NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University T&#252;bingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).

グルコシノレートの抽出に必要なソリューションの調製<ol><li>ガラス瓶中の水に70％のメタノール（MeOH）での500ミリリットル（超高純度）を準備します。 100サンプルおよび5の規格については、70％のMeOH 420 mLを必要とされています。 </li><li> 20mM酢酸ナトリウム（のNaOAc）液（pH = 5.5）のNaOAc 0.82gのまたは水500mL中のNaOAc×3 H 2 O 1.36gのを添加することによって調製します。塩化水素（HCl）でpHを調整します。冷蔵庫でのNaOAcを保管してください。 100サンプルおよび5の規格については、水中の20mMのNaOAcの液（pH = 5.5）の370 mLを必要とされています。 </li><li>カラム材料を調製するために、超純水125 mLで架橋デキストランゲル（タイプG-25）10gを混合します。冷蔵庫（4℃）で得られた混合物を保管してください。 </li><li>スルファターゼ溶液の調製<ol><li>超純水30mLにアリールスルファタ（タイプH-1 のHelix pomatiaから）の1万台を溶解し、無水エタノール（エタノール）の30ミリリットルを追加します。よく溶液を混合し、1 250 mLのCENへの転送trifuge管や可用性に応じて、複数のより小さなチューブ、。 </li><li>室温（RT）で20分間2650×gで混合物を遠心分離します。ビーカーに、上清（S）を転送します。 EtOH 90 mLを加え、それを混ぜます。遠心分離を室温で15分間1,030×gで一つ以上の遠心分離管中の混合物。 </li><li>上清を捨てます。超純水25mLの合計でペレットを溶解し、組み合わせます。よくボルテックス、1-mLチューブに分注し、-20℃の冷凍庫に保管。彼らは、少なくとも1年間維持します。 </li></ol></li><li>シニグリン参照溶液の調製<ol><li> 1-μgの精度（ 例えば、8.769ミリグラム）でシニグリン一水和物9mgの周りで計量します。 10-mLのメスフラスコにそれを移し、超純水の10.0 mLのシニグリン一水和物を溶解します。 </li><li>ストック溶液のモル濃度を計算し、原液を希釈することによって50〜750μMの間の5シニグリン参照を準備します。詳細な例については、を参照してください。<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">補足ファイルS1</a> 。 </li><li> 1.5-mLの反応チューブ内の異なるシニグリン参照を分注し、20℃でそれらを凍結。各抽出バッチ中の5シニグリン参照のシリーズがあります。濃度を計算する際に現在使用されシニグリン参照の正しいモル濃度値を常に使用します。 </li></ol></li></ol>抽出セットアップの調製<ol><li>パスツールピペット列の列ラックを準備します（カラムの作製のために、ステップ3.1を参照してください）。サンプル数を追跡するために、ラックまたは列にラベルを付ける（ 図1参照 ）。 </li><li>ラベルされた2-mlのマイクロ遠心チューブの同じ番号を保持するブロックを準備する（ステップ3.3および図1を参照） </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：グルコシノレート抽出のためにラック。グルコシノレート抽出のための自作の列ラックとブロックの正面図（左）と上面図（右）。高さ100ミリメートル、シフト孔間の距離（パスツールピペットの列を保持する）30ミリ（x軸）を15ミリ（y軸）×。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 列およびマイクロ遠心チューブの調製<ol><li>サンプルあたり1列と5シニグリン基準サンプルのための5つの余分な列を準備します。 <ol><li>各ガラスピペットで、ガラスウール約1cm×1センチ個を配置します。ピペットが狭くポイントにグラスウールを押し下げるために木製やガラス棒を使用してください。グラスウールが不足してからカラム材料を防ぐ必要がありますが、それはカラムの溶出が遅くなりますよう、あまり使用しないでください。 WH手袋を着用してくださいグラスウールでの作業専用。 </li></ol></li><li>列のラックの列を配置します（ 図1を参照）。連続したカラムの洗浄​​に使用する溶離液をキャッチするためにラボトレイ（廃棄物・トレイ）の列ラックを配置します。 </li><li>プラスチック1 mLのピペットチップとピペット準備カラム材料の0.5ミリリットルの先端から最初の5ミリメートルカットし、各列に（水中G-25ゲルを、ステップ1.3を参照してください）。よくピペッティングの前にカラム材料を含むボトルを振ります。漏れたカラム（グラスウール層を介して実行されているG-25材料）を捨て、新しいものと交換してください。 <ol><li>列にカラム材料をピペットした後、材料を下にフラッシュするために超純水1mLを追加します。 </li></ol></li><li>サンプルあたり1つの2 mLの反応管と5シニグリン基準サンプルのための5つのチューブを準備します。それらにラベルを付けます。後に凍結乾燥のためのキャップに穴を作り、とまったく同じパターンでチューブブロックに準備された管を配置するために解剖針を使用しますカラム（ステップ2.2、 図1を参照）。 </li></ol>グルコシノレートの4抽出<ol><li>ラベルされた2-mLの中0.1mgの、に;（抽出物中の最終グルコシノレート濃度は、基準曲線の範囲内であるべきである乾燥重量の通常50.0から100.0 mg）を、ラウンド凍結乾燥し、微粉砕した植物材料を計量-bottom反応管。各チューブに燃剤を沸騰のように2つの小さな金属球（直径3mm）を追加します。 注：プロトコルは、液体窒素下で粉砕し、抽出するまで、凍結保存されている新鮮な、急速冷凍材料に適用することができます。材料19に水による希釈を補償するために、85％に抽出のために秤量した材料の量と抽出液中のメタノールの割合を増やします。 </li><li>簡単に各チューブとボルテックスに70％のMeOHピペットで1 mLです。チューブを閉じて、ホットワットに可能な限り迅速にそれらを配置する前に、安全キャップでそれらを封印MeOHをちょうど沸騰70％になるまで数分（約5分）のためのATER浴（90-92℃）で、。注意：このステップの間に安全ゴーグルを着用！ </li><li> 15分間超音波浴中でサンプルチューブを置きます。一方、スルファターゼを取り、冷凍庫のうち5シニグリン参照サンプルは、室温でそれらを解凍します。 </li><li>超音波処理した後、室温で10分間、卓上遠心機で2,700×gで試料チューブを遠心。ペレットは、各チューブに形成すべきです。ラベルされた列に上清を追加し、別々の列に5参照サンプルをピペット。 <ol><li>上清をピペットながら、ピペッティング植物材料を避けるためにも、ペレットの上にチップを保持します。乾燥した試料を使用した場合、上清量が1.0未満mLであることに注意してください。 </li></ol></li><li>試料管の残りのペレットに70％のMeOH 1 mLを加え、15分間超音波浴中に置く前に、管をボルテックス。ステップ4.4のように、再びチューブを遠心し、supernaを追加各列にtants。カラム材料の特性に起因して、グルコシノレートの負に帯電した硫酸基は、具体的にはカラムに保持されます。 </li><li> 3連続ステップで抽出物を用いてカラムを洗浄します。 <ol><li>各カラムに70％のMeOHピペット2×1 mLです。次の1ミリリットルを追加する前にドライ実行するには、列を待ちます。これは、抽出物（ 例えば、クロロフィル）からより多くの無極性化合物を除去します。 </li><li>各列に超純水1mLを添加することにより、メタノールを洗い流します。 </li><li>ピペットスルファターゼ反応のための最適な条件を作成するには、各列に20 mMののNaOAc緩衝液の2×1 mLです。 </li></ol></li><li>廃棄トレイの外に列を持つラックを取り、組織とラックの足を乾燥させます。バイアルおよび標識された管をブロックの上にラックを置きます。各カラムの先端が対応する、標識された、2 mLチューブであることを確認します（ 図1を参照）。 </li><li>スルファターゼsolutiの20μLを追加します。列に上。スルファターゼは、カラム材料の表面に到達していることを確認してください。 NaOAcのピペット50μLスルファターゼを下にフラッシュするために、各列の上にバッファ。アルミホイルで列をカバーし、一晩放置。 注：スルファターゼの活動のため、硫酸基は、それらが水で溶出することができるように列からdesulfoglucosinolatesを解放し、削除されます。詳細については、Crocoll らを参照してください。 19。 </li><li>翌日、各カラムに超純水の2×0.75ミリリットルをピペットでdesulfoglucosinolatesを溶出。すべての列が乾燥し実行した場合には、列のラックを持ち上げ、反応チューブから取り外します。 <ol><li>チューブ（キャップ​​の穴があることを確認してください）キャップと液体窒素中またはそれらを凍結-80℃のフリーザー30分間。凍結乾燥のすべての水を除去する（サンプル数や凍結乾燥機の容量に応じて）12〜24時間のためのサンプルを。 </li></ol></li> &lt;LI&gt;凍結乾燥した後に、超純水の正確な量（通常1.0 mL）中に残渣を再溶解します。ラベル付きHPLCバイアルにサンプルと5シニグリン参照を転送します。 2週間まで冷蔵庫（4℃）またはHPLCでそれらを分析する前に、冷凍庫（-20℃）のために1年まででサンプルを保管してください。 </li><li>ガラスカラムは一晩フードの下で乾燥させますと、乾燥時にそれらを配置。再利用のためのステップ4.5で使用されているサンプルチューブから金属球を回収し、廃棄物処理容器にチューブを入れます。 </li></ol>抽出サンプルの5 HPLC測定<ol><li>アセトニトリル-水勾配（ 表1参照）及び0.75 ml /分および40℃のカラム温度の流れと逆相C 18カラム（4.6×150ミリメートル、3ミクロン、300オングストローム）のグルコシノレートを区切ります。 229 nmで検出および定量化を行います。 </li><li>同じ列上のが、適応勾配でシニグリン参照を測定します溶剤の使用を低減する方法（ 表2参照）。最も低い濃度の参照で始まり、5シニグリン参照を注入することで起動します。次いで、カラムをきれいにし、ピークのキャリーオーバーを防止するために、10回に1回のサンプル後のメタノール注入（空白）を含む、サンプルを注入。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>時間[分] </td><td>流量[ml /分] </td><td> ％ 水</td><td> ％B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0.750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4">カラム温度40°C。 </td></tr></tbody></table> 表1：グルコシノレートの分離とanalysiためのアセトニトリル-水勾配逆相HPLCのS。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>時間[分] </td><td>流量[ml /分] </td><td> ％ 水</td><td> ％B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4">カラム温度40°C。 </td></tr></tbody></table> 表2：グルコシノレートの定量化のために使用される5シニグリン参照の定量化のための短縮アセトニトリル-水勾配。 6.グルコシノレートの同定と定量<ol><li>識別<ol><li>商業的に無駄でUVスペクトルと試料のピークの保持時間の比較ことができ、純粋なグルコシノレートの参照。様々なグルコシノレートのクラスからのUVスペクトルの例については、 図2を参照してください。 </li><li>可能な場合、参照標準またはLC-MS 18、19日に未知のグルコシノレートを識別します。 </li><li>可能な場合は、核磁気共鳴（NMR）を用いて、未知のグルコシノレートを識別します。 </li><li> 図2、 表3、データベース、または参考文献のものとピークのUVスペクトルおよび保持時間を比較。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> 最も一般的なグルコシノレートクラスの図2. UVスペクトル。最も一般的な構造クラスを表す、ここで説明したように抽出された市販の参照化合物で作られたソリューションに基づいて6 desulfoglucosinolates（GSL）のUV吸収スペクトル（200-350 nm）で、。一般名、Structural名（括弧の間）、および構造クラスが与えられています。 （A）シニグリン（2-プロペニルGSL）アルケニル; （B）glucoerucin（4-methylthiobutyl GSL）、チオアルケニル。 （C）グルコラファニン（4- methylsulfinlybutyl GSL）、スルフィニル。 （D）glucobrassicin（インドール-3-イルメチルGSL）、インドール。 （E）gluconasturtiin（2-フェニルエチルGSL）、芳香族。 （F）シナルビン（4-ヒドロキシGSL）、芳香族。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>定量化<ol><li> 5シニグリン参照およびサンプルのピーク下の面積を統合します。 </li><li>統合された面積に基づいて5測定シニグリン参照の検量線を計算します。回帰直線の方程式を使用グルコシノレート（式2を参照）の補間された量を算出する（式1参照）。</li><li>別のグルコシノレートの濃度を計算するために、EC（1990）16、ブフナー（1987）15、またはBrown らから229 nmでの検出に応答因子（M）で補間量（X）を乗算します。 （1993）17。最も一般的に検出さdesulphoglucosinolatesのコンセンサス応答因子は、 表3に示します。 注：応答因子は異なる符号を与えられた異なる値が（参考文献15-17を参照）があることを理由とすることができる。これはシステム間で異なる場合があります。それにもかかわらず、値はほとんどが非常に近く、構造クラスと同様の範囲内にあります。 glucobrassicinおよびその他のインドールグルコシノレート（ 図2）と同様のUVスペクトルを持つ未知のインドールグルコシノレートのために、取得する応答係数として0.25を使用することをお勧めだろうが、大会に続いて、1に正体不明のグルコシノレートの応答係数を設定濃度の現実的な推定値（ 表3）。 </li><li>試料中のグルコシノレートの最終的な量（のx t）を計算するために、希釈係数（D）とを考慮に入れ、分析に用いた試料の質量（W）を（式3参照）を取ります。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> （1） <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> （2） <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> （3） Y =ピーク面積 基準5点回帰曲線のメートル=傾き C = Y軸との回帰直線の切片 抽出物中のグルコシノレートのX =量 植物試料中のグルコシノレートのX トン =濃度 D =希釈係数 らブフナー（1987）またはブラウンから229 nmでの検出のためのMは=応答係数。 （1993） W =試料の質量を抽出するために使用</li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

この確立され、広く使用されている方法の最大の利点は、それが堅牢であることかなり単純であり、サンプルあたりの比較的低コスト。抽出および分析のために必要な機器の大半は、標準的な実験室で利用可能であるべきか、HPLC-PDAを除いて、自己構築することができます。もう一つの利点は、抽出物は、容易に他の場所でHPLC分析のために出荷することができたので、涼しく、気密（HPLC）バイアルに保管時に水に溶解しdesulfoglucosinolatesは、化学的に非常に安定していることです。ソフトウェアを管理し、データを分析するための専門的なトレーニングと豊富な実務経験を必要とし、LC-MSプラットフォームとは対照的に、HPLC-UV / PDAが簡単に、短いトレーニング期間後に実行することができます。これは、手順のコストを削減するだけでなく、学生を含む科学者の幅広い、この方法よりアクセスできるようになりませんのみ。 一般的に、上記の手順はcarefuを追っているときLLY、いくつかの問題が発生する必要があります。一般的には、グルコシノレートのピークが非常によくクロマトグラムで分離されます。そうでない場合、勾配プログラムは、溶出液中のアセトニトリルの増加率を減少させることによって適合させることができます。代わりに、新しいプレカラム（200-500注射）または列（1500 -2000注射）で構築することは、問題を解決することがあります。時折、バッチ内の単一のサンプルのクロマトグラムは、非常に小さい、または全くピークを示してもよいです。これは、スルファターゼを追加するときに起因するピペッティングエラーのために通常である（ 例えば、列がスキップされたか、スルファターゼが正しく列にダウンして洗浄しませんでした）。また、実験材料中のグルコシノレート濃度が予想よりも低くされている可能性があり、あまりにも少しの材料を抽出するために使用しました。後者の場合は、注入容量は100μLまで増加させることができる、または抽出物の正確なアリコート（ 例えば、800μL）を濃縮することができます。後者は、凍結乾燥することによって達成することができます水の少量（ 例えば、100μL）で残留物を溶解し、抽出液をる、と同じ基準曲線を使用して再注入。抽出物の元の濃度の計算では、数字は、希釈率を掛けなければなりません。これで問題が解決しない場合、材料は、出発物質を使用して再度抽出する必要があります。これ以上の100mgの場合には、抽出溶媒の容積、チューブのサイズは、抽出効率を維持するために比例的に調整されるべきです。 さらなる利点は、この方法は、十分に検証されたことです。それは、手順および精度は、いくつかの研究室16で確認されたため菜種におけるグルコシノレートの定量のための標準的な方法として記載されているからです。また、遺伝的背景、生合成、及びグルコシノレートの生物学的機能はモッズに、熱心な研究努力の対象となっています他の4、6、12のうち、エル植物種のシロイヌナズナ 。したがって、シニグリンとの関係でdesulfoglucosinolatesの正確な定量化のための多くの応答因子は十分に定義されており、15,17公的に利用可能。 LS-MSベースのプロトコルは、より感度の高い、より高スループットであり、LC-MSは、制限のために（仮に）、ユニバーサル応答因子の欠如を全く基準が18、19、20用意されていないいるグルコシノレートを識別することができるにもかかわらずグルコシノレート濃度18の正確な定量化。また、これらの方法は、通常、凍結乾燥工程を含まない、新鮮な植物材料中の水の量は、正確な定量化が困難、計算で行方不明です。我々の抽出方法が含まれるため最後に、列ベース精製および濃縮工程、それはまた、土壌21等のグルコシノレートの低い濃度で「汚れた」サンプルに適用することができます。 通常、新鮮に凍結された物質を抽出する抽出のために96ウェルプレートを使用し、スルファターゼステップ18、19を含まないLC-MSベースの方法に比べて、私たちの方法は、比較的時間がかかり、労働激しいです。このホワイトペーパーで説明する列ラックを使用すると、単一の人は1日に約100から150サンプルを抽出することができます。溶出（翌日）、（一晩）凍結乾燥し、再溶解は、次の2日以内に行うことができます。自動化されたHPLCインジェクター、注射当たり40〜45分のランと平衡時、ノー不測の事態で、それはこのサンプルセットのデータを取得するために3-4日かかるだろう。 HPLCソフトウェアはシニグリン曲線、クロマトグラムの手動チェックとPEに基づく自動定量化を可能にする場合データは、統計分析のために使用することができる前に、100サンプルについてのkの割り当ては、他の1または2時間を取ることができます。 グルコシノレートの基準の増加が利用可能であるにもかかわらず、130以上の候補者のわずかな部分だけは、現在、商業的に購入することができます。しかし、生合成の各クラスのためのいくつかの参照を持ちます。化合物を指定する文献データベースへのアクセスは、以前に植物種に見られる（ 例えば、フェイヒーら22）;このようなeluotropicシリーズのロジックのようなクロマトグラフィーの原則の基本的な知識（ 例えば、脂肪族化合物中の側鎖にCsの数を増加させるため、3及び図 4）。およびNMR 23、1のLC-MS 19または単離されたグルコシノレート上の単一のサンプルの検証は簡単にこの制限を克服することができます。グルコシノレートのためのほとんどのプロトコルは内部基準曲線を使用して分析します（ すなわち、溶媒抽出16、17、19シニグリンの抽出またはシナルビンある濃度）。主に、内部基準曲線は、個々のサンプルの処理エラーを補正することがより適切であり、従って、理論的に、より高い精度をもたらします。この利点にもかかわらず、我々は、多くの場合（ 例えば、クロガラシ 24）またはシナルビン（ 例えば、ホワイトマスタード 25）、シニグリンの高レベルが含まれているそのうちのいくつかの異なる野生種を、分析するように、5点外部参照曲線を使用することを好みます2グルコシノレートの参照が対象の応答因子が用意されています。ハイグレードグルコシノレートの参照標準は、通常、非常に高価であるためまた、各サンプルに内部標準を添加して、分析のコストを増大させます。 結論として、時間のかかる手順にも関わらず、このプロトコル植物試料にグルコシノレートを抽出し、定量化するための簡単でアクセス可能な方法を提供します。しかし、グルコシノレートレベル自体がミロシナーゼと反応する必要性と見電位の生物学的活性の唯一の指標である、との反応生成物の変化は、単一のグルコシノレート11から生じ得ることを考慮することが重要です。検証アッセイは、生物学的関連性を確認するために実行する必要があります。

植物は、化学化合物1の20万人を超える異なる種類を生成することが推定されています。これらの化合物の唯一の少数派は、植物の一次代謝、燃料の成長と再生に役割を果たしているようです。大半は、いわゆる二次代謝産物です。彼らは花粉媒介者を引き付けるために、または病原体や草食動物1に対する植物を守るために役立つように、その名前にもかかわらず、二次代謝産物は、多くの場合、植物の生存と再生のために重要です。 グルコシノレートは、150年以上の2のために研究されてきた二次代謝産物の非常に多様なクラスです。現在までに、130以上の構造的に異なるグルコシノレートは、3同定されています。概して、グルコシノレートは、それらが合成されるアミノ酸に基づいて異なるクラスに分けることができます。インドールグルコシノレートは、例えば、アミノ酸から合成されますトリプトファン、フェニルアラニンは芳香族グルコシノレート4の合成のための基本骨格を提供する一方。クラスの中に、高い脂肪族グルコシノレート類のような生合成経路において、または側鎖修飾（ 例えば、ヒドロキシル）により逐次鎖伸長工程によってもたらされる構造的多様性のレベル、4、5があります。一つのグルコシノレートの植物種が異なる構造クラス6に属する最大37の異なるグルコシノレートを含有することができます。植物種は、典型的なグルコシノレートのプロファイルを持っているにもかかわらず、グルコシノレートの種類のための種内変異は頻繁に個人や集団6、7の間で発見されました。無傷のグルコシノレートは、植物細胞の液胞に保存され、任意の地上または地下部器官7に記載されています&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 8、9。細胞破壊（ 例えば、草食性によって）されると、グルコシノレートが解放され、マスタードオイル爆弾10をオフに設定し、酵素ミロシナーゼと混合されます。ミロシナーゼの活性、およびグルコシノレートの構造、反応条件、および修飾酵素、異なる刺激、毒性、又は有害な化合物の存在に依存してこのようなニトリル及び（イソ）として、形成された11のチオシアネート。反応生成物は、高い生物学的活性を有します。例えば、彼らはゼネラリスト昆虫草食動物12の忌避剤としての役割を果たす。グルコシノレートの遺伝と生合成経路がよく、主に草食動物と病原体抵抗性、マスタードとキャベツで香味成分としての価値、およびそれらの負（progoitrin）と人間の健康5にプラス（グルコラファニン）効果のためにそれらの重要性、研究されています</suP&gt; 13、14。 なぜなら、紫外線（UV）またはフォトダイオードアレイを備えた逆相高圧液体クロマトグラフィーに基づいて、生物学的に活性な化合物、抽出及び検出方法としてグルコシノレートに大きな関心（HPLC）の（PDA）検出器は、一般的に1980 15が使用されています。この方法に基づき、欧州共同体は、油糧種子中のグルコシノレートの分析（ セイヨウアブラナ 、セイヨウアブラナ、キャノーラ16）のために、いくつかのラボでテストおよび検証された標準プロトコルを発行しました。その他は17（ナタネには存在しないグルコシノレートのための追加の応答係数を決定することにより、例えば ）このメソッドに追加しました。グルコシノレートの分析18のための液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）プラットフォーム及びハイスループットプロトコルの増加にもかかわらず、利用可能<suP&gt; 19は 、元のHPLC-UV / PDA方法は、まだ広く科学者によって使用されています。主な理由は、この方法が簡単で、費用対効果、および広範な化学分析の知識インフラのないラボに比較的アクセス可能であることです。この地域社会に奉仕するためには、植物材料からグルコシノレートの抽出とHPLC-PDAとのdesulfo-フォームの分析のために、私たちここでは詳細プロトコル。

<table><tbody><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM&amp;reg; gradient grade for HPLC grade</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&amp;minus;)-Sinigrin hydrate&lt;br/&gt; from horseradish&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Aryl Sulfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Glass Wool</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Glass/wooden stick</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 mL reaction tubes</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo-lab dishes</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Waste tray</td></tr><tr><td>Rotilabo-sealing clips</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Dryer Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril super gradient grade</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Electrode</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column (4.6 x 10 mm, 5 &amp;micro;m, 300 &amp;Aring;)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Column Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column (4.6 x 150 mm, 3 &amp;micro;m, 300 &amp;Aring;)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>with column oven and UV or PDA detector</td></tr><tr><td>Flask 1,000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Glucosinolate reference compounds</td><td>Phytoplan</td><td>various</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

a straightforward method for glucosinolate extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography (hplc)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

このメソッドは、すべての構造クラス（ 図3）で一般的に見desulfoglucosinolatesの検出および分離を可能にします。有害な2-hydroxyglucosinolate progoitrinは比較的早いクロマトグラムで来て、明らかに有益なグルコシノレートグルコラファニン、このサンプルで唯一methylsulfinylglucosinolateから分離されています。シニグリン、gluconapin、及びglucobrassicanapinが増加側鎖長（C3、C4、およびC5のそれぞれ）のアルケニルグルコシノレートのeluotropic系列を形成します。同様の論理シリーズは2 methylthioalkenylのグルコシノレート、glucoiberverin（C3）とglucoerucin（C4）用に可視です。 3インドールのグルコシノレート、glucobrassicinおよびその誘導体、4-ヒドロキシおよび1-methoxyglucobrassicin（neoglucobrassicin）のピークは、また明確に分離されています。なお、neoglucobrassicinとglucoerucinのピーク、ならびにgluconasturtiin、唯一の芳香族グルコこのサンプルのsinolateは、原因ミックス9に根抽出物のほかに、このアブラナ属抽出物中の特に高いです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> 図3：グルコシノレート抽出物のクロマトグラム。 アブラナ属黒質、B.ラパと B.オレラセアからの合成ルートと撮影サンプルの分析から得られたHPLCクロマトグラムの詳細（1-32分）。ピークラベルは、保持時間と識別さdesulfoglucosinolates（GSL）の省略形を示しています。 PRO = progoitrin（2-OH-3-ブテニルGSL）。 RAPH =グルコラファニン（4-methylsulfinlybutyl GSL）。 SIN =シニグリン（2-プロペニルGSL）、GNA = gluconapin（3-ブテニルGSL）。 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin。 IBV = glucoiberverin（3-メチルチオプロピルGSL）。 GBN = glucobrassicanapin（4-ペンテニルGSL）。 ERU = glucoerucin（4-methylthiobutyl GSL）。 GBC = glucobrassicin（インドール-3-イルメチルGSL）; NAS = gluconasturtiin（2-フェニルエチルGSL）。 NEO = neoglucobrassicin（1-のMeOH-glucobrassicin）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> Rorippaのaustriacaの根抽出物に見られるように、一般的にモデル植物シロイヌナズナで発見された長鎖メチルスルフィニルグルコシノレートは、また、eluotropicシリーズを示しています。 Glucohesperalin（C6）、glucosiberin（C7）、glucohirsutin（C8）、およびglucoarabin（C9）は、クロマトグラム（ 図4）上に一定の間隔で表示されます。一緒にピークのUVスペクトルと、そのようなeluotropic論理シリーズは、未知のグルコシノレートを分類し、仮識別するために使用することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> 図4：クロマトグラム（フレーム9月30日分）Rorippa austriaca根エキスでdesulfoglucosinolatesの。ピークラベルは、保持時間と識別さdesulfoglucosinolates（GSL）の省略形を示しています。 HES = glucohesperin（6-methylsulfinylhexyl GSL）。 SBE = glucosiberin（7-methylsulfinylheptyl GSL）。 GBC = glucobrassicin（インドール-3-イルメチルGSL）。 HIR = glucohirsutin（8-methylsulfinlyoctyl GSL）。 ARA = glucoarabin（9-methylsulfinylnonylglucosinolate）; NEO = neoglucobrassicin（1-のMeOH-glucobrassicin）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 一般名 </td><td> 側鎖構造 </td><td> RT（分）* </td><td> 229 nmの </td><td> 参照＃ </td></tr><tr><td> aliphatiCグルコシノレート</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td>メチル</td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td>褐色</td></tr><tr><td>シニグリン</td><td> 2-プロペニル</td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td>ブラウン、EC </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-ブテニル</td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-ペンテニル</td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3 - メチルチオプロピル</td><td> 10.9 </td><td> 0.8 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0.9 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td>褐色</td></tr><tr><td>グルコラファニン</td><td> 4 - メチルスルフィニルブチル</td><td> 4.9 </td><td> 0.9 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0.9 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0.9 </td><td>褐色</td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2（R）-OH -3-ブテニル</td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5ペンテニル</td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> EC </tD&gt; </tr><tr><td> インドールグルコシノレート </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hydroxyindol -3-イルメチル</td><td> 11.2 </td><td> 0.28 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicin </td><td>インドール-3-イルメチル</td><td> 15.3 </td><td> 0.29 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-methoxyindol -3-イルメチル</td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-methoxyindol -3-イルメチル</td><td> 22.5 </td><td> 0.2 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> 芳香族グルコシノレート </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シナルビン</td><td> 4-ヒドロキシベンジル</td><td> 8.1 </td><td> 0.5 </td><td>ブフナー</td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2（R）-OH -2-フェニルエチル</td><td> 12.1 </td><tD&gt; 0.95 </td><td>次を見ます</td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2（S）-OH -2-フェニルエチル</td><td> 12.7 </td><td> 0.95 </td><td>ブフナー</td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td>ベンジル</td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2-フェニルエチル</td><td> 18.0 </td><td> 0.95 </td><td>ブフナー、EC </td></tr><tr><td> 不明- UVスペクトルのような芳香族/脂肪族 </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> EC </td></tr><tr><td> 不明-スペクトルのようなインドール </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> EC </td></tr><tr><td colspan="5"> *おおよその保持時間（RT）は（カラム、溶離液の品質に応じて0.3分±）最寄りの0.1分に丸め。保持時間は、C 18カラム（150×4.6ミリメートル、3マイクロメートルの粒子サイズ）を加えたC 18を搭載したThermoFisher /ダイオネックス究極のHPLCプラットフォーム上で決定されています</s表1のように、勾配プログラムUB&gt;プレカラム（10×4.6 mmの5マイクロメートルの粒子サイズ）。 </td></tr><tr><td colspan="5">応答因子について＃参照：菜種におけるグルコシノレートでブフナー、R.（エドJP Wathelet）50-58（マルチネスネイホフ出版、1987）。ブラウン、PD、徳久、JG、ライヒェルト、M.＆Gershenzon、異なる器官およびシロイヌナズナの発達段階のうち、グルコシノレート蓄積のJ.バリエーション。植物化学。 62（3）、471-481、DOI：10.1016 / S0031-9422（02）00549から6、（2003）。 EC。油糧種子 - グルコシノレート高速液体クロマトグラフィーの決意。欧州共同体官報。 Lの28分の170。附属書VIII 03.07.27-34（1990）。 </td></tr></tbody></table> 表3：最も一般的にC 18カラム上の植物抽出物及びそれらのおおよその保持時間にdesulfo-グルコシノレート発見の応答要因。溶離液、gradien表1のようなT、カラム温度、及び流量。

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A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

25.1K ビュー.  German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig. Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography. 

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Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

環境学

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

化学

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

生物学

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

加圧熱水抽出天然物化学学部の研究室を探検する (PHWE) を採用

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant physiology. Due to their negative charge, low abundance and susceptibility to hydrolytic activities, the detection and quantification of these molecules is challenging. This is particularly the case for highly phosphorylated forms containing &#8216;high-energy&#8217; diphospho bonds, also termed inositol pyrophosphates (PP-InsPs). Due to its high sensitivity, strong anion exchange high-performance liquid chromatography (SAX-HPLC) of plants labeled with [3H]-myo-inositol is currently the method of choice to analyze these molecules. By using [3H]-myo-inositol to radiolabel plant seedlings, various InsP species including several non-enantiomeric isomers can be detected and discriminated with high sensitivity. Here, the setup of a suitable SAX-HPLC system is described, as well as the complete workflow from plant cultivation, radiolabeling and InsP extraction to the SAX-HPLC run and subsequent data analysis. The protocol presented here allows the discrimination and quantification of various InsP species, including several non-enantiomeric isomers and of the PP-InsPs, InsP7 and InsP8, and can be easily adapted to other plant species. As examples, SAX-HPLC analyses of Arabidopsis thaliana and Lotus japonicus seedlings are performed and complete InsP profiles are presented and discussed. The method described here represents a promising tool to better understand the biological roles of InsPs in plants.

Here we describe strong anion exchange high-performance liquid chromatography of [3H]-myo-inositol-labeled seedlings which is a highly sensitive method to detect and quantify inositol polyphosphates in plants.

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

生化学

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars with enhanced organoleptic characteristics and thus, to increase consumer acceptance. High-throughput metabolomic platforms have been recently developed to quantify a wide range of metabolites in different plant tissues, including key compounds responsible for fruit taste and aroma quality (volatilomics). A method using headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) is described here for the identification and quantification of VOCs emitted by ripe blackcurrant fruits, a berry highly appreciated for its flavor and health benefits.
Ripe fruits of blackcurrant plants (Ribes nigrum) were harvested and directly frozen in liquid nitrogen. After tissue homogenization to produce a fine powder, samples were thawed and immediately mixed with sodium chloride solution. Following centrifugation, the supernatant was transferred into a headspace glass vial containing sodium chloride. VOCs were then extracted using a solid-phase microextraction (SPME) fiber and a gas chromatograph coupled to an ion trap mass spectrometer. Volatile quantification was performed on the resulting ion chromatograms by integrating peak area, using a specific m/z ion for each VOC. Correct VOC annotation was confirmed by comparing retention times and mass spectra of pure commercial standards run under the same conditions as the samples. More than 60 VOCs were identified in ripe blackcurrant fruits grown in contrasting European locations. Among the identified VOCs, key aroma compounds, such as terpenoids and C6 volatiles, can be used as biomarkers for blackcurrant fruit quality. In addition, advantages and disadvantages of the method are discussed, including prospective improvements. Furthermore, the use of controls for batch correction and minimization of drift intensity have been emphasized.

A headspace solid-phase microextraction-gas-chromatography platform is described here for fast, reliable, and semi-automated volatile identification and quantification in ripe blackcurrant fruits. This technique can be used to increase knowledge about fruit aroma and to select cultivars with enhanced flavor for the purpose of breeding.

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

13C6-グルコース標識を用いた薬用植物における一次臓器の同定

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary metabolite in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities and PPY is in increasing demand. This study established leaf, rhizome, and stem-vascular-bundle 13C6-Glucose feeding and non-feeding four treatments to precisely certify the primary organs involved in Paris saponins VII (PS VII) synthesis. By combining liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the 13C/12C ratios of leaf, rhizome, stem, and root in different treatments were quickly and accurately calculated, and four types of PS isotopic ion peak(M&#8722;) ratios were found: (M+1) &#8722;/M&#8722;, (M+2) &#8722;/M&#8722;, (M+3) &#8722;/M&#8722; and (M+4) &#8722;/M&#8722;. The results showed that the ratio of 13C/12C in the rhizomes of the stem-vascular-bundle and rhizome feeding treatments was significantly higher than that in the non-feeding treatment. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves increased significantly under leaf and stem-vascular-bundle feeding treatments. Simultaneously, compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves under rhizome treatment showed no significant difference. Furthermore, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the stem, root, and rhizome showed no differences among the four treatments. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of the Paris saponin II (PS II) molecule (M+2) &#8722;/M&#8722; in leaves under leaf feeding treatment showed no significant difference, and the (M+3) &#8722;/M&#8722; ratio of PS II molecules in leaves under leaf feeding treatment were lower. The data confirmed that the primary organ for the synthesizing of PS VII is the leaves. It lays the foundation for future identification of the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants.

著者スポットライト: 13C6-グルコース標識と LC-MS を使用した植物一次臓器プロファイリング(英語)

The developed method of 13C6-Glucose labeling combined with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry is versatile and lays the foundation for future studies on the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, as well as the comprehensive utilization of these secondary metabolites.

13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法

要約

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シングルスループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

加圧熱水抽出天然物化学学部の研究室を探検する (PHWE) を採用

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法

要約

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シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

加圧熱水抽出天然物化学学部の研究室を探検する (PHWE) を採用

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

13名LC-MSに関連するC6-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

シングルスループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定

¹³名LC-MSに関連するC₆-グルコース標識:二次代謝物合成における植物一次器官の同定