この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。

1。フローセルの準備<ol><li>カバーガラス（＃1.5、22x22 mmと22x40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。 <ol><li>カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。 </li><li>イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。 </li><li>イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または類似のデバイスによって生成された脱イオン水のおびただしい量でカバースリップをすすいでください。水で容器を満たし、20分間超音波洗浄します。 </li><li>超音波処理した後、濾過し、埃のない空気の流れにカバースリップを乾燥させます。 （すなわち、汚れ）きれいに見える唯一のカバースリップを使用しています。 </li><li>静かに炎が数秒間カバースリップは、残っているほこりや湿気からそれらをきれいにする：過剰な熱のためにカバースリップをワープしないように注意しながら、ブンゼンバーナーで生成ガスの炎を介してカバースリップを渡します。このステップでは、残留表面を削除します汚染物質。 </li></ol></li><li>両面スコッチテープを使用して、2つのカバースリップを添付してください。テープカット〜長さ3センチ、幅0.3センチメートル。真ん中の1.6 cmのチャネルを残して22x40 mmのカバースリップ上のテープを取り付けます。穏やかにテープが正しく付いていることを確認するためにカバースリップを下に押すようにピペットチップを使用しています。 </li></ol> 2。磁気ピンセットのセットアップとキャリブレーション<ol><li>磁気ピンセットは、以前に10,12説明したように永久的な希土類磁石を使用してセットアップした。アルミL型ブラケットは1 mm径のピンホールを使って構築および垂直方向のz変換（Thorlabs）ピンセットの高さを調節するために装着した。 2つの永久希土類磁石は、磁気トラップ（ 図1）を作成するためのピンホールの両側にブラケットに取り付けた。 </li><li> DNAの調製：その5 &#39;および3&#39;末端標識したラムダファージからのDNAをビオチンとジゴキシゲニン（IDT DNA、サンディエゴ、CA）の端部が眼のキャリブレーションをするために使用されたneticピンセット。 <ol><li> 60〜40 nMのビオチンコンジュゲートオリゴヌクレオチドと熱の2μL℃で10分間で4 nMでλ-DNA50μLを混合します。 1時間かけて室温でゆっくりとクール。 </li><li>製造元の仕様に従って、DNAリガーゼを追加し、3時間室温でライゲーション。 </li><li> 45分間室温で400nmのジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドとインキュベート2μLを追加します。 </li><li> 10mMのATPの1.5μLを追加し、3時間λ-DNAをジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドのライゲーションを続行します。 </li><li> 100 kDaのスピンフィルタ（マイクロコンUltraCellはYM-100）を使用して、過剰なオリゴヌクレオチドおよびDNAリガーゼを削除します。 TEバッファーで1000倍のバッファー交換の合計は、過剰なオリゴヌクレオチドを​​除去するために十分である。注：DNAの剪断につながるので、スピン速度&gt; 500xGを使用しないことが重要です。 </li><li>そのDNA I確保するために0.7％アガロースゲル上で電気泳動によるDNAのサンプルを調べるsは変性またはせん断はありません。 </li><li> DNAの濃度を測定します。使用可能なサンプル量が非常に小さい可能性があるため、光度計紫外 - 可視分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）の使用が推奨されます。 </li></ol></li><li>セクション1で説明したようにフローセルを準備します。 </li><li>フローセルへのDNAの結合のための、抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジIgG、1μgの添加-1;バイオロシュ、マンハイム、ドイツ）を追加し、それが15分間ガラス表面に付着することができます。 </li><li> 1X PBSで2ミリグラムmL -1の BSA、0.1％Tween-20を追加することにより、DNAの非特異的付着を防止するために、フローセルの表面を不動態化。 45分間室温でインキュベートします。 </li><li>手順2.5を繰り返します。 </li><li> fuctionalizedλ-DNAの50 pmを追加し、15分間カバースリップにアタッチすることができます。 </li><li> 1X PBSで過剰なDNAを洗い流す。 </li><li> = 20μgのmL -1のは 2.8μmのビーズを、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の追加</s&gt;アップ）し、それらを15分間固定化DNAにアタッチすることができます。 </li><li> 1X PBSで過剰なビーズを洗い流す。 </li><li>磁気ピンセットのキャリブレーション<ol><li>遠く離れて試料表面から（&gt; 15 mm）である位置に永久磁石を移動します。 </li><li>顕微鏡で準備されたフローセルを配置します。 </li><li>フローセル上の位置に永久磁石を移動します。 </li><li>離れてガラス面の両方からビーズに焦点を当ててλ-DNAの官能ビーズの焦点面を選択します。正しい焦点面は、所望のビーズが明るい中心を持っているものである。 </li><li> 500フレームの場合、80 Hz以上ではビーズの動きのビデオを取る。 </li><li>近い試料表面に磁石を移動します。 5ミリメートルを超えた距離については、1ミリメートル単位で移動します。 1〜5ミリメ​​ートルの間の距離については、0.5ミリメートル単位で移動します。 1ミリメートル未満の距離で、0.25ミリメートル単位で移動します。 </li><li>それぞれの新しい磁石の位置にステップ2.11.5と2.11.6を繰り返します。 </li><li>各データの2Dガウスフィットを用いてビーズの中心を追跡し、設定します。 </li><li>を使用してブラウンの変動を介して力を計算します。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> K B Tはボルツマンの熱エネルギーである、Lは λ-DNAの長さであり、&lt;x 2&gt;重心位置の分散である。 <ol start="10"><li>ロールオフ周波数を見つけるために、パワースペクトルローレンツフィットを介して力の計算をチェックすることによって、力の精度を確認してください。応用力の関係でロールオフ周波数に関連しています。 </li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> ƒ0がロールオフ周波数である、ビーズの半径であり、μは流体の粘度は12です。 </li></ol> 3。フローセルにコラーゲンペプチドアタッチメント私たちの方法論を適用するための具体的な例を提供するために、我々は三量体コラーゲンモデルペプチドのタンパク質分解の特徴を我々の研究室における最近の研究について説明します。我々は、この一般的なアプローチが広く、他のタンパク質およびポリヌクレオチドに適用することができることを期待しています。 <ol><li>コラーゲンモデルペプチド三重らせん形成を強制するために5倍のmycタグ、（GPP）10、続いて精製するためのN末端​​6X Hisタグ、フォームコラーゲンα1残基772から786（GPQGIAGQRGVVGL）、MMPを構成されてい1認識部位、foldonシーケンス（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）、およびビオチン-マレイミドでラベルを容易にするために、C末端KKCK。 Foldonは、T4ファージのタンパク質fibritinから派生し、Nのいずれかで融合させたときにコラーゲンモデルトリマーを安定化させる-またはC末端13,14。 </li><li>以前は4,15説明したようにコラーゲンペプチドおよびMMP-1蛋白質を発現させ、精製した。&lt;/ LI&gt; <li>抗-mycフローセルの表面にアタッチできるように室温で20分間フローセルとインキュベートする（15μgのmL -1）を抗-mycを追加します。 </li><li>ステップ2.5で説明したのと同じ方法で、5 mgのmL -1の BSAを用いたタンパク質の非特異的付着を防ぐために、フローセルを不動態化する。 </li><li> 150 PMのコラーゲンペプチドを追加し、45分間mycタグを介して抗体に添付することができます。 </li><li> PBS緩衝液を用いて過剰なコラーゲンを洗い流す。 </li><li>ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の 2.8μmのビーズ= 20μgのmL -1）を追加し、それらを45分間コラーゲン分子にアタッチすることができます。 1μmのビーズをPBSで所望の濃度に希釈する必要があります。 3μmのビーズをPBSでresolubilized強力な磁石を使用して、溶液から分離する必要があります。このプロセスを3回繰り返す必要があります。我々は、このステップは、GEにとって不可欠であることに気づいたT 3μmのビーズは、表面固定化コラーゲンペプチドに結合する。 </li></ol> 4。力のタンパク質分解アッセイ<ol><li>一度フローセルは、低〜1 pNの力の下で磁気トラップ内のイメージフローセルは、コラーゲンペプチド、磁気ビーズで組み立てられています。我々の経験では、ビーズの集団は、しばしば弱く、非特定の方法で表面に付着されています。ささやかな力のアプリケーションは、これらのビーズは解放であることを保証します。 </li><li>フローセルに活性化酵素を追加します。このケースではMMP-1は3.5 mMのAPMA（4 - aminophenylmercuricアセテート）を追加することによって、事前に活性化され、3時間37℃でインキュベートした。活性化は、SDS-PAGEを用いて検証した。 </li><li>フローセルは、磁気ピンセット装置に再導入されているとすぐに、通常は数百添付のビーズをもたらして、ビューのいくつかのフィールドにまたがるビデオを記録します。これは 、t = 0になります。 </li><li> tを返すときにビュー（のいくつかのフィールドを記録するのと同じプロセスを繰り返します。、定期的な時点で）ビューの同じフィールドをoすべてのビーズは切り離すまでまたはそれ以上のタンパク質分解は、識別可能ではありません。 </li><li>キネティック·データ解析<ol><li>異なる時点でのビューの様々な分野でビーズをカウントし、それらを平均。 t = 0でのビーズの数によって各時点でビーズの平均数を割ることによってビーズの数を正規化します。ビーズの絶対数は、実験に実験とは異なりますので、これは、我々は別の実験からタンパク質分解の速度を比較することができるようになります。 </li><li>時間の関数としての比をプロットします。このケースでは、指数関数的減衰に加えて定数にそれを装着。 </li></ol><img alt="式（3）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> f（t）は （またはコラーゲン分子がunproteolyzed）を添付したビーズの比であるここで、tは時間であり、コラーゲンのテザーによって結合ビーズの割合で、bは減衰率は一定であり、c非特異的に接続されているビーズの割合です。 <ol start="3"><li>同じ実験はMMP-1によるコラーゲンのタンパク質分解に力の効果を明らかにする力とMMP-1濃度を変化させることで繰り返されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果上記のプロトコルは、酵素のタンパク質分解に力の効果を研究するための磁気ピンセット（ 図1）の新たな使用方法について説明します。我々は、観測されたブラウン運動の変動の大きさと様々な磁石の位置（ 図2）でロールオフ周波数の計算の両方を使用して、1μmと3μmのビーズ用ピンセットを校正されています。力のタンパク質分解実験では、セットアップでは、DNAはコラーゲン（ 図3、図4）に置き換えられていることを除いて似ています。残りのビーズの正規化数は、タンパク質分解率（ 図5）を見つけるために時間の関数としてプロットすることができ、このプロセスはすることができます酵素濃度と力を変化させるために繰り返されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> 図1磁気トラップのキャリブレーションプロセスの模式図（スケールしないように）。 2つの永​​久希土類磁石は、超常磁性ビーズを引っ張る磁場を作成します。上下に磁石を翻訳することに加わる力を調整します。ビーズは、二つの磁石の間にピンホールを通過した光で、従来の明視野顕微鏡を用いて画像化されている挿入図 ：40倍空気の目的で撮影した画像。シャープ、丸いスポットはカバースリップの表面に付着したビーズに対応しています。アウト·オブ·フォーカスオブジェクトがデタッチされたビーズです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> 図2は1μm（ 左 ）および2.8ミクロン（ 右 ）ビーズのために試料表面から磁石の距離の関数としてのキャリブレーション力のプロットだ。データは、経験的関数に適合させた<img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> ここで、x は、磁石からの距離です。= 31.8、B = 5.61、cは1μmのビーズとのために= 4.39 = 140、B 3μmのビーズ= 3.10とc = 1.86。これらの値は、私たちの特定の測定器と実験的幾何学に固有であり、各楽器を個別に校正する必要があります。各ポイントでのエラーバーは、ビーズの大きさのばらつきに起因するビーズ基礎にビーズ上に印加される力の約10％の変動を表しています。加えられた力は、ビーズの体積に比例し、ビーズ量は（メーカーの仕様に応じて）平均以上〜9％に変化します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> 図3。フォースタンパク質分解アッセイのセットアップ（実寸ではありません ）。コラーゲンモデル三量体は 、mを介してカバースリップの表面に取り付けられているYC /抗-myc共役。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、ビオチン - ストレプトアビジン結合を介してコラーゲントリマーに取り付けられている。活性化MMP-1カット時間の経過とともにコラーゲン、ビーズ表面からデタッチし、焦点面から離れて移動させる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> 図4：時間の関数としてのタンパク質分解の模式図漫画。タンパク質分解が発生すると漫画は、時間の経過ビューのサンプルフィールドを示しています。時間が経つにつれて、MMP-1カットコラーゲンとビーズがデタッチと磁場の影響下で焦点面から離れて移動します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> 図5。タンパク質分解率が適用された力16に依存しています。 6.2 PN（3μMのMMP-1、 赤 ）および13 PN（0.2μMのMMP-1、 メイジ 、1.0 PN（ ブラック 3μMのMMP-1）で収集したデータも示されNTA）。タンパク質分解の速度（フィットパラメータ）は次のとおりです。0.22±0.02分-1（1 PN）、0.46±0.09分-1（6.2 PN）、および2.08±0.18分-1（13 PN）。長い時間のポイント（&gt; 15分）unproteolyzedビーズの割合は、異なる実験間で〜0.25でほぼ一定のままです。エラーバーは、各時点で観測値の数を反映したポアソン統計に対応しています。 n個のビーズの各時点でのエラーは 、n 1/2である。接続されているビーズの割合で発生したエラーは、エラーpropagation.1μmのビーズが1.0 pNで、6.2 pNの実験に使用した、2.8μmのビーズが13 pNの実験に用いたことにより算出した。

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利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。 磁気ピンセットの制限事項光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、こ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x22） </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x40） </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td>ラムダDNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td>マイクロコンウルトラYM-100 </td><td>ミリポア</td><td> 42413 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td>シグマ</td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> 抗 Myc抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 46から0603 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td>ダイナビーズM-280ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td>ダイナMyOne T1ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> P-Aminophenylmercuric酢酸</td><td>カルビオケム</td><td> 164610 </td></tr><tr><td>ビオチン - マレイミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1267 </td></tr><tr><td>ビオチンは、オリゴを標識した</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>オリゴ標識したジゴキシゲニン</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>コラーゲンペプチド遺伝子</td><td> DNA 2.0 </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td> MMP-1のcDNA </td><td>ハーバードプラスミドデータベース</td><td></td></tr><tr><td> Z-変換</td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td>翻訳者のためのサーボコントローラ</td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。 このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K ビュー.  Stanford University. この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

生物工学

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

生化学

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>1分子アッセイを用いたテロメアDNAとのTRF1/2相互作用の研究

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper function depends on tightly regulated processes of replication, elongation, and damage response. The shelterin complex, especially Telomere Repeat-binding Factor 1 (TRF1) and TRF2, plays a pivotal role in telomere protection and has emerged as a potential anti-cancer target for drug discovery. These proteins bind to the repetitive telomeric DNA motif TTAGGG, facilitating the formation of protective structures and recruitment of other telomeric proteins. Structural methods and advanced imaging techniques have provided insights into telomeric protein-DNA interactions, but probing the dynamic processes requires single-molecule approaches. Tools like magnetic tweezers, optical tweezers, and atomic force microscopy (AFM) have been employed to study telomeric protein-DNA interactions, revealing important details such as TRF2-dependent DNA distortion and telomerase catalysis. However, the preparation of single-molecule constructs with telomeric repetitive motifs continues to be a challenging task, potentially limiting the breadth of studies utilizing single-molecule mechanical methods. To address this, we developed a method to study interactions using full-length human telomeric DNA with magnetic tweezers. This protocol describes how to express and purify TRF2, prepare telomeric DNA, set up single-molecule mechanical assays, and analyze data. This detailed guide will benefit researchers in telomere biology and telomere-targeted drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:テロメアタンパク質-DNA相互作用を調査するための高度な単一分子技術

This protocol demonstrates using single-molecule magnetic tweezers to study interactions between telomeric DNA-binding proteins (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] and TRF2) and long telomeres extracted from human cells. It describes the preparatory steps for telomeres and telomeric repeat-binding factors, the execution of single-molecule experiments, and the data collection and analysis methods.