Name: measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum
Uploaded: 2017-03-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
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L&#39;approvazione esenti (3002-13) a fini di ricerca utilizzando campioni di tessuto de-identificato ai sensi del Dipartimento della Salute e dei regolamenti Servizi Umani, 45 CFR 46,101 (b) (4) è stato concesso. pelle tutto spessore viene ricevuto da un intervento chirurgico elettivo. In questo articolo, l&#39;origine del tessuto è 66-year-old seno femminile caucasica. 1. Preparazione di vetrini elastomero rivestite <ol><li> In un ml Fiala 20 di vetro, mescolare 0,107 g di Sylgard agente 184 indurimento con 5,893 g di base. La massa totale della miscela è di 6 g di una base per curare rapporto agente di 55: 1. </li><li> Dopo la miscelazione con una bacchetta di vetro per garantire omogeneità, posizionare la fiala di vetro in una camera a vuoto e degassamento per rimuovere tutte le bolle. </li><li> Posizionare un vetro di copertura antiscivolo (55 mm x 25 mm) al centro di un coater rotazione. Aggiungere ~ 1 ml della miscela sul centro del coperchio antiscivolo. Utilizzare una pipetta 5000 microlitri con l&#39;estremità tagliata con le forbici. cappotto Spin la copertura antiscivolo a 2.000 rpm per 60 s. <ol><li> Ripetere questo process per creare 5-6 substrati. </li></ol></li><li> Curare il cover-scivola in un forno per 12 ore a 60 ° C. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere parzialmente la pellicola di elastomero da un substrato sacrificale. Utilizzare un pennarello indelebile per segnare la parte superiore del film elastomero e il vetro esposto. </li><li> Montare il campione su un microscopio invertito e utilizzare un accessorio di messa a fuoco remota per registrare la differenza di z-altezza tra i piani focali dei due marchi. Ciò corrisponde allo spessore del substrato elastomero, h. </li></ol> 2. Preparazione del strato corneo <ol><li> Usare un bagno d&#39;acqua o piatto mescolare riscaldato per riscaldare un bicchiere di vetro mezzo riempito con acqua deionizzata (DW) a 60 ° C. All&#39;interno di una cappa di sicurezza biologica, immergere l&#39;intero spessore della pelle umana in acqua per 4 min. </li><li> Trasferire immediatamente il campione di pelle in un bicchiere contenente DW raffreddata a &lt;10 ° C per 4 min. Metà riempire il bicchiere riduce al minimo gli spruzzi di materiale a rischio biologico. </li><li> Togliere la pelle dal bicchiere, posto in una capsula di Petri, e delicatamente isolare l&#39;epidermide con un paio di pinzette tessuto naso piegate. </li><li> Posizionare l&#39;epidermide isolati lato basale verso il basso in una capsula di Petri rivestito con una garza. Assicurarsi che il livello basale è completamente a contatto con la garza. <ol><li> Immergere la garza in un 0,25% (peso / volume) di tipo IX-S pancreas suino soluzione tripsina disciolti in 0,1 M tampone fosfato per 6-8 ore a temperatura ambiente. Aggiungere solo abbastanza tripsina nel contenitore per bagnare la garza. </li></ol></li><li> Sollevare la garza con una pinzetta tessuti e galleggiare in un contenitore parzialmente riempito con DW. Tirare delicatamente la SC per separarlo dalla garza. </li><li> Lavare lo strato corneo 3-4 volte in DW per rimuovere il tessuto epidermico residuo che rimane attaccato alla SC. </li><li> Float la SC isolato in una soluzione di 0,4% glycine max (soia) inibitore della tripsina in DW. Utilizzare un agitatore per agitare il tessuto per 10 min. </li><li> Float SC in una capsula di Petri parzialmentepieno di DW. Utilizzare un agitatore per agitare il tessuto per 10 min. </li><li> Essiccare il foglio isolato SC in una rete di plastica ultra-fine per 48 ore a temperatura ambiente (25 ° C, 40% umidità relativa (RH)). </li><li> Separare il SC dalla rete e tagliare singoli campioni circolare R = 3 mm raggio utilizzando una foratura circolare. Segnare il centro del viso più esterno con un piccolo segno a spirale con un pennarello indelebile. Ciò fornisce un segnale visivo per riconoscere la parte superiore della SC. NOTA: Il segno indelebile dovrebbe essere applicata nel centro del campione, in cui le deformazioni essiccazione sarà più piccola. Questo ridurrà al minimo l&#39;impatto del marcatore su profili di spostamento di essiccazione registrati. </li></ol> 3. Il campione Trattamento e Deposizione <ol><li> Agitare campioni SC per 30 minuti in 15 ml DW contenente 90 microlitri perline marcatore fluorescente (505/515 nm, 1 micron di diametro, carbossilato-modificato). Questa depositi perline sulla superficie SC NOTA: Durante la deposizione di lNumeri arge di perline sul SC possono marginalmente asciugatura lenta rispetto a campioni senza perline presenti 12, sarà massimizzare la risoluzione spaziale dei campi di deformazione nel piano che può essere successivamente ottenuti. La scelta del volume di perline aggiunto deve pertanto essere fatta ad hoc. </li><li> Rimuovere campioni SC e metterli in una capsula di Petri parzialmente riempito con DW. </li><li> Parzialmente immergere un substrato nel DW con un angolo basso di 15-30 °. </li><li> Pin un bordo del campione SC galleggiante al linea di contatto tra il substrato e l&#39;interfaccia acqua. Verticalmente ritirare il substrato dall&#39;acqua sarà uniformemente laminare campione SC al substrato senza grinze o bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> Ripetere il punto 3.4 per inserire fino a 6 campioni SC su ogni substrato. Lasciare almeno una distanza di 2-3 mm tra i campioni ed evitare campione laminazione vicino al bordo del substrato. Questo impedisce l&#39;essiccazione di un campione che influenzano spostamenti di essiccazione in un altro. </li&gt; <li> Asciugare i campioni SC montati in condizioni di laboratorio per 60 min. Questo permette di acqua residua tra la SC e il substrato di evaporare e garantisce l&#39;adesione del tessuto completo. NOTA: A questo punto, i campioni SC può essere trattato con una sostanza chimica o formulazioni cosmetiche 7, 8 posizionando i substrati a testa in giù in una soluzione desiderata per un periodo di tempo necessario. Ripetere il punto 3.6 una volta che la fase di trattamento viene eseguito. Dopo l&#39;essiccazione, completa aderenza SC campioni al substrato può essere verificata mediante microscopia a luce trasmessa. la formazione di bolle sotto il campione SC o bordi delaminate formeranno variazioni di contrasto chiare nel campione con bordi ben definiti. </li><li> Creare una camera umida ponendo una piastra di Petri parzialmente riempito con acqua in un contenitore ermeticamente sigillato. </li><li> Inserire substrati nella camera per 24 h equilibrare a un&#39;umidità relativa del 99%. Non posizionare i substrati nel PetrI piatto. </li></ol> 4. Controllo Ambientale microscopio <ol><li> Ottenere controllo delle condizioni ambientali attraverso un sistema di controllo dell&#39;umidità collegato ad un microscopio camera di perfusione montabile. Dettagli del sistema di controllo dell&#39;umidità sono forniti in tedesco et al. (2013) 7 e Liu e tedesca (2015) 8. </li><li> Montare il substrato sul microscopio, posizionare la camera di perfusione di sopra del substrato e sigillare bordi della camera di perfusione all&#39;elastomero usando grasso per vuoto. </li><li> Una volta montato, equilibrare aria interna al 99% di umidità relativa prima sperimentazione. Questo impedisce l&#39;evaporazione di acqua prima sperimentazione. Una volta che l&#39;imaging nelle sezioni 5 o 7 ha iniziato, ridurre l&#39;umidità dell&#39;aria interna al valore desiderato. NOTA: In questo articolo, i campioni SC vengono essiccati al 25% di umidità relativa </li></ol> 5. Imaging in aereo essiccazione Spostamenti <ol><li> Acquisire le immagini dei campioni SC usando un microsco invertitaPE con lente obiettivo 1X. Excite perline fluorescenti che utilizzano un motore leggero con filtro FITC (503-530 nm banda passante di emissione). campioni multipli possono essere esposte in sequenza durante l&#39;asciugatura utilizzando una fase xy automatizzato. </li><li> Record fluorescenti e immagini luce trasmessa utilizzando una fotocamera digitale CCD con una risoluzione di 1.392 x 1.040 pixel. Il campo di vista di ogni immagine è 8,98 x 6,71 millimetri, permettendo una singola immagine per catturare un intero campione SC. Prendere immagini con una frequenza di 10 min per 16 h. </li></ol> 6. Preparazione del supporto per la misurazione spessore <ol><li> In una cappa, mettere 1 mL silano (3 amminopropiltrietossisilano; ≥98%) in qualche piccolo cappuccio di plastica. Posizionare substrati elastomerici dalla sezione 1 e il tappo in un contenitore sigillato per 5 h. Non permettere substrati vengono direttamente in contatto con il silano. </li><li> Aggiungere 5 mg di EDC (N - (3-dimetilamminopropil) - N cloridrato -ethylcarbodiimide; ≥99%) in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 500 ml di DW al EDC. Agitare la soluzione per 10 s con un vortex. </li><li> Aggiungere 0.076 g tetraborato di sodio e acido borico 0,1 g per 20 ml DW. Mescolare con un agitatore magnetico a 70 ° C (1 h). Aggiungere acido borico finché il pH è 7,4. </li><li> Aggiungere 20 ml di tampone borato a un tubo da 50 ml centrifuga. Aggiungere 60 ml di 1 micron perline (535/575 nm, carbossilato modificato) al tampone borato. Infine, aggiungere 200 ml di soluzione EDC alla bottiglia. Agitare la provetta per miscelare soluzione tallone e poi versare in un diametro di 10 cm Petri. </li><li> Rimuovere i substrati silanizzati dal contenitore e piazzale elastomero pellicola rivolto verso il basso nella soluzione tallone. Farlo lentamente per evitare le bolle di diventare intrappolati. Due substrati si inserisce in ogni piatto di Petri. </li><li> Lasciare substrati a galleggiare nella soluzione tallone per 45 min. </li><li> Utilizzare le pinzette per rimuovere i substrati dalla soluzione tallone, poi sciacquare in DW per rimuovere perline non legati. </li><li> Far asciugare i substrati. Soffiando aria compressa sula superficie della pellicola di elastomero riduce la formazione di macchie d&#39;acqua. </li><li> Sigillare i substrati in una scatola opaca per impedire fotometabolismo delle perline fino deposizione del campione SC. </li></ol> 7. Imaging Spessore del SC <ol><li> depositare campioni SC su di un substrato utilizzando la sezione 3. Tuttavia, eseguire il passaggio 3.1 senza l&#39;aggiunta di perline fluorescenti al DW. Inoltre, applicare una goccia 5 ml di soluzione non diluita fluorescente marcatore tallone (505/515 nm, 0,1 micron di diametro) alla superficie di ciascun campione SC depositato con una pipetta prima di completare passo 3.6. </li><li> Stabilire misurazioni dello spessore SC utilizzando il microscopio con lente obiettivo 40X. Misurare lo spessore dei campioni SC nel tempo utilizzando un accessorio fuoco a distanza per registrare la differenza di z-altezza tra i due strati piani focali branello situati all&#39;interfaccia SC-substrato e la parte superiore del SC. </li><li> Misurare lo spessore di 3 regioni di ciascun campione SC su un periodo di asciugatura 3 h. Lo spessoredei campioni SC raggiunge un valore di stato stazionario entro questo lasso di tempo 8. </li></ol> 8. Quantificare e modellazione del tessuto Deformazione <ol><li> Utilizzare Particle Image Velocimetry 13 per ottenere risolta spazialmente nel piano spostamenti asciugatura dalle immagini fluorescenti ad ogni passo tempo registrato. </li><li> Utilizzare MATLAB per ottenere profili radiali e spostamento azimutale azimutalmente mediati dal campo di spostamento di ciascun campione SC radialmente simmetrica. NOTA: Un esempio di dati (titolo &#39;d.mat&#39;) e il codice MATLAB (intitolato &#39;PIV-processing.m&#39;) che esegue sia questo passo e passo 8.3 è stata fornita nelle informazioni supplementari. </li><li> Montare profili spostamento radiale ad un modello 7, 8, 14, 15, 16 descrivendo essiccamento SC come restringimento circula elastico linearer disco di tempo vario spessore, h SC, raggio, R, e modulo elastico, E SC, aderito a un substrato elastico deformabile con modulo elastico, E. assumere SC ha un rapporto di Poisson ben definita e costante, ν SC = 0,4 7 , 8. Ottenere meglio si adatta con un minimo di almeno approccio quadrati. NOTA: Il modello utilizzato per il montaggio descrive spostamenti radiali in termini di funzioni di Bessel modificate sono: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" /> (1) con <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" /> , <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" /> e <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" /> Il termine <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" /> corrisponde a una profondità di penetrazione in, <img alt= &quot;Equazione&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55336 / 55336eq7.jpg&quot; /&gt;. <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" /> denota un parametro substrato rigidità; valido quando le dimensioni del campione sono molto maggiore dello spessore del substrato. Qui, i parametri, <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" /> e <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" /> rispettivamente indicare lo spessore del substrato rapporto di Poisson. Il rapporto di Poisson del silicone elastomero substrato 17 è ν = 0,5. </li><li> Ottenere parametri del modello alfa e β ad ogni passo volta dai minimi quadrati dell&#39;equazione (1) al profilo spostamento radiale. <ol><li> Impiegare il parametro β raccordo per ottenere SC modulo elastico, e SC, utilizzando l&#39;espressione, <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" /></li><li> Utilizzare montaggio α parametri per ottenere il tempo variabile contrattile asciugatura stress, PSC, utilizzando l&#39;espressione, <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" /></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In questo articolo, si descrive una tecnica che può essere usata per misurare il comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche del SC umana. Studi precedenti hanno dimostrato che questa tecnica può essere usata per quantificare gli effetti delle condizioni ambientali e prodotti chimici comunemente utilizzati in detergenti cosmetici e creme idratanti sul comportamento dinamico di essiccazione di SC 7, 8. Ci sono un certo numero di passaggi c...

Il strato più esterno dell&#39;epidermide o strato corneo (SC) comprende cellule corneociti coesive circondate da una ricca matrice lipidica 1, 2. L&#39;integrità strutturale composizione e di SC è essenziale per mantenere la funzionalità di barriera corretta 3, che impedisce l&#39;invasione da microrganismi e resiste sia le forze meccaniche e eccessiva perdita di acqua 4. La capacità dei prodotti di cura personale per mantenere o degradare la funzione di barriera della pelle è di grande interesse per l&#39;assistenza sanitaria della pelle e l&#39;industria cosmetica 5. L&#39;applicazione quotidiana di prodotti per la cura personale è noto per alterare le proprietà meccaniche del SC 6, 7, 8. Per esempio, tensioattivi contenuti nei detergenti cosmetici possono provocare aumenti significativi del modulo elastico e un accumulo disollecitazioni di essiccazione in SC, aumentando la propensione del tessuto per rompere 7, 9. Glicerolo contenuta in quasi tutti idratanti cosmetici può ammorbidire SC e diminuire l&#39;accumulo di sollecitazioni asciugatura 8, 10, 11, riducendo il rischio di rottura del tessuto. Il metodo descritto in questo articolo è in grado di quantificare il comportamento di essiccazione dinamica e le proprietà meccaniche di SC essiccazione in ambienti controllati 7, 8. In precedenza, questa tecnica è stata dimostrata per essere in grado di chiarire l&#39;effetto di diversi prodotti cosmetici sui cambiamenti nel comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche del tessuto SC. Ciò si ottiene quantificazione ritiro essiccamento indotta del tessuto SC umana aderito a un substrato elastomero morbido, sagomata spostamenti essiccazione con un semplicemodello di contrattilità, e poi estrarre il modulo elastico e l&#39;essiccazione lo stress dal profilo montato. Quando è richiesta la sperimentazione di campioni multipli SC, questo metodo offre una più rapida alternativa tensometry monoassiale, utilizza significativamente meno tessuto e fornisce più fisiologicamente rilevanti asciugatura impedendo l&#39;evaporazione dal lato inferiore del campione.

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer base</td><td>Dow-Corning</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer Curing Agent</td><td>Dow-Corning</td><td>1015311</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 0.1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8823</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m nile red fluorescent 535/575&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8819</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type II-s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0294</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-Dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer mixer</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>6 mm diameter hole punch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z708860</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 6-LCR-SB&amp;nbsp;</td><td>Lummencor light engine</td><td>No.3526</td><td></td></tr><tr><td>Cfi Plan Achro Uw 1X Objective</td><td>Nikon Plan UW</td><td>MRL00012</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20&amp;nbsp;mm wd</td><td>Nikon Plan Fluor</td><td>MRH01401</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53200</td><td></td></tr><tr><td>Clara-E Camera</td><td>Andor</td><td>DR-328G-C02-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design</td><td>Nikon</td><td>99888</td><td></td></tr><tr><td>Ti-S-E Motorized Stage</td><td>Nikon</td><td>MEC56110</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum

Strato corneo (SC) è lo strato più superficiale della pelle. Il suo contatto con l&#39;ambiente esterno significa che questo strato di tessuto è sottoposto ad entrambe detergenti e variazioni giornaliere umidità ambientale; entrambi i quali possono alterare il contenuto di acqua del tessuto. Riduzione del contenuto di acqua da una grave disfunzione barriera o ambienti di bassa umidità possono alterare SC rigidità e causare un accumulo di tensioni di essiccazione. In condizioni estreme, questi fattori possono causare la rottura meccanica del tessuto. Abbiamo stabilito un metodo ad alta produttività per quantificare cambiamenti dinamici delle proprietà meccaniche del SC su essiccamento. Questa tecnica può essere impiegata per quantificare i cambiamenti nel comportamento di asciugatura e le proprietà meccaniche di SC con trattamenti detergente e idratante cosmetici. Questo risultato è ottenuto misurando le variazioni dinamiche spazialmente risolte nel piano spostamenti di essiccazione dei campioni di tessuto circolari aderito ad un substrato elastomero. In-Plane spostamenti radiali ACQuired durante l&#39;essiccazione sono azimutalmente in media e dotati di un profilo basato su un modello contrattilità elastico lineare. cambiamenti dinamici nella sollecitazione di essiccazione e SC modulo elastico possono essere estratte dai profili modello adattato.

Figura 1 (a) mostra un&#39;immagine rappresentativa fluorescenza di un campione SC rivestito con perline fluorescenti (punto 3). La corrispondente luce trasmessa immagine del campione è mostrato nella Figura 1 (b) rivestito con una trama faretra di spostamenti essiccazione spazialmente risolti che formano dopo 16 h di essiccazione a 25% RH A causa della simmetria circolare dei campioni, tali spostamenti possono essere azimutalmente media. Figura...

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Questo articolo descrive un metodo per quantificare il comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche dello strato corneo misurando spazialmente risolta nel piano spostamenti di essiccazione dei campioni di tessuto circolari aderito ad un substrato elastomero. Questa tecnica può essere usata per misurare la diversa trattamenti chimici altera essiccazione e tissutali proprietà meccaniche.

Misurazione e modellazione contrattile asciugatura in Human strato corneo

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Views.  Binghamton University.  Questo articolo descrive un metodo per quantificare il comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche dello strato corneo misurando spazialmente risolta nel piano spostamenti di essiccazione dei campioni di tessuto circolari aderito ad un substrato elastomero. Questa tecnica può essere usata per misurare la diversa trattamenti chimici altera essiccazione e tissutali proprietà meccaniche. 

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Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in human subjects. This information is very important for skin-related diseases and characterizing skin care product performance. This protocol illustrates a method for confocal Raman spectra collection and the subsequent analysis of the spectral dataset leveraging chemometrics. The goal of this method is to establish a standard protocol for data collection and provide general guidance for data analysis. Preprocessing (e.g., removal of outlier spectra) is a critical step when processing large datasets from clinical studies. As an example, we provide guidance based on prior knowledge of a dataset to identify the types of outliers and develop specific strategies to remove them. A principal component analysis is performed, and the loading spectra are compared with spectra from reference materials to select the number of components used in the final multivariate curve resolution (MCR) analysis. This approach is successful for extracting meaningful information from a large spectral dataset.

Here, we present a protocol for collection of confocal Raman spectra from human subjects in clinical studies combined with chemometric approaches for spectral outlier removal and the subsequent extraction of key features.

Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

Ricerca

Chimica

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Bioingegneria

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelli 3D efficienti della pelle per applicazioni di ricerca flessibili

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Migliorare la diversità dei modelli di pelle con modelli cellulari 3D convenienti

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Medicina

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Misurazione e modellazione contrattile asciugatura in Human strato corneo

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Capitoli in questo video

Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico

Migliorare 2D e 3D della pelle

Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano