Name: measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum
Uploaded: 2017-03-01T10:30:00.000+00:00
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保健省とヒューマンサービスの規制に準拠する非識別組織サンプル、45 CFR 46.101（b）は（4）が付与されたを使用して研究を行うための免除の承認（3002から13）。全層皮膚を待機手術から受信されます。この記事では、組織供給源は、66歳の白人女性の胸です。 エラストマーコーティングされたカバーガラスの作製<ol><li> 20mLのガラスバイアルにおいて、5.893グラムベースでのSylgard 184硬化剤の0.107グラム混ぜます。 1：全混合物の質量は55のエージェントの比率を硬化する塩基で6グラムです。 </li><li>均質性を確実にするためにガラス棒を用いて混合した後、すべての気泡を除去する真空チャンバと脱ガスガラスバイアルを置きます。 </li><li>スピンコーターの中心にガラスカバースリップ（55ミリメートル×25 mm）を配置します。カバースリップの中央に混合物の約1 mLを加え。ハサミで切断端と5,000μLピペットを使用してください。スピンコート60秒間2,000 rpmでカバースリップ。 <ol><li>このPを繰り返し5-6の基板を作成するrocess。 </li></ol></li><li> 60℃で12時間、オーブンでカバーグラスを治します。 </li><li>部分的に犠牲基板からエラストマー膜を除去するためにカミソリの刃を使用してください。エラストマーフィルムと露出したガラスの上側をマークするために、消えないマーカーを使用してください。 </li><li>倒立顕微鏡でサンプルをマウントし、2つのマークの焦点面との間のz高さの差を記録するために、リモートフォーカスアクセサリを使用しています。これは、エラストマー基板の厚さ、hに対応します。 </li></ol>角質層の調製<ol><li>半分を60℃に、脱イオン水（DW）を充填したガラスビーカーを加熱するために水浴または加熱撹拌プレートを使用してください。生物学的安全キャビネットの内部には、4分間水中での全厚ヒトの皮膚を浸します。 </li><li>すぐにDWは4分間、&lt;10℃に冷却含むビーカーに皮膚サンプルを転送します。ビーカーを埋める半分は生体有害物質の飛散を最小限に抑えます。 </li><li>曲がった鼻の組織ピンセットを用いて表皮を分離優しくペトリ皿でビーカー、場所から肌を削除し、。 </li><li>ガーゼを敷いたペトリ皿に分離された表皮基底側を下に置きます。基底層が完全にガーゼと接触していることを確認します。 <ol><li> 0.25％（重量/容量）を室温で6-8時間、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水に溶解したIX-Sブタ膵臓トリプシン溶液を入力中にガーゼを浸し。ガーゼを湿らせる容器に十分なだけのトリプシンを追加します。 </li></ol></li><li>組織ピンセットでガーゼを持ち上げて、部分的にDWを充填した容器の中に浮かんでいます。ゆっくりガーゼからそれを分離するためにSCを引きます。 </li><li> SCに付着したまま残留表皮組織を除去するために、DWで角質層3-4回洗浄します。 </li><li> DWで0.4％グリシンマックス（大豆）トリプシン阻害剤の溶液中に単離されたSCフロート。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。 </li><li>部分的にペトリ皿にSCフロートDWで満たされました。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。 </li><li>室温で48時間超微細プラスチックメッシュ上に、単離されたSC紙を乾燥（25℃、40％相対湿度（RH））。 </li><li>メッシュからSCを分離し、円形の穴パンチを使用して、個々の円形R = 3mmの半径サンプルを切り出します。マーク消えないマーカーを用いた小型のスパイラルマークの付いた一番外側の面の中心。これは、SCの上側を認識するための視覚的な手がかりを提供します。 注：足跡は、乾燥変形が最小になる試料の中央に適用されるべきです。これは、記録された乾燥変位プロファイル上のマーカーの影響を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 3.サンプル処理と堆積<ol><li> 90μL蛍光マーカービーズを含む15 mLのDWで30分間SCサンプルを攪拌（505/515 nmで、直径1μm、カルボキシレートは、修飾されました）。 SCの表面にこの預金ビーズ 注：ながらリットルの堆積SC上のビーズのARGE数は、それが続いて得られる面内変形場の空間分解能をビーズ現在12ないサンプルにわずかに遅い乾燥を相対的に最大にすることができます。追加されたビーズ容量の選択は、したがって、 アドホックなされるべきです。 </li><li> SCサンプルを削除し、部分的にDWで満たされたペトリ皿に配置します。 </li><li>部分的に15-30°の浅い角度でDW内の基板を浸します。 </li><li>基板と水の界面との間の接触線での浮動SCサンプルのエッジをピン。垂直方向にスムーズにしわや閉じ込められた気泡のない基板へのSCサンプルをラミネートします水から基板を取り出します。 </li><li>各基板上に6 SCサンプルまでを配置するための手順を繰り返し3.4。サンプルの間に少なくとも2〜3ミリメートルのギャップのままにして、基板エッジに近いサンプルの積層を避けます。これは別のもので、乾燥変位に影響を与える一つの試料の乾燥を防ぐことができます。 </l私&gt; <li> 60分間実験室条件に搭載SCサンプルを乾燥させます。これは、SCと基板との間の残留水が蒸発することを可能にし、完全な組織接着を確実にします。 注：この時点では、SCサンプルは時間の必要な期間、所望の溶液中に逆さまに基板を配置することにより、化学的または化粧品配合物7,8を用いて治療することができます。処理工程が実行されると、ステップ3.6を繰り返します。乾燥した後、基板にSCサンプルの不完全密着は、透過光顕微鏡を用いて確認することができます。 SCサンプルまたは剥離縁下敷き気泡が明確に定義されたエッジを有するサンプル中の明確なコントラスト変動を形成することになります。 </li><li>部分的に密閉された容器に水で満たされたペトリ皿を置くことによって、湿度室を作成します。 </li><li> 24時間チャンバ内に置き基板は、99％の相対湿度に平衡化します。ペトルに基板を配置しないでください私は皿。 </li></ol> 4.顕微鏡環境制御<ol><li>顕微鏡マウント灌流チャンバーに接続された湿度制御システムを介して環境条件の制御を達成します。湿度制御システムの詳細は、ドイツらに設けられています。 （2013年）7と劉とドイツ（2015年）8。 </li><li> 、顕微鏡上に基板をマウント基板上に灌流チャンバーを配置し、真空グリースを使用してエラストマーに灌流チャンバーの端をシールします。 </li><li>一度取り付けられ、実験前に99％RHに内部の空気を平衡化。これは、実験前に水の蒸発を防ぐことができます。セクション5または7での撮影が始まったら、所望の値に内部の空気の湿度を低下させます。 注：この記事では、SCのサンプルを25％RHに乾燥しています</li></ol>飛行機乾燥変位5.イメージング<ol><li>反転microscoを使用して、SCサンプルの画像を取得1X対物レンズとPE。 FITCフィルター（503から530 nmの放射帯域）の光エンジンを用いた蛍光ビーズを励起します。複数のサンプルは、自動化されたX-Yステージを使用して乾燥を通して連続的に撮像することができます。 </li><li> 1392 X 1040ピクセルの解像度でデジタルCCDカメラを使用して、レコード蛍光と透過光画像。各画像の視野は、完全なSCのサンプルをキャプチャするために単一の画像を可能8.98 X 6.71 mmです。 16時間10分の頻度で画像を取ります。 </li></ol>厚測定のための6基質の準備<ol><li>いくつかの小さなプラスチック製のキャップで、化学ヒュームフードでは、1 mLのシラン（≥98％3-アミノプロピルトリエトキシシラン）を配置。セクション1と5時間密閉容器内キャップからエラストマー基板を配置します。基板は、シランと直接接触して来ないようにしてください。 </li><li> 1.5 mLチューブに、5 EDCのMG（≥99％Nエチルカルボジイミド塩酸塩- - （3-ジメチルアミノプロピル）N）を追加します。 50を追加します。EDCへのDWの0μL。ボルテックスミキサーで10秒のためのソリューションを撹拌。 </li><li> 20 mLのDWに0.076グラムの四ホウ酸ナトリウムおよび0.1グラムのホウ酸を追加します。 70℃（1時間）で、マグネチックスターラーを用いて混合します。 pHが7.4になるまで、ホウ酸を追加します。 </li><li> 50 mL遠心管にホウ酸緩衝液の20 mLを加え。ホウ酸緩衝液に1μmのビーズ（575分の535 nmのカルボン酸で修飾された）の60μLを追加します。最後に、ボトルにEDC溶液200μLを追加します。ビーズ溶液を混合するためにチューブを振って、その後、直径10cmのペトリ皿に注ぎます。 </li><li>コンテナからシラン化基板を取り外し、それらをダウンビーズ溶液中にフィルム側をエラストマー置きます。捕獲されたなってから気泡を防止するために、ゆっくりと行ってください。二つの基板は、各ペトリ皿に収まります。 </li><li> 45分間ビーズ溶液中で浮いているように、基板を残します。 </li><li>結合していないビーズを除去するために、DWで洗い流した後、ビーズ溶液から基板を除去するためにピンセットを使用します。 </li><li>空気は、基板を乾燥させます。以上の圧縮空気を吹き付けますエラストマーフィルム表面が水のスポットの形成を減少させます。 </li><li> SCサンプル沈着までビーズの光退色を防ぐために、不透明なボックス内の基板をシール。 </li></ol> SCの7イメージング厚さ<ol><li>ただし部3を用いて基板上へ預金SCサンプルは、DWに蛍光ビーズを追加することなく、ステップ3.1を実行してください。さらに、ステップ3.6が完了する前にピペットを用いて各堆積SC試料の表面に希釈していない蛍光マーカービーズ溶液（505/515 nmで、直径0.1μm）の5μLのドロップを適用します。 </li><li> 40X対物レンズと顕微鏡を使用してSCの厚さの測定値を確立します。 SC-基板界面とSCの上側に位置する2つのビード層の焦点面との間のz高さの差を記録するためにリモートフォーカスアクセサリを用いて経時SC試料の厚さを測定します。 </li><li> 3時間の乾燥期間にわたって各SC試料の3つの領域の厚さを測定します。厚さSC試料のこの時間枠8内の定常状態値に達します。 </li></ol> 8.定量化とモデリングの組織変形<ol><li>記録された各時間ステップで蛍光画像から空間分解の面内乾燥変位を得るために、粒子画像流速13を使用してください。 </li><li>各放射状に対称SCサンプルの変位場から方位角平均半径方向および方位角の変位プロファイルを得るためにMATLABを使用してください。 注：例えば、データセット（題する &#39;d.mat&#39;）と、この工程および8.3の両方を実行するMATLABコード（題する「PIV-processing.m &#39;）は補足情報で提供されています。 </li><li>収縮線形弾性circulaとして乾燥SCを記述するモデル7、8、14、15、16に半径方向の変位プロファイルを適合、E.がSCを想定弾性率を有する変形可能な弾性基質に付着厚さ、時間SC、半径R、および弾性率、E SCを 、時間変化のRディスクは、よく定義され、一定のポアソン比を有する、νSC = 0.4 7 、8。最小二乗法を使用して最高のフィットを取得します。 注：フィッティングのために使用されたモデルが修正ベッセル関数の面で放射状の変位を説明します： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" /> （1） とともに<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" /> 、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" /> 用語<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" />によって与えられる浸透深さに対応し、 <img alt= &quot;式&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55336 / 55336eq7.jpg&quot; /&gt;。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" />基板の剛性パラメータです。有効サンプルサイズは、基板の厚さよりもはるかに大きい場合。ここでは、パラメータ<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" />それぞれ基板厚ポアソン比を表します。シリコーンエラストマー基板17のポアソン比をν= 0.5です。 </li><li>モデルパラメータは、半径方向の変位プロファイルに式（1）の最小二乗適合から、各時間ステップで、α、β得ます。 <ol><li>式を使用して、SC弾性率、E SCを得るために、フィッティングパラメータβを採用し、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" /></li><li>収縮乾燥STRE時間変化を得るために、フィッティングパラメータαを使用しますssは、PSC、式を使用して、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" /></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

この記事では、動的な乾燥挙動とヒトSCの機械的特性を測定するために使用することができる技術を説明します。以前の研究は、この技術は、環境条件、一般SC 7,8の動的な乾燥挙動の化粧品洗浄剤及び保湿に使用される化学製品の効果を定量するために使用することができることを実証しました。プロトコルにおける重要なステップの数があります...

最も外側の表皮の層、または角質層（SC）は、脂質が豊富なマトリックス1、2に囲まれた凝集角質細胞の細胞からなります。 SCの組成と構造的完全性は、微生物からの侵入を防ぎ、機械的な力と過度の水分損失4の両方に抵抗する正しいバリア機能3を 、維持するために必須です。皮膚のバリア機能を維持又は低下させるためにパーソナルケア製品の容量は、皮膚、医療および化粧品産業5に大きな関心があります。パーソナルケア製品の毎日の適用はSC 6、7、8の機械的特性を変化させることが知られています。例えば、化粧品の洗浄剤に含まれる界面活性剤は、弾性率とのビルドアップの大幅な増加を引き起こす可能性があります、SC内の応力を乾燥7をクラックする組織の傾向を増加させること、9。ほぼすべての化粧料の保湿剤に含まれるグリセロールは、SCを柔らかくし、組織破壊の可能性を減少させる、乾燥ストレス8、10、11の蓄積を減少させることができます。 この記事では詳細な方法は、動的な乾燥挙動と制御された環境7、8でSC乾燥の機械的特性を定量化することが可能です。以前に、この技術は、動的な乾燥挙動の変化やSC組織の機械的性質の異なる化粧品の効果を解明することができることが実証されています。これは、単純で乾燥変位フィッティング、ソフトエラストマー基質に付着ヒトSC組織の乾燥誘導性の収縮を定量化することによって達成されます。次に収縮モデル、及び弾性係数を抽出し、嵌合プロファイルから応力を乾燥。複数SC試料の検査が必要な場合、この方法は、一軸tensometryのより迅速な代替手段を提供する著しく少ない組織を利用し、試料裏面からの蒸発を防止することにより、より生理学的に適切な乾燥を提供します。

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer base</td><td>Dow-Corning</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer Curing Agent</td><td>Dow-Corning</td><td>1015311</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 0.1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8823</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m nile red fluorescent 535/575&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8819</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type II-s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0294</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-Dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer mixer</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>6 mm diameter hole punch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z708860</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 6-LCR-SB&amp;nbsp;</td><td>Lummencor light engine</td><td>No.3526</td><td></td></tr><tr><td>Cfi Plan Achro Uw 1X Objective</td><td>Nikon Plan UW</td><td>MRL00012</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20&amp;nbsp;mm wd</td><td>Nikon Plan Fluor</td><td>MRH01401</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53200</td><td></td></tr><tr><td>Clara-E Camera</td><td>Andor</td><td>DR-328G-C02-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design</td><td>Nikon</td><td>99888</td><td></td></tr><tr><td>Ti-S-E Motorized Stage</td><td>Nikon</td><td>MEC56110</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum

角質層（SC）は、ほとんどの表皮層です。外部環境との接触は、この組織層が、洗浄剤および周囲湿度で毎日変動の両方に供されることを意味します。その両方は、組織の水分含有量を変化させることができます。重度のバリア機能不全または低湿度環境からの水分含有量の減少は、SCの剛性を変化させ、乾燥ストレスの蓄積を引き起こす可能性があります。極端な条件では、これらの要因は、組織の機械的破壊を引き起こす可能性があります。私たちは、乾燥時にSCの機械的特性の動的変化を定量化するハイスループット法を確立しました。この技術は、乾燥挙動の変化や化粧品洗浄剤と保湿剤治療とSCの機械的特性を定量化するために使用することができます。これは、エラストマー基材に接着円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位における動的変化を測定することによって達成されます。面内の半径方向の変位ACQ乾燥中uired方位角を平均し、線形弾性収縮モデルに基づいてプロファイルが備わっています。乾燥ストレス及びSC弾性率の動的変化は、次に、当てはめモデルプロファイルから抽出することができます。

図1（a）は、蛍光ビーズ（セクション3）で被覆されたSC試料の代表的な蛍光画像を示します。サンプルの対応する透過光像（b）はによりサンプルの円対称に25％RHで16時間乾燥した後に形成空間分解乾燥変位の矢印プロットを重ね1図に示されている、これらの変位は、方位角することができます平均しました。 図1（c）は、...

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

この記事では、エラストマー基板に付着した円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位を測定することにより、動的な乾燥挙動と角質層の機械的特性を定量化する方法について説明します。この技術は、化学的処理、乾燥及び組織の機械的特性を変化させる方法の異なる測定するために使用することができます。

計測とモデリング収縮乾燥ヒト角質層で

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K ビュー.  Binghamton University. この記事では、エラストマー基板に付着した円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位を測定することにより、動的な乾燥挙動と角質層の機械的特性を定量化する方法について説明します。この技術は、化学的処理、乾燥及び組織の機械的特性を変化させる方法の異なる測定するために使用することができます。 

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Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in human subjects. This information is very important for skin-related diseases and characterizing skin care product performance. This protocol illustrates a method for confocal Raman spectra collection and the subsequent analysis of the spectral dataset leveraging chemometrics. The goal of this method is to establish a standard protocol for data collection and provide general guidance for data analysis. Preprocessing (e.g., removal of outlier spectra) is a critical step when processing large datasets from clinical studies. As an example, we provide guidance based on prior knowledge of a dataset to identify the types of outliers and develop specific strategies to remove them. A principal component analysis is performed, and the loading spectra are compared with spectra from reference materials to select the number of components used in the final multivariate curve resolution (MCR) analysis. This approach is successful for extracting meaningful information from a large spectral dataset.

Here, we present a protocol for collection of confocal Raman spectra from human subjects in clinical studies combined with chemometric approaches for spectral outlier removal and the subsequent extraction of key features.

化学的アプローチによるストラタム角質のインビボ共焦点ラマンスペクトルからの水、タンパク質、脂質の解明

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

化学

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

生物工学

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

<meta charset="utf8"></head><body>効率的な3Dスキンモデルによる柔軟な研究アプリケーション

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:費用対効果の高い3D細胞モデルによるスキンモデルの多様性の強化

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

医学

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

計測とモデリング収縮乾燥ヒト角質層で

要約

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化学的アプローチによるストラタム角質のインビボ共焦点ラマンスペクトルからの水、タンパク質、脂質の解明

2Dと3Dの肌の改善

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価