ここで示したプロトコルは、植物のイノシトールポリリン酸の生合成を解明し、植物代謝と開発の特定の側面におけるその役割に関する質問に答える助けになります。この方法は、イノシトールリン酸塩の放射性標識前駆体の使用が植物のすべてのイノシトールリン酸塩種の信頼性の高い検出を可能にするので、非常に敏感です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ほとんどの植物生物学者がHPLC分析と必要なセットアップに精通していないため、重要です。
さらに、このプロトコルの重要なステップは、イノシトールリン酸塩の抽出と同様に、適切なデモンストレーションなしに従うのは困難である。まず、バッファA用とバッファB用の2つの独立したHPLCポンプで構成されるシステムを設定します。両方のポンプに対して、重力を介して、または第3の低圧ポンプを介して、ピストンシール洗浄を実施します。
両方のポンプをダイナミックミキサーに接続し、少なくとも1ミリリットルの容量を持つサンプルループを備えた注入バルブにミキサーを接続します。毛細血管を使用して、射出バルブを柱に接続し、列を分数コレクターに接続します。純正水に0.8%の細菌学的寒天からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ料理に蓮の種を一列にまきます。
種子が暗闇の中で摂氏4度で少なくとも3日間層化することを許可します。成長インキュベーターに種子を入れます。1%スクロースを補充し、pH 5.7に調整された2ミリリットルの半強度MS塩溶液で満たされた12ウェルクリアフラットボトムセル培養プレートの1つの井戸に10〜20の苗を移します。
プレートに3Hミオイノシトールの45マイクロキュリーを加え、穏やかに渦巻きます。蓋でプレートを覆い、マイクロポーラス手術テープで密封します。その後、成長インキュベーターに戻します。
5日間のラベリングの後、媒体から苗を取り除き、脱イオン水で短時間洗います。ペーパータオルで乾燥させ、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、チューブを過剰に充填しないようにします。液体窒素でチューブを凍結スナップし、抽出するまでマイナス80°Cで保存します。
冷凍庫からサンプルを取り出し、使用する準備ができるまで液体窒素に保管してください。解凍を開始するまでマイクロ遠心分離チューブ害虫でそれらを粉砕し、氷冷抽出バッファーの500マイクロリットルを追加します。サンプルが均質化され、溶液が着色されるまで粉砕を続けます。
サンプルを18,000倍Gと摂氏4度で10分間遠心分離します。その後、上清を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。抽出に使用されるチューブは、固体放射性廃棄物とみなされ、それに応じて処分する必要があります。
300マイクロリットルの中和バッファーを抽出物に慎重に加え、タンパク質の沈殿やバブリングをすぐに引き起こします。1分後、サンプルをピペットチップとピペット5マイクロリットルをpH紙に混ぜて、pHが7〜8の間であることを確認します。必要に応じて、目的のpHに達するまで少量の中和バッファーまたは抽出バッファーを追加し、サンプルを開いた蓋で少なくとも1時間氷の上に置きます。
その後、10分間遠心分離し、上清を新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。96の小さなシンチレーションバイアルを分数コレクターに装備し、低pHバッファーと高リン酸アンモニウム濃度と互換性のある適切なシンチレーションカクテルの2ミリリットルで各バイアルを充填します。HPLCシステムを起動し、ピストンシール洗浄を有効にし、全体の実行中にアクティブに保ちます。
サンプルに適した注射器を手動で注入します。ポンプと勾配を開始します。HPLCの実行が進行中である間、圧力を定期的に確認してください。
開始圧力は約18〜24バーであり、100%バッファBに達するとゆっくりと50〜60バールに上昇する必要があります。実行後、バイアルをしっかりと閉じ、シンチレーションカクテルで分数を激しく振って混ぜます。測定を直接進まない場合は、バイアルを暗闇の中で直立した位置に保ちます。
分数を測定するには、小さなバイアルに収まるラックを使用してシンチレーションカウンターラックにバイアルを挿入し、液体シンチレーションカウンターで各バイアルを5分間測定します。2D 折れ線グラフを用意し、1 分あたりの計測数または CPM が保持時間に対してプロットされます。サンプルを互いに比較するには、個々のサンプルごとに分 25 から 96 までの各溶出分数から CPM を合計し、そのサンプルの合計 CPM を他のサンプルの合計 CPM で除算して、データを正規化します。
特定のイノシトールポリリン酸ピークの相対的な定量を実行し、その後、統計分析のための複製のデータを含む棒グラフを作成するには、クロマトグラムのピーク領域を計算できる特殊なソフトウェアで分析を継続します。シンチレーションカウント後のA.thaliana抽出物から得られた完全なイノシトールポリリン酸スペクトルをここに示す。ピークはうまく分離されており、異性体に割り当てることができます。
老朽化したカラムを使用すると、イノシトール六月リン酸の明確な還元とイノシトールピロリン酸の欠如が見られます。SAX-HPLC分析は、シロイヌナズナの苗と同じ条件で成長し、標識されたL.japonica苗にも対して行われました。おそらくすべてのイノシトールポリリン酸種およびシロイヌナズナシスから知られているピークが見られるが、2つの種間の特定イノシトールポリリン酸異性体の相対的な量に違いがある。
抽出直後にサンプルを分析する必要がないことを実証するために、1つのサンプルを2回と半分に分割し、次の日にマイナス80°Cで保存した後に分析した。新鮮なサンプルと凍結したサンプルのSAX-HPLCプロファイルの違いは有意ではなく、1つの凍結融解サイクルがサンプルに害を与えるものではなく、方法自体が再現可能な結果を生成することを実証しました。このプロトコルを試みるとき、常にサンプルを十分に、凍結し、抽出バッファーと粉砕し、SAX-HPLC分析のための放射標識イノシトールリン酸の最大の回復を確実にするために中和後の中性pHに近い目的を目指して下さる。
SAX-HPLCランから後で使用するために、例えばシンチレーションカクテルなしで分数を収集し、小さなアリコートのみを測定することによって、相互反応で、無線標識を精製することが可能です。
