、大部分は接着細胞の生化学的解析を容易にするための利点を提示する-この方法は、いくつかの研究3、5、12により確認されています。生化学分析に続いて同様のコラーゲンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、初期の作品は、の増加を報告しましたテンション5、18、19に応答して、タンパク質チロシンリン酸化およびRhoAの活性化。以下に記載される方法はまた、インテグリン3の張力から下流のシグナル伝達経路を特徴づけるために、フィブロネクチン（FN）でコーティングされたビーズを使用されています。本研究では、Guilluyら。テンションがインテグリン接着複合体への2つのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、LARGとGEF-H1の募集を通じてのRhoAを活性化することを示しました。それ以来、他の研究は、GEF-H1は、ここに記載の方法のロバスト性を実証し、異なる方法20,21を用いて、細胞生じる張力に応じて接着複合体に動員されることを示しました。その結果、活性化されたRhoAは、細胞骨格の再構築を介して、接着強化を促進することが示されました。このシステムはまた、Tの張力を探索するために使用されました細胞/細胞接着レセプターO。インテグリン関連する接着複合体12と同様にビンキュリン募集の増加を誘導したE-カドヘリンの細胞外ドメインで被覆した磁気ビーズ上に力を加えます。コリンズらは、PECAM-1に張力のアプリケーションは、インテグリンとRhoAの活性化13を促進することを観察しました。磁気ビーズを使用して、別の実験的なアプローチは、単離された核の張力の研究です。 nesprin-1核エンベロープタンパク質に対する抗体でコーティングされたビーズを使用して、核エンベロープ複合体は、それらが動的機械的張力22に応答して調節されることを示すために精製しました。これらの結果は、メカノ経路の研究では、このメソッドの力強さをサポートしています。フローまたは牽引力システムは、一般的な細胞プロセスを刺激しながら、さらに、磁気ビーズは、具体的には、受容体リガンドのいずれかを使用して、細胞接着受容体を標的と<suPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 3、または細胞表面受容体13、15に対するモノクローナル抗体。 この方法の別の利点は、簡単なリガンドアフィニティ精製手順を介して接着複合体の単離であります。よく、細胞に対するリガンドでコーティングされたビーズの添加は接着受容体に結合し、いくつかの接着タンパク質23の動員を誘発することが知られています。リガンドでコーティングされた磁気ビーズへの力のさらなる適用は、さまざまなテンション依存性シグナル伝達経路4、24を仲介する巨大分子のプラットフォームにこれらの接着複合体をオンにします。磁石を用いてビーズ濃度に続く細胞溶解は、接着プラットフォームの単離を可能にします。接着複合体を精製するために使用される他の方法は、既に付着細胞に使用されてきました。それらは、タンパク質 - タンパク質相互作用を節約するために化学的架橋を組み合わせます洗剤および剪断流または超音波処理20、21、25、26、27、28による細胞溶解ステップ。最後のステップは、接着複合体を含む得られた腹側形質膜のコレクションです。これらの方法とは異なり、磁気ビーズを選択的接着受容体の特定のファミリーを標的とすることにより、細胞接着複合体の高い精製度を可能にします。磁気ビーズは、既にリガンドでコーティングされたマイクロビーズ29、30に取り付けられた非付着性細胞内接着複合体を精製するために使用されてきました。力は、短い持続時間（分秒）に適用される模倣生物学的状況下に記載の方法。したがって、精製された接着複合体の分子組成の両方を調査するための強力なツールを提供し下流の機械受容シグナル伝達経路。 ここでは、接着表面タンパク質に引張力を適用するために磁気ビーズを使用するための詳細な実験プロトコルを提示します。永久ネオジム磁石は、培養皿の表面の上に配置されます。シングル2.8μmの磁気ビーズ上の力は一定（約30〜40 PN）31となるように、磁石の磁極面は6ミリメートルの高さに配置されています。張力刺激の持続時間は、対象の分子と活性化のその時間スケールに応じてオペレータによって決定されます。細胞は、最終的に接着複合体は、磁石を用いてビーズ分離によって精製され、生化学分析が処理され、溶解されます。このプロトコルは、リガンドでコーティングされた超常磁性ビーズの準備、および生化学的分析に続いて、磁石を通して緊張のアプリケーションが含まれています。さらに、当社は、張力がインテグリンベースのADHに適用されることを実証するデータの代表的なサンプルを提供しますesions接着リモデリングを誘導し、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

機械受容細胞表面接着複合体は、細胞がその周囲の機械的特性を感知することを可能にします。最近の研究では、接着部位での力感知分子、および系統特異的遺伝子の発現を調節し、表現型出力を駆動力依存性転写因子の両方を同定しました。しかし、生化学的経路に機械的張力を変換するシグナル伝達ネットワークは、とらえどころのないままです。細胞表面受容体に適用される機械的張力の際に係合したシグナル伝達経路を探索するために、超常磁性マイクロビーズを使用することができます。ここでは、細胞表面接着タンパク質に力を適用するために磁気ビーズを使用するためのプロトコルを提示します。このアプローチを使用して、様々な生化学的アプローチによってのみならず力依存性細胞質のシグナル伝達経路を調査することが可能であるが、リガンドでコーティングされたビーズに付着した接着複合体の磁気分離によってリモデリングを接着します。このプロトコルは、リガンド - コの準備を含んでいます超常磁性ビーズをated、と定義する引張力の適用は、生化学的分析が続きます。さらに、我々はインテグリンベースの接着に適用し、そのテンションを実証するデータの代表的なサンプルを提供する接着改造をトリガし、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。

技術の概略は 、 図1Aに示されています。リガンド結合後、磁気ビーズを20分間、細胞と共にインキュベートされ、その後、永久磁石は、時間の様々な量を約30〜40 pNでの引張力を適用するために使用されます。 図1bは、MRC5細胞接着受容体に結合した2.8μmのFNで被覆した磁気ビーズを示します。 細胞溶解後の超常磁性ビーズの洗浄ステ?...

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Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K ビュー.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR. 彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。 

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

細胞収縮を定量化するための苦情の行列の準備

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

生物工学

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

生化学

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ心臓における磁気ビーズを用いたin vivoメカノトランスダクション研究

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ゼブラフィッシュの心臓の形成に関与する機械的な力を理解する

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

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磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

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推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

トラクション力顕微鏡用の細胞培養表面近くのローカライズレポーター蛍光ビーズのための新しい方法

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作

磁気ビーズを用いたゼブラフィッシュの心臓部における機械的な力の操作