NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University T&#252;bingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).

글루코 추출에 필요한 솔루션 1. 준비 <ol><li> 유리 병에 물을 70 % 메탄올 (MeOH 중) 500 ㎖ (초순수)를 준비한다. 100 샘플 5 기준 70 %의 420 mL의 메탄올의 경우에는 필요하다. </li><li> 의 NaOAc 0.82 g의 NaOAc 또는 X 3 H 1.36 g을 첨가하여 20 MM의 아세트산 나트륨 (NaOAc) (의 pH = 5.5)을 제조 2 O 물 500ml에; 염화수소로 pH를 조정한다. 냉장고에의 NaOAc를 저장합니다. 100 샘플 5 표준 물에 20 mM의 아세트산 나트륨 (NaOAc) (PH = 5.5) 370 mL를가 필요하다. </li><li> 열 물질을 제조 초순수 125 mL를 가교 덱스 트란 겔 (타입 G-25) 10g을 혼합한다. 냉장고 (4 ℃로)에서 생성 된 혼합물을 저장합니다. </li><li> sulfatase 용액의 조제 <ol><li> 초순수의 30 mL에 아릴 sulfatase의 10,000 단위 (유형 H-1 헬릭스 pomatia에서)를 용해시키고, 무수 에탄올 30 ㎖ (의 EtOH)를 추가합니다. 잘 솔루션을 혼합 한 250 ML의 CEN로 전송trifuge 관이나 가용성에 따라 여러 개의 작은 튜브,. </li><li> 실온에서 20 분 (RT)에 대해 2,650 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 비커에 뜨는 (들)을 전송; 의 EtOH 90 mL를 넣고 그것을 섞는다. RT에서 15 분 동안 1030 × g으로 하나 이상의 원심 분리기 튜브에서 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 용해 초순수 25 ㎖의 총 펠렛을 결합한다. 소용돌이는 물론, -20 ° C에서 냉동실에 1 mL의 튜브에 분배, 저장; 그들은 1 년 이상 유지합니다. </li></ol></li><li> sinigrin 기준 용액의 제조 <ol><li> 1 μg의 정확도 (예를 들면, 8.769 mg)을 함께 sinigrin 수화물 9 mg의 주위에 무게. 10 mL의 용량 플라스크로 이동 및 초순수의 10.0 mL의에 sinigrin 수화물을 용해. </li><li> 스톡 용액의 몰 농도를 계산하고 원액 희석 50-750 μM 5 ~ sinigrin 참조를 준비한다. 자세한 예를 들어, 참조<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">보충 파일 S1</a> . </li><li> 1.5 mL를 반응 튜브 내의 다른 sinigrin 참조를 분주하고 20 ℃에서이를 동결. 각 추출 배치에 다섯 sinigrin 참조의 시리즈를 포함합니다. 농도를 계산할 때 항상 현재 참조 sinigrin 사용에 대한 올바른 몰 농도 값을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 추출 설치 2. 준비 <ol><li> 파스퇴르 피펫 열에 대한 열 랙을 준비합니다 (열 준비 단계 3.1 참조). 샘플 번호를 추적 할 랙 또는 열의 라벨 (도 1 참조). </li><li> 라벨을 2ml의 마이크로 원심 튜브의 같은 번호를 가진 블록을 준비한다 (단계 3.3 및도 1 참조) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 글루코 추출 랙. 앞면 (왼쪽)과 글루코 추출을위한 자체 제작 열 랙 및 블록의 평면도 (오른쪽). 높이 : 100mm 사이의 거리 (파스퇴르 피펫의 열을 유지하기 위해) 구멍을 이동 : 30mm (x 축)은 15mm (Y 축) ×. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 열 및의 microcentrifuge 튜브 3. 준비 <ol><li> 샘플 당 하나의 열과 다섯 sinigrin 참조 샘플에 대한 다섯 가지 여분의 열을 준비합니다. <ol><li> 각 유리 피펫에서, 유리 섬유 약 1cm × 1 cm의 조각을 놓습니다. 피펫가 좁아 지점으로 유리 섬유를 밀어 나무 또는 유리 스틱을 사용합니다. 유리솜 아웃 실행 컬럼 재료를 방지해야하지만 컬럼 용출 저하하므로, 너무 많이 사용하지 않는다. 장갑 ㅁ 착용유리 양모 작업을 갖추고 있습니다. </li></ol></li><li> 열 선반에 열을 위 (도 1 참조). 연속 열 세척에 사용되는 용리액을 잡으려고 랩 트레이 (폐기물 트레이)의 열 선반을 두십시오. </li><li> 플라스틱를 1ml 피펫 팁 피펫 제조 칼럼 재료 0.5ml의 선단 떨어져 제 5mm 잘라 각 열에 (물 중 G-25 겔을 단계 1.3 참조). 피펫 전에 잘 컬럼 재료를 포함하는 병을 흔들어. 새는 열 (유리 양모 층을 통해 실행 G-25 물질)을 폐기하고 새 것으로 교체합니다. <ol><li> 컬럼에 컬럼 재료 피펫 팅 한 후, 물질을 세척하는 초순수의 1 mL를 넣어. </li></ol></li><li> 샘플 당 2 mL의 반응 튜브와 다섯 sinigrin 참조 샘플에 대한 오 튜브를 준비; 그 레이블을 붙입니다. 이후 동결 건조 용 캡에 구멍을 만들기 위해 해부 바늘을 사용하고 같은 동일한 패턴으로 튜브 블록으로 제조 된 튜브를 배치열 (단계 2.2,도 1 참조). </li></ol> 글루코 4. 추출 <ol><li> (상기 추출물의 최종 글루코 농도가 기준 곡선의 범위 내에 있어야하는 건조 중량의 일반적 50.0-100.0 mg)을 2 ㎖의 가장 가까운 0.1 mg의 표시된 원형 건조 동결 미세 어스 식물 재료 무게 -bottom 반응 튜브. 각 튜브에 지연 제를 끓는으로 두 개의 작은 금속 공 (직경 3mm)를 추가합니다. 주 :이 프로토콜은 또한 액체 질소하에 분쇄 추출 전까지 냉동 보관 된 신선한 플래시 냉동 물질에 적용될 수있다. 재료 (19)에서 물에 의해 희석을 보상하기 위해 85 % 추출액에서 추출 칭량 물질의 양 및 메탄올의 비율을 증가시킨다. </li><li> 간단히 각각의 튜브와 소용돌이에 70 % 메탄올의 피펫 1 mL를. 튜브를 닫고 w 핫로 가능한 한 빨리 그들을 배치하기 전에 안전 캡을 밀봉메탄올 그냥 종기 70 %까지 몇 분 (~ 5 분)에 대한 ater에 목욕 (90-92 °의 C). 주의 :이 단계에서 안전 고글을 착용! </li><li> 15 분 동안 초음파 욕조에 샘플 튜브를 놓습니다. 한편, sulfatase을 가지고 냉동실 중 다섯 sinigrin 참조 샘플 RT에서 그들을 해동. </li><li> 울트라 초음파 후, RT에서 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 2700 XG에 시료를 원심 분리 관; 펠렛 각 튜브에 형성한다. 레이블 컬럼에 상층 액을 추가하고 별도의 컬럼에 다섯 참조 샘플을 피펫. <ol><li> 상층 액을 피펫 팅하는 동안, 피펫 식물 재료를 피하기 위해 펠렛을 통해 잘 팁을 유지한다. 건조 된 샘플을 사용하는 경우, 상청액 용적 미만 1.0 mL로되므로주의. </li></ol></li><li> 샘플 튜브에 남아있는 펠렛을 70 % 메탄올 1 mL를 넣고 15 분간 초음파 욕조에 배치하기 전에 튜브를 소용돌이. 단계 4.4에서와 같이 다시 원심 분리 튜브 및 superna 추가각각의 컬럼에 tants; 컬럼 재료의 특성으로 인해 상기 글루코의 음전하 황산기 구체적 컬럼 상에 보유된다. </li><li> 세 순차적 인 단계에서 추출물 열을 씻으십시오. <ol><li> 각 열 위에 70 % 메탄올의 피펫 2 × 1 mL를. 다음 1 mL를 추가하기 전에 건조 실행할 수있는 열 기다립니다; 이 추출물 (예를 들어, 엽록소)에서 더 많은 비극성 화합물을 제거합니다. </li><li> 각 컬럼에 초순수 1 ㎖를 첨가하여 메탄올을 플러시. </li><li> 피펫 2 × 1 mL의 20 mM의의 NaOAc는 sulfatase 반응을위한 최적의 조건을 만들기 위해 각 열에 버퍼. </li></ol></li><li> 폐기물 트레이 밖으로 열이있는 랙을 가지고 조직과 랙의 발을 건조. 튜브 및 레이블 튜브 블록 위에 선반을 두십시오. 각 열 선단이 대응하는 라벨, 2 ㎖의 튜브에 있는지 확인 (도 1 참조). </li><li> sulfatase의 soluti의 20 μL를 추가열을합니다. sulfatase가 열 재료의 표면에 도달했는지 확인하십시오. 의 NaOAc의 피펫 50 μL는 sulfatase를 플러시 각 컬럼에 버퍼. 알루미늄 호일로 열을 덮고 하룻밤 서 보자. 주 : sulfatase의 활동으로 인해 황산기들은 물로 용출 수 있도록 열에서 desulfoglucosinolates를 풀어 제거한다. 자세한 설명은 Crocoll 등을 참조하십시오. 19. </li><li> 다음날, 각 컬럼에 초순수의 2 × 0.75 mL를 피펫 팅하여 desulfoglucosinolates을 용출. 모든 열 건조 실행 한 경우, 열 선반을 들어 올려 반응 튜브에서 제거합니다. <ol><li> 튜브를 (뚜껑에 구멍이 있는지 확인) 모자 및 액체 질소 나 그들을 동결 -80 C의 냉동고 ° 30 분. 동결 건조 모든 물을 제거 (샘플 개수 및 동결 건조기의 능력에 따라) 12 내지 24 시간 동안 샘플. </li></ol></li> &lt;리&gt; 동결 건조 후는, 초순수의 정확한 양 (일반적으로 1.0 ㎖)에 잔류 물을 다시 디졸브. 표시 HPLC 바이알에 샘플과 다섯 sinigrin 참조를 전송합니다. 최대 2 주 동안 냉장고 (4 ℃) 또는 HPLC로 분석하기 전에 냉동실 (-20 ° C) 최대 1 년에 샘플을 보관하십시오. </li><li> 하룻밤 후드 아래 열 건조 유리를하자 건조시를 폐기하십시오. 재사용을 위해 4.5 단계에서 사용되는 샘플 튜브에서 금속 공을 복구하고 폐기물 처리 bin에 튜브를 넣어. </li></ol> 추출 된 샘플 5. HPLC 측정 <ol><li> 아세토 니트릴 - 물 구배를 갖는 역상 C 18 컬럼 (4.6 × 150 mm의 3 μm 인 300 Å)의 글루코 별개 0.75 mL / 분의 흐름 및 40 ℃의 칼럼 온도 (표 1 참조) . 229 nm에서 검출과 정량을 수행합니다. </li><li> 같은 열에 있지만 적응 그라데이션으로 sinigrin 참조를 측정용매 사용을 감소시키는 방법 (표 2 참조). 가장 낮은 농도를 기준으로 시작, 다섯 sinigrin 참조를 주입 시작합니다. 그런 다음 열을 청소하고 피크의 이월을 방지하기 위해 모든 열 번째 샘플 후 메탄올 주입 (공백)를 포함하여 샘플을 주입. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시간 [분] </td><td> 흐름 [mL / 분] </td><td> % 물 </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> (35) </td><td> 0.750 </td><td> (65) </td><td> (35) </td></tr><tr><td> (40) </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="4"> 칼럼 온도 40 ° C를. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 글루코 분리 및 analysi에 대한 아세토 니트릴 - 물 구배역상 HPLC에 S. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시간 [분] </td><td> 흐름 [mL / 분] </td><td> % 물 </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> (10) </td><td> 0.750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> (11) </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 이 </td></tr><tr><td colspan="4"> 칼럼 온도 40 ° C를. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 글루코의 정량에 사용되는 다섯 sinigrin 참조 정량 단축 아세토 니트릴 - 물 구배. 6. 글루코 식별 및 정량 <ol><li> 신분증 <ol><li> 상업적 이익과 샘플의 피크의 UV 스펙트럼 및 유지 시간을 비교수, 순수 글루코 참조. 다양한 글루코 클래스에서 UV 스펙트럼의 예 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 가능하면, 참조 표준 또는 LC-MS 18, 19 일에 알 수없는 글루코을 확인합니다. </li><li> 핵 자기 공명 (NMR), 가능하면 알 수없는 글루코을 확인합니다. </li><li> 그림 2, 표 3, 데이터베이스, 또는 참고 문헌에서 그와 피크의 UV 스펙트럼 및 유지 시간을 비교합니다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> 가장 일반적인 글루코 클래스도 2 UV 스펙트럼. 여섯 desulfoglucosinolates (GSL)의 UV 흡수 스펙트럼 (200 ~ 350 나노 미터)의 가장 일반적인 구조를 나타내는 클래스 여기서 설명으로서 추출 시판 기준 화합물로 이루어지는 용액에 기초. 일반적인 이름은이야tructural 이름 (괄호 사이), 및 구조 클래스가 제공됩니다. (A) Sinigrin (2- 프로 페닐 GSL) 알 케닐; (B) glucoerucin (4- methylthiobutyl GSL) thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4- methylsulfinlybutyl GSL), 설피 닐; (D) glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL) 인돌; (E) gluconasturtiin (2- 페닐 에틸 GSL) 방향족; (F) sinalbin 방향족 (4- 히드 록시 GSL). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="2"><li> 부량 <ol><li> 다섯 sinigrin 참조 및 샘플의 피크 아래의 면적을 통합한다. </li><li> 통합 된 영역에 기초하여 상기 측정 된 다섯 sinigrin 참조의 검량선을 구한다. 회귀 직선의 식을 사용하여 글루코 (수학 식 2 참조)의 보간 된 양을 계산하는 (수학 식 1 참조).</li><li> 다양한 글루코의 농도를 계산하는, EC에서 229 nm에서 검출을위한 반응 인자 (M)에 의해 보간 된 양 (X)을 곱 (1990) 16 부 흐너 (1987) 15, 또는 브라운 등. (1993) 17; 가장 일반적으로 검출 desulphoglucosinolates의 합의 응답 계수는 표 3에 제시되어있다. 참고 : 다릅니다 응답 요소 시스템-이 다른 참조에 의해 주어진 서로 다른 값이 있다는 이유가 될 수있다 (참고 문헌 15 ~ 17 참조). 그럼에도 불구하고, 값은 대부분 아주 가까운 및 구조 클래스와 유사한 범위에 있습니다. 협약에 따라, glucobrassicin 다른 인돌 글루코 (도 2)와 유사한 UV 스펙트럼을 가진 알 인돌 글루코 위해 그것을 얻기 위해 응답 인자로서 0.25를 사용하는 것이 바람직 할 것이라고했지만, 1 미확인 글루코의 응답 인자를 설정할농도의 현실적인 추정치 (표 3). </li><li> 샘플에서 글루코 최종 량 (X의 t)를 계산하기 위해 고려 분석에 사용되는 희석 계수 (D) 및 샘플의 질량 (W)을 가지고 (수학 식 3 참조). <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (삼) Y = 피크 면적 기준 5 점의 회귀 곡선의 기울기 m은 = C = Y 축으로 회귀 직선의 절편 추출물의 글루코의 X = 양 식물 샘플에서 글루코의 X t = 농도 D = 희석 인자 외 흐너 (1987) 또는 갈색의 229 nm에서 검출은 M = 응답 인자. (1993) w = 시료의 질량 추출에 사용 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 설립 널리 사용되는 방법의 가장 큰 장점은 강력한 오히려 간단하고, 샘플 당 상대적으로 저렴한 비용이라고합니다. 추출과 분석에 필요한 설비의 대부분은 표준 실험실에서 사용할 수 있어야하거나 PDA-HPLC를 제외하고 자기 구축 할 수있다. 또 다른 장점은 물에 용해 desulfoglucosinolates이 시원하고 기밀 (HPLC) 유리 병에 보관하면 화학적으로 매우 안정하기 때문에 추출물이 쉽게 다른 곳에서 HPLC 분석에 배송 할 수 있다는 것이다. 훈련 된 데이터를 소프트웨어를 관리 및 분석하기위한 광범위한 체험 전문 필요 LC-MS 플랫폼 대조적으로, HPLC-UV / PDA를 쉽게 짧은 훈련 기간 이후에 수행 될 수있다. 이 절차의 비용을 줄일뿐만 아니라, 학생 포함한 과학자 광범위한,이 방법은 더 접근하게 아닙니다. 일반적으로, 절차는 전술 한 바와 carefu을 따라하는 경우에서야 베드로, 몇 가지 문제가 발생한다. 일반적으로, 글루코 피크가 아주 잘 크로마토 그램에서 분리된다. 이러한 경우가 아니라면 그래디언트 프로그램 용리액 아세토 니트릴의 증가 속도를 감소시킴으로써 적응 될 수있다. 또한, 새로운 사전 열 (200-500 주사) 또는 열 (1,500 -2,000 주사)에 구축하면 문제를 해결할 수 있습니다. 때때로, 배치에서 단일 시료의 크로마토 그램은 매우 작거나없는 피크 표시 될 수 있습니다. 이 sulfatase를 추가 할 때 인해 피펫 오류로 일반적으로 (예를 들어, 열이 생략되었거나 sulfatase가 제대로 열 아래로 세척되지 않았다). 예상과 너무 작은 물질이 추출에 사용 된 것보다 다른 방법으로, 실험 재료의 글루코 농도가 낮은되었을 수 있습니다. 후자의 경우, 주입 부피는 100 μL로 증가 될 수 있거나, 추출물의 정확한 부분 표본 (예를 들어, 800 μL)를 농축 할 수있다. 후자는 동결 건조에 의해 달성 될 수있다물을 작은 부피 (즉, 100 μL)에 잔류 물을 용해시키고, 추출물을 보내고, 같은 기준 곡선을 사용하여 재 주입. 추출물의 원래 농도 계산에서, 번호는 희석 인자에 의해 승산되어야한다. 이 문제가 해결되지 않으면, 재료보다 출발 물질을 사용하여 다시 추출해야합니다. 이 100mg 이상이면, 추출 용매의 부피 및 튜브의 크기는 광 추출 효율을 유지하기 위해 비례 적으로 조정되어야한다. 추가 장점은이 방법이 잘 검증 된 것입니다. 이 절차 및 정확도 여러 실험실에서 확인 된 16하는 유채에서 글루코의 정량화를위한 표준 방법으로 설명되어 있기 때문이다. 또한, 유전 적 배경 생합성 및 글루코의 생물학적 기능이 모드에서, 강렬한 연구 노력 될 수 있습니다다른 사람 4, 6, 12 중에서 엘 식물 종의 애기 장대. 따라서 sinigrin 관련 desulfoglucosinolates의 정확한 정량 많은 응답 요소는 잘 정의되고 15,17 공개. LS-MS 기반 프로토콜이 더 높은 처리량, 더 민감하고, 할 수 있지만 (가칭)에는 표준 18, 19, 20, LC-MS에 대한 보편적 인 응답 요소의 부족이 제한 사용할 수 없습니다하는 글루코를 식별 글루코 농도 (18)의 정확한 정량. 더욱이, 이러한 방법은 통상적으로 신선한 식물 재료의 동결 건조 공정, 및 물의 양을 포함하지 않는 것은 정확한 정량 어렵게 계산에 불명이다. 우리 추출법이 포함하기 때문에 마지막 열 기반정제 및 농축 단계, 또한 이러한 통 (21)과 같은 글루코 저농도로 &quot;더티&quot;샘플들에 적용될 수있다. 일반적으로, 신선 동결 재료를 추출하는 추출을 위해 96 웰 플레이트를 사용하고, sulfatase 단계 (18, 19)를 포함하지 않는 LC-MS 기반 방법에 비해, 제안 된 방법은 상대적으로 많은 시간과 노동 강렬하다. 이 문서에 설명 된 열 랙으로, 한 사람이 하루에 약 100 ~ 150 샘플을 추출 할 수 있습니다. 용출 (다음 날), (밤새) 건조 동결 및 재 용해은 다음 두 가지 일 이내에 일어날 수 있습니다. 자동화 된 HPLC 인젝터, 분사 당 40 ~ 45 분의 실행과 평형 시간, 어떤 예기치 못한 사건으로,이 샘플 세트에 대한 데이터를 수집 3-4 일이 소요될 것입니다. HPLC를 소프트웨어는 자동 정량 sinigrin 곡선, 크로마토 그램 및 체육의 수동 검사를 기반으로 허용하는 경우데이터가 통계 분석을 위해 사용하기 전에 100 샘플 AK 과제는 다시 1 또는 2 시간이 걸릴 수있다. 글루코 표준의 증가 가능성에도 불구하고, 130 개 이상의 후보들의 작은 부분은 현재 상업적으로 구입할 수있다. 그러나 생합성 각 클래스에 대한 몇 가지의 참조와; 화합물을 특정 문헌 데이터베이스에 대한 액세스는 이전 식물 종에서 발견 (예를 들어, 파헤이 (22) 등.); 이러한 eluotropic 일련의 논리와 같은 크로마토 그래피 원리의 기초 지식 (예, 지방족 화합물의 측쇄에 세슘의 숫자를 증가시키기 위해, 3 및도 4); 및 NMR (23)에 대한 LC-MS (19) 또는 격리 된 글루코 단일 샘플의 검증, 하나는 쉽게 이러한 한계를 극복 할 수 있습니다. 글루코위한 대부분의 프로토콜은 내부 기준 곡선을 사용하여 분석(즉, 추출 용매 16, 17, 19 sinigrin의 추출 또는 sinalbin 특정 농도). 원칙적으로, 내부 기준 곡선은 높은 정밀도를 얻을 따라서, 이론적으로 각각의 시료 처리 오류를 정정하는 것이 더 적합하다. 이러한 장점에도 불구하고, 우리는 주로 (예를 들어, 브라 파괴 해 24) 또는 sinalbin (예 Sinapis 알바 25)에 sinigrin 높은 수준을 함유 일부 다른 야생종을 분석 같이 5 점 외부 기준 곡선을 선호 이 글루코 참조하는 응답 요소를 사용할 수 있습니다. 고급 글루코 참조 표준은 일반적으로 매우 비싼 더욱이, 각 샘플의 내부 표준을 첨가하여, 분석의 비용을 증가시킨다. 결론적으로, 시간 - 소모적 인 단계에도 불구하고,이 프로토콜추출 및 식물 샘플에서 글루코을 정량화 할 수있는 간단하고 접근 방법을 제공한다. 그러나, 글루코 수준 자체는 단일 글루코 (11)로부터 발생하는 반응 생성물의 단지 myrosinase와 반응 할 필요성으로 본 전위 생물학적 활성의 표시, 및 변동 것을 고려하는 것이 중요하다. 유효성 검사 분석은 생물학적 관련성을 확인하기 위해 수행해야합니다.

식물 화학 물질 (1)의 20 개 이상의 서로 다른 종류를 생산하는 것으로 추정된다. 이들 화합물의 소수 식물 &#39;차 대사, 연료의 성장과 재생에 중요한 역할을하는 것 같다; 대부분의 이차 대사 산물을 소위. 그들은 꽃가루 매개자를 유치하거나 병원균과 초식 동물 (1)에 대한 공장을 방어하는 역할로 자신의 이름에도 불구하고, 이차 대사 산물은 종종 식물의 생존과 재생을 위해 중요하다. 글루코은 150 년이 공부 한 이차 대사 산물의 매우 다양한 클래스입니다. 현재까지 130 개 이상의 구조적으로 다른 글루코는 3 확인되었습니다. 넓게 글루코들은 합성하는 아미노산에 따라 다른 클래스로 분할 될 수있다. 글루코 인돌, 예를 들면, 아미노산으로부터 합성된다트립토판, 페닐알라닌 반면 방향족 글루코 (4)의 합성을위한 기본 골격을 제공한다. 클래스 내에서, 지방족 글루코의 클래스로서 생합성 경로에 순차 사슬 연장 단계에 의해 초래 또는 측쇄 변형 (예를 들어, 히드 록 실화) -4,5-입니다 구조적 다양성의 높은 수준이있다. 하나 글루코 식물 종은 다른 구조 클래스 6에 속하는 최대 37 다른 글루코를 포함 할 수있다. 식물 종은 전형적인 글루코 프로파일을 가지고 있지만, 글루코의 유형에 대한 종자 간 변화는 자주 개인과 인구 6, 7 사이에서 발견된다. 그대로 글루코은 식물 세포의 액포에 저장되어있는, 지하 또는 지상 장기 7에서 찾을 수있다 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9. 전지 파열 (예를 들어, 초식 동물에 의해)시, 글루코이 해제되고 겨자 기름 폭탄 (10)을 설정, 효소 myrosinase와 혼합된다. 인해 myrosinase의 활동 및 글루코, 반응 조건 및 변형 효소의 존재의 구조에 따라 상이 매운 독성 또는 유해 화합물 등 니트릴 (ISO) (11) 티오 시아 네이트와 같이 형성된다. 반응 생성물은 높은 생물학적 활성을 갖고; 예를 들면, 그들은 총합 초식 곤충 기피제 (12)의 역할을한다. 글루코의 유전 및 생합성 경로가 아니라, 주로 때문에 초식 동물과 병원균에 저항, 겨자와 양배추의 맛을 구성 요소와 가치, 그리고 부정적인 (progoitrin) 및 인간의 건강 5에 긍정적 인 (glucoraphanin) 효과에 대한 자신의 중요성, 연구한다 </sup&gt; 13, 14. 때문에 역상 고압 액체 크로마토 그래피, 자외선 (UV) 또는 포토 다이오드 어레이를 구비 (HPLC)에 기초하여 생물학적 활성 화합물을 추출 및 검출 방법과 같은 글루코에서 큰 관심 (PDA) 검출기는 일반적으로 1980 년 15부터 사용되어왔다 . 이 방법을 바탕으로, 유럽 공동체는 종자의 글루코 분석 (브라 시카 napus, 평지, 카놀라 16)에 대한 몇 가지 실험실에서 테스트되고 검증 된 표준 프로토콜을 발표했다. 기타 17 (유채에 존재하지 않는 글루코에 대한 추가 응답 인자를 결정함으로써, 예를 들어)이 메소드에 추가됩니다. 글루코 분석 (18), 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS) 플랫폼 및 높은 처리량 프로토콜의 증가 함에도 불구 <suP&gt; (19)는, 원래의 HPLC-UV / PDA 방법은 아직 널리 과학자들에 의해 사용된다. 주요 이유는이 방법이 간단하고 비용 효율적인, 그리고 광범위한 화학 분석 기술 인프라없이 실험실에 상대적으로 액세스 할 수 있는지입니다. 이 지역 사회에 봉사하기 위해, 식물 재료에서 글루코의 추출 및 HPLC-PDA와의 desulfo-형태의 분석을 위해 우리는 여기에 세부 프로토콜.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM&#174; gradient grade for HPLC grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,864,320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (NaOAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302406-1KG-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,090,571,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;(&#8722;)-Sinigrin hydrate 
			from horseradish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1647-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aryl Sulfatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9626-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,816,298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipette</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4518.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7377.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass /wooden stick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HERE1080766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo-lab dishes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0772.1</td>
			<td>Waste tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer Freezone 12 L</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7960030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitril super gradient grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,639,320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-5112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB 15061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH Electrode</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>STARA2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Multifuge X1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69697</td>
			<td>C18 column (4.6 x 10 mm, 5 &#181;m, 300 &#197;)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Acclaim 300</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60266</td>
			<td>C18 column (4.6 x 150 mm, 3 &#181;m, 300 &#197;)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Ultimate 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>with column oven and UV or PDA detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 1000 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosinolate reference compounds</td>
			<td>Phytoplan</td>
			<td>various</td>
			<td>http://www.phytoplan.de/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a straightforward method for glucosinolate extraction and analysis with high-pressure liquid chromatography (hplc)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

이 방법은 감지 및 모든 구조 클래스에서 일반적으로 발견 desulfoglucosinolates의 분리 (그림 3) 할 수 있습니다. 해로운 2 hydroxyglucosinolate의 progoitrin은 상대적으로 초기 크로마토 그램에서 제공하고 명확하게 유익한 글루코의 glucoraphanin,이 샘플에서 유일하게 methylsulfinylglucosinolate에서 분리된다. Sinigrin는 gluconapin 및 glucobrassicanapin 증가 사이드 체인 길이 (각각 C3, C4 및 C5)와 알케 글루코의 eluotropic 시리즈를 형성한다. 비슷한 논리 시리즈는 두 methylthioalkenyl의 글루코를 들어, glucoiberverin (C3) 및 glucoerucin (C4) 볼 수 있습니다. 4- 히드 록시 및 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin)이 세 인돌 글루코, glucobrassicin의 봉우리와 그 유도체는 또한 명확하게 구분됩니다. 주의 할 점은 neoglucobrassicin 및 glucoerucin 피크뿐만 아니라 gluconasturtiin 유일한 방향족 gluco이 샘플에서 sinolate 인해 믹스 9 루트 추출물의 첨가에이 브라 시카 추출물에서 특히 높다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> 그림 3 : 글루코 추출물의 크로마토 그램. 결합 브라 시카 파괴 해에서 루트 및 촬영 샘플, B.의 라파 및 B. 올레 라 케아의 분석 결과 HPLC 크로마토 그램의 세부 사항 (32 분). 피크 라벨 체류 시간 및 식별 desulfoglucosinolates 대한 약어 (GSL)을 나타낸다. PRO progoitrin = (2-OH -3- 부 테닐 GSL); 라프 = glucoraphanin (4- methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2- 프로 페닐 GSL) GNA = gluconapin (3- 부 테닐 GSL); (40H) = 4 hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3- 메틸 티오 프로필 GSL); GBN = glucobrassicanapin (4- 펜 테닐 GSL); ERU = glucoerucin (4- methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL); NAS = gluconasturtiin (2- 페닐 에틸 GSL); NEO = neoglucobrassicin (1 메탄올 - glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> Rorippa의 austriaca의 뿌리 추출물에서 볼 수 있듯이 일반적으로 모델 식물 애기 장대에서 발견되는 긴 체인 메틸 술의 글루코은 또한, eluotropic 시리즈를 보여줍니다. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), 및 glucoarabin (C9)의 크로마토 그램 (그림 4)에 일정한 간격으로 나타납니다. 함께 피크의 UV 스펙트럼과 같은 논리 eluotropic 시리즈 알 글루코 분류하고, 잠정적으로 식별하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> 그림 4 : 크로마토 그램 (프레임 9-30 분)는 Rorippa austriaca 뿌리 추출물의 desulfoglucosinolates의. 피크 라벨 체류 시간 및 식별 desulfoglucosinolates 대한 약어 (GSL)을 나타낸다. HES = glucohesperin (6- methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7 methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (인돌 -3- 일 메틸 GSL); HIR는 glucohirsutin (8 methylsulfinlyoctyl를 GSL) =; ARA = glucoarabin (9 methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1 메탄올 - glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 일반 이름 </td><td> 측쇄 구조 </td><td> 체류 시간 (분) * </td><td> 229 nm의 </td><td> 참고# </td></tr><tr><td> aliphatiC의 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> 메틸 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Sinigrin </td><td> 2- 프로 페닐 </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> 브라운, EC </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3 테닐 </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4 펜 테닐 </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3 메틸 티오 </td><td> 10.9 </td><td> 0.8 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4 methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3 methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoraphanin </td><td> 4 methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5 methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6 methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7 methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8 methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9 methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3 methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0.9 </td><td> 갈색 </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH -3- 부테 </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH -5- 펜 테닐 </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> EC </tD&gt; </tr><tr><td> 인돌 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 hydroxyglucobrassicin </td><td> 4- hydroxyindol -3- 메틸 </td><td> 11.2 </td><td> 0.28 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicin </td><td> 인돌 -3- 일 메틸 </td><td> 15.3 </td><td> 0.29 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 4 Methoxyglucobrassicin </td><td> 4- methoxyindol -3- 메틸 </td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1- methoxyindol -3- 메틸 </td><td> 22.5 </td><td> 0.2 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 방향족 글루코 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4- 히드 록시 벤질 </td><td> 8.1 </td><td> 0.5 </td><td> 뷰 흐너 </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH -2- 페닐 에틸 </td><td> 12.1 </td><tD&gt; 0.95 </td><td> 다음 참조 </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH -2- 페닐 에틸 </td><td> 12.7 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너 </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> 벤질 </td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2- 페닐 에틸 </td><td> 18.0 </td><td> 0.95 </td><td> 뷰 흐너, EC </td></tr><tr><td> 알 - 지방족 / UV 스펙트럼과 같은 방향족 </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> EC </td></tr><tr><td> 알 - 스펙트럼 등 인돌 </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> EC </td></tr><tr><td colspan="5"> * 대략적인 체류 시간 (RT)은 (열, 용출액의 품질에 따라 0.3 분 ±) 가까운 0.1 분에 둥근. 체류 시간은 C 18 컬럼 (150 X 4.6 mm, 3 마이크로 미터의 입자 크기) 플러스 C (18)가 장착 ThermoFisher / 다이오 넥스 궁극적 인 HPLC 플랫폼에서 결정된다 </s표 1에서와 같은 기울기 프로그램 UB&gt; 프리 컬럼 (10 × 4.6 mm, 5 마이크로 미터의 입자 크기). </td></tr><tr><td colspan="5"> 응답 요인 # 참고 : 유채의 글루코에 흐너, R. (에디션 JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff 출판사, 1987); 브라운, PD, Tokuhisa, JG, REICHELT, M. &amp; Gershenzon, 다른 장기와 애기 장대의 발달 단계 중 글루코 축적 J. 변화. 식물 화학. 62 (3), 471-481, 도이 : 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6 (2003); EC. 오일 씨앗 - 글루코 고성능 액체 크로마토 그래피의 결정. 유럽 ​​공동체의 공식 저널. L의 28분의 170. 부속서 VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> 표 3 :의 응답 요인이 가장 일반적으로 발견 desulfo - 글루코 C (18) 열에 식물 추출물과 대략적인 체류 시간. 용리액, gradien표 1에서 t, 컬럼 온도 및 유속.

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A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

고압 액체 크로마토 그래피와 글루코 추출 및 분석을위한 간단한 방법 (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

25.0K 조회수.  German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig. Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography. 

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

연구

화학

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. Specifically, the sapphire cell enables visual data collection from multiple loadings to solve a set of material balances to precisely determine phase composition. Ternary phase diagrams can then be established to determine the proportion of each component in each phase at a given condition. In principle, any ternary system can be studied although ternary systems (gas-liquid-liquid) are the specific examples discussed herein. For instance, the ternary THF-Water-CO2 system was studied at 25 and 40&#160;&#176;C and is described herein. Of key importance, this technique does not require sampling. Circumventing the possible disturbance of the system equilibrium upon sampling, inherent measurement errors, and technical difficulties of physically sampling under pressure is a significant benefit of this technique. Perhaps as important, the sapphire cell also enables the direct visual observation of the phase behavior. In fact, as the CO2 pressure is increased, the homogeneous THF-Water solution phase splits at about 2 MPa. With this technique, it was possible to easily and clearly observe the cloud point and determine the composition of the newly formed phases as a function of pressure.
The data acquired with the sapphire cell technique can be used for many applications. In our case, we measured swelling and composition for tunable solvents, like gas-expanded liquids, gas-expanded ionic liquids and Organic Aqueous Tunable Systems (OATS)1-4. For the latest system, OATS, the high-pressure sapphire cell enabled the study of (1) phase behavior as a function of pressure and temperature, (2) composition of each phase (gas-liquid-liquid) as a function of pressure and temperature and (3) catalyst partitioning in the two liquid phases as a function of pressure and composition. Finally, the sapphire cell is an especially effective tool to gather accurate and reproducible measurements in a timely fashion.

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

The high pressure sapphire cell apparatus is a unique tool to study, without sampling, phase behavior under a wide range of pressures. Using a cathetometer, very precise volume measurements can be recorded to measure liquid expansion and phase composition. Thus, this synthetic method enables the study of (1) phase equilibria of multi-component mixtures and (2) the partition behavior of catalyst or model compounds as a function of pressure.

CO의 상 평형 측정을위한 고압 사파이어 셀<sub&gt; 2</sub&gt; / 유기농 / 물 시스템

The high pressure sapphire cell apparatus was constructed to visually determine the composition of multiphase systems without physical sampling. ...

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

빠른 초 임계 추출 방법을 통해 실리카 에어로젤, 모노 리드 (monolith)를 준비

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

방법은 표면 산화와 환원을 통해 액체 금속의 표면 장력을 조작

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

고압 PX에서 단결정 회절 ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction is to modulate the lipophilicity of the compound. In our group, we are interested in the study of the impact of fluorination on lipophilicity of aliphatic fluorohydrins and fluorinated carbohydrates. These are not UV-active, resulting in a challenging lipophilicity determination. Here, we present a straightforward method for the measurement of lipophilicity of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy. This method requires no UV-activity. Accurate solute mass, solvent and aliquot volume are also not required to be measured. Using this method, we measured the lipophilicities of a large number of fluorinated alkanols and carbohydrates.

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A novel and straightforward variation of the shake-flask method was developed for accurate lipophilicity measurement of fluorinated compounds by 19F NMR spectroscopy.

19F NMR 분광학을 사용 하 여 Lipophilicity (로그P) 측정을 위한 새로운 간단 방법

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

온화한 에탄올 추출 및 Depolymerization 수율에 미치는 영향에 의해 높은 β-O-4 콘텐츠 리그 닌의 추출

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...