Name: analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
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この研究は、AHにNIHの助成R01 HL119984によってサポートされていました

マウス胚線維芽細胞の1文化（MEFの） <ol><li> MEF培地中、15％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）を、準備します。 </li><li>室温（RT）で30分間0.5％ゼラチン溶液でコート100ミリメートル細胞培養皿を。 </li><li>サイトメーターを使用したMEFを数えます。ゼラチン溶液を除去し、直ちに37℃に予め温めMEF培地を注ぎます。急速100mmのゼラチンコートディッシュあたり2.8×10 6のMEFを播種次いで、2分間37℃の水浴中でマイトマイシンC処理したMEFのバイアルを解凍します。他のサイズのお皿を使用している場合はそれに応じて細胞数を調整します。 37°C、5％CO 2で一晩のMEFをインキュベートします。 </li><li>翌日のメディアを変更します。 MEF層まで2-3日間培養が合流です。 </li></ol> 2.マウスESC文化<ol><li> 15％FBSおよび10を補充したESC培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を調製3 U / mlの白血病抑制因子（LIF）、0.1mMの非必須アミノ酸、55mMの2-メルカプトエタノール、ペニシリン（100U / ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mLの）、ゲンタマイシン（200μgの/ mL）に溶解し、0.2％マイコプラズマ抗生物質。 </li><li>ステップ1で調製した皿からMEF培地を除去し、37℃で予熱したESC培地で置き換えます。 </li><li> MEF層の上にESCバイアルおよび種子細胞を解凍。 ESCがコンフルエンスに達するまで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li><li> MEFののコンフルエントな単層を含む新しい細胞培養皿を準備します。通路へのESCは、PBSで1回洗浄し、37℃、5％CO 2で2-5分間0.25％トリプシン/ EDTAを用いて取り外します。剥離細胞を、15％FBSを含む新鮮なIMDMを添加することによりトリプシン処理を停止し、15 mLの試験管に細胞懸濁液を転送し、そして室温で5分間、160×gで遠心分離。 </li><li>上清を除去し、それぞれの新しいMEFで被覆された皿への細胞の新鮮なIMDM通路五分の一でのESCを再懸濁。細胞までインキュベート（通常4〜5日）の合流に達します。 </li></ol> 3.ゼラチンでコーティングされたプレート上のMEFと文化のESCを撤回<ol><li> ECSSは、ステップ2.4のように0.25％トリプシン/ EDTAを用いてそれらとのMEFを切り離し、コンフルエンスに達した新鮮なIMDM中で細胞を再懸濁し、非接着細菌ペトリ皿に移し、37℃、5％COで40分間インキュベート後2。 </li><li>注意深くESCを繰り返しピペッティングを回避5mLのピペットを用いて新たなゼラチンコートプレートにMEFを含有培地を移します。 ESCのが付着しないので、ペトリ皿に残った細胞は、MEFのです。 </li><li>パッセージのESC 3〜4日毎に。あまり頻繁に継代はESCの多能性を減らすことができます。それは差別を好むこととして、60％の密集度を超えないようにしてください。 </li><li> MEFのは確かのMEFが存在しないにするために、20Xの対物レンズを用い、細胞培養顕微鏡によってもはや検出されるまで繰り返して、必要に応じて、3.2から3.3まで3回以上のステップはありません。 </li><li> ESCをチェックすることにより、ESCの多能性を確認してください細胞は、典型的なESC多角形形態（ 図1A）との密なコロニーを形成するかどうかを確認するために培養。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）17によってテストセル幹細胞性、17をイムノブロッティング、またはコア多能性転写の免疫蛍光17（ 図2）の要因に依存します。 </li></ol> 4. EBの形成<ol><li> DMSO中10mMでのオールトランスRAのストック溶液を調製し、そして1.5 mLのアリコートに光保護微量遠心管。解決策は2週間まで-80℃で安定しています。光から保護します。 </li><li>ステップ2.4のようにトリプシン処理のESC;単一細胞懸濁液として、LIFを含まない新鮮なIMDMでreplate。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、0.5μMのRAを有するIMDM中、5×10 5細胞/ mLの懸濁液を調製します。 </li><li>プレート100 8チャンネルピペットを用いて100 mmのペトリ皿当たり20μL-滴200μLのヒント、反転食器、乾燥からぶら下がっ滴を防ぐために、PBSで反転蓋を埋めます。光からRA含有培地を保護します。 </li><li>ハンギング培養EBを、4日間、37℃、5％CO 2で低下します。 </li></ol> 5. 2D EB文化<ol><li> RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンでコーティング12ミリメートルの円形カバーガラス。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置き、そしてウェル当たり1 mLのIMDMを加えます。 </li><li>収穫3日成長ドロップEBを200μLピペットチップとの一つずつをぶら下げと同じピペットチップを使用して、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にウェル当たり20のEBSをそれらをシード。 注：彼らはカバースリップに良好に接着するので3日間のEBは、4日間のEB上で好ましいです。 </li><li> LIFなしIMDM-15％FBSと文化を続行します。 3〜4日毎に培地交換してください。必要に応じてタンパク質分泌分析のために用いられる培地を収集します。 </li></ol>分泌タンパク質の6の検出<ol><li> EBのメディの500μLを転送UMへの10kDaカットオフの遠心フィルタ、4°Cで60分間20,000×gでスピン。 </li><li>遠心フィルター内の過度の濃縮を防ぐために、すべての15-20分を残りのメディアを調べます。残りの培地の体積は25μlに低下したときに遠心分離を停止します。 </li><li>製造者の指示に従って、フィルタを反転し、4℃で160×gでスピンした後に残った濃縮培地を収集します。 </li><li>特異的抗体17を用いたイムノブロッティングによって分泌されるタンパク質を検出します。 </li></ol> 7. 3D EB文化<ol><li>ステップ5.2で説明したように懸滴中で4日間成長させたEBを収集し、そして1.5mLの遠心管（チューブ当たり30件のEB）に置きます。 </li><li> （ 材料/機器の表を参照）、3Dコラーゲン培養キットの説明書に従ってコラーゲンゲル溶液を調製します。コラーゲン溶液と5×DMEM（キット構成要素）の適切な量を希釈します。 n個を追加eutralization溶液（キット構成要素）と、すぐによく混ぜ、氷の上にこれを維持します。 </li><li> EBSを含む1.5mlチューブに冷却したコラーゲン溶液の適切な体積をピペット穏やか1mLのピペットチップを用いて、6ウェルプレートのウェルに移します。泡を作ることは避けてください。 </li><li>直ちにコラーゲンの重合を開始するために60分間、37°C​​、5％CO 2にプレートを転送します。 </li><li> IMDMでEBを含有するプレートを重ねます。 </li><li> 3〜4日毎に培地交換。 </li></ol> 8. EB解離<ol><li> 200μlのピペットチップを用いて、一枚ずつ（ステップ4から）4日目のEBを収集し、15％FBSを有する非接着性細菌ペトリ皿を含有するIMDMに転送します。さらに4日間、37℃、5％CO 2で培養。彼らは一番下に取り付けていないことを確認するために二回、毎日のEBを確認してください。穏やか底にEBの付着を防止するために、皿を振ります。 </li><li> 5分間遠心185×gでのEBで卓上遠心機でRT、。 </li><li>上清を除去します。ペレットは、各チューブに100μLを超えてはなりません。 </li><li> PBS中20％FBSを補充したIチューブ当たりコラゲナーゼEBを1mLの0.25％のタイプを、ペレット化するために追加。 </li><li> 、37°C​​、5％CO 2で1時間EB-コラゲナーゼ混合物をインキュベート1mLのピペットチップを使用して、穏やかに20分毎にそれをピペッティング。 </li><li> PBSで穏やかに3倍の細胞を洗浄。細胞凝集体が存在している場合は、それらを削除するには、100ミクロンのメッシュでセルストレーナーを使用しています。 </li><li> IMDMでゼラチン被覆の60mm皿に細胞をReplate。次いで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol>解離EBの9.トランスフェクション<ol><li> QRT-PCRおよび免疫ブロット法、0.5％ゼラチンでコート6ウェルプレートのために。 </li><li>免疫蛍光法、RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンで被覆ガラスカバースリップのために。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置きます。 IMDMを追加します。 </li><li>シード4.75×10 5または1×10 5 </SUP&gt;それぞれ、6-または24ウェルプレートにウェル当たりEB細胞（8.4から8.7ステップ）を解離しました。 </li><li>トランスフェクション前に70％コンフルエンスまで細胞を成長させます。 </li><li>製造業者の指示に従って、（ マテリアル/機器 の表を参照のこと）非リポソーム脂質幹細胞最適試薬17で細胞をトランスフェクトします。 注：我々が使用した試薬は、一般的には50％のトランスフェクション効率に達した（ 代表的な結果を参照してください）。 </li><li> QRT-PCRにより、または、それぞれ、17 2、3日、トランスフェクション後に免疫ブロット法によってサンプルを分析。 </li></ol>免疫蛍光によってEB分化の10分析<ol><li>洗浄2DのEBまたはPBSで解離3D EBを、室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定された細胞は浮遊細胞残屑を除去するためにPBSで3回洗浄します。 注：パラホルムアルデヒドは皮膚や眼への刺激性です。それを取り扱う際は注意してください。 </li&gt; <li>その後、RTで20分間、細胞を透過性PBSで3回洗浄するPBS中1％トリトンX-100を加えます。 </li><li> PBSを除去し、30分間PBS中5％BSAでブロックします。 </li><li> 1％BSA中の一次抗体希釈液を調製/ PBS、0.03％のトリトンX-100を補いました。一次抗体溶液によってブロッキング液を交換してください。 RTで3時間インキュベート、または4℃で一晩、次いで細胞をPBSで3回洗浄します。 </li><li>製造元の指示に従ってPBSで二次抗体を適用します。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、RTで1時間インキュベートします。 </li><li>マウントは、光学顕微鏡のための抗フェード媒体をガラススライド上にカバースリップ。 </li></ol>

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著者は、彼らは、競合や金融利害関係を持たない宣言します

このプロトコルでは、我々は、マウスESCの神経分化を研究するため、比較的簡単で、アクセス方法を提示します。以前のプロトコルでは、RA、または直ちにEBドロップ・アグリゲーション21を吊り下げた後に、それぞれ、2日目又はEBのハンギングドロップ8又は懸濁培養7によるの4日目に培地に添加しました。私たちが考案したプロトコルで?...

ESCは胚盤胞の内部細胞塊に由来します。彼らは起源の生物の任意の細胞型に分化する能力を持っている、すなわち、これらの細胞は、多能性があります。 ESC のin vitro分化は、発生経路とメカニズムを調べるための実験システムとして幅広い重要です。それは、細胞や組織の機能不全を補正するための新しい治療アプローチをテストするための強力かつ柔軟なモデルシステムを提供しています。 EBは、初期胚発生時の細胞分化の多くの側面を再現します。胚致死は難しい胚欠陥1,2の細胞の基礎を決定することができる場合、特に、EBを使用することができます。 EBを懸滴または液体懸濁液技術3のいずれかによって形成することができます。前者の利点は、このように、実験の再現性を容易に、一貫したサイズおよび密度のEBSを生成する能力です。 4の10種類によって認識される基底膜成分です。 RAは、神経分化5,6を誘導するビタミンAの小さな親油性代謝物です。 RAの高濃度は、神経遺伝子の発現を促進し、EB形成の7,8の間中胚葉遺伝子発現を抑制する。 RAは、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ9により最終製品にレチンアルデヒド酸化、続いてのいずれかでアルコールまたはレチノールデヒドロゲナーゼによってレチンアルデヒドへの酸化ビタミンAによって製造されます。神経分化は、細胞質からRAの輸送を必要とします<html>セルラRA結合タンパク質2（CRABP2）によって核へ。核内で、RAは、RAR-RXRヘテロ二量体10からなるその同族受容体複合体に結合します。これは、転写コアクチベーターの動員、および転写9、11の開始をもたらします。さらに、RAは、このようにBMPとSMAD 12シグナル伝達拮抗、リン酸化（活性）SMAD1の分解を促進します。これらの活動に加えて、RAは、Pax6の発現、神経分化13を支持する転写因子を増加させます。 RAシグナリングはサーチュイン1（SIRT1）、核ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD +）により変調される- CRABP2を脱アセチル化依存性酵素、核へのトランスロケーションを妨害し、したがってRAは、RAR-RXRヘテロダイマー14,15に結合すると、 16。 e_contentは&quot;&gt;ここで説明するRA処理したEBのプロトコルを設計する際の我々の目標は、神経前駆細胞へのESCの分化を調節するシグナル伝達経路のin vitroでの解析を容易にするために、神経分化を最適化することである。このプロトコルの利点の一つの促進であります免疫蛍光法による細胞機能の分析。3DのEBが十分な抗体が貫通し、画像に困難であるれていない。EB解離2D単層に特定の時点で神経分化中には、共焦点顕微鏡による細胞の免疫標識及びイメージングを容易にします。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEFs</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>ESC feeder layer</td></tr><tr><td>ESC</td><td>EMD Millipore</td><td>CMTI-2</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (60 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Cell culture dish (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Hanging drops</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>2D EBs</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Eppendorf</td><td>30720113</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Dark 1.5 mL centrifuge tube</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229437</td><td>RA stock solution</td></tr><tr><td>Microscope cover-glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td>Circular, 12 mm diameter</td></tr><tr><td>Superfrost-plus microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>3D collagen culture kit</td><td>EMD Millipore</td><td>ECM675</td><td>3D culture</td></tr><tr><td>Effectene Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301427</td><td>Stem cell transfection</td></tr><tr><td>Microcon&amp;nbsp;Centrifugal Filters (10 kDa)</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCPRT010</td><td>Protein concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>MEFs culture</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>ESCs culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td>ESCs culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625</td><td>Dish coating</td></tr><tr><td>LIF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>8878-LF-025</td><td>To maintain ESC pluripotency</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solutions</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-PR</td><td>Lonza</td><td>VZA-2022</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Induction of neural differentiation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td>Blocking and antibody dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Cell membrane permeabilization</td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI</td><td>Life Tech.</td><td>P36931</td><td>Mounting reagent</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Cell fixation</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1030-FN</td><td>Dish coating</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington Biochem. Corp</td><td>LS004196</td><td>EB dissociation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin (Rat-401)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-33677</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-5279</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-398A</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Sox2</td><td>Cell Signaling</td><td>3579</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>Tubulin b3 (AA10)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-80016</td><td>Detection of neural differentiation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Secondary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse-Alexa555</td><td>Life Tech.</td><td>A31570</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-Alexa488&amp;nbsp;</td><td>Life Tech.</td><td>A21202</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide-field microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Cell culture imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td>Immunofluorescence imaging</td></tr></tbody></table>

analysis of retinoic acid-induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells in two and three-dimensional embryoid bodies

（典型的には、日E3.5で）胚盤胞の内部塊から単離されたマウス胚性幹細胞（ESC）は、初期胚発生を研究するためのin vitroモデル系として使用することができます。白血病抑制因子（LIF）の非存在下で、ESCの神経前駆細胞にデフォルトで分化します。彼らが原因初期段階の胚との類似性に球状凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれる3次元（3D）に集めことができます。 EBは、それらが2次元（2D）の拡張を成長させることによって展開ここで、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、またはそれらは球状体として成長し続けると、3つの胚葉に分化する3次元コラーゲンマトリックスに埋め込むことができる：内胚葉、中胚葉、および外胚葉。 3Dコラーゲン文化がより密接に、2DのEBより生体内環境を模倣します。 2D EB培養物は、分化を追跡するために、免疫蛍光法およびイムノブロッティングによる分析を容易にします。私たちは、二段階の神経differentiaを開発しましたションプロトコル。第1のステップでは、EBを、ハンギングドロップ法によって生成され、そして、同時に、レチノイン酸（RA）への曝露によって分化するように誘導されます。第二工程において、RAの非存在下での2Dまたは3D形式の神経分化が進行します。

OCT4、Nanogの、およびSOX2は、ESCの自己再生および多能性を付与するコア転写因子です。我々は、野生型からとSYX、RhoAの特異交換因子SYXをコードする遺伝子は、破壊された遺伝子改変マウスの株からESCの神経分化を比較するために上記のプロトコルを適用しました。我々は、血管新生18でSYXを関与していました。 ESCは、および場合SYXの神?...

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Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

analysis-retinoic-acid-induced-neural-differentiation-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.9K ビュー.  Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University. 我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。 

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

発生生物学

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

神経科学

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

ヒト胚性幹細胞からの3D神経網膜分化の促進

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

著者スポットライト:疾患モデリングのためのシンプルで効率的な神経網膜オルガノイド生産

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest in studying the mechanisms regulating cell fate decisions and plasticity. Originating in the dorsal neuroepithelium, this cell population is transient and relatively rare in the developing embryo - making functional tests, genomic screens, and biochemistry assays challenging to perform in vivo. To overcome these limitations, several methods have been developed to model CNCC development in vitro. Neurosphere (NS) based culturing methods provide a complex microenvironment that recapitulates the developing anterior neuroepithelium in 3D. These systems allow the growth of many NS in the same plate to generate a large amount of CNCC, but the produced NS present a high variability in shape, size, and number of CNCC formed - making quantitative assays difficult to perform. This protocol outlines a reproducible method for generating NS from mouse embryonic stem cells (mESC) in a 96-well format. NS generated in 96-well plates produce cranial neural crest cells (CNCC), which can be further cultured. By controlling the number of starting cells, this approach reduces variability in the size and shape between NS and increases reproducibility across experiments. Finally, this culture system is adaptable to several applications and offers a higher degree of flexibility, making it highly customizable and suitable for multiplexing experimental conditions.

We present a three-dimensional (3D) in vitro differentiation protocol generating neurospheres of reproducible size to produce cranial neural crest cells from mouse embryonic stem cells. We show that this methodology reduces variability compared to previous protocols and how it can be used for multiplexed assay to study cranial neural crest cell development.

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...

生物学

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

要約

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無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

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多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元の試験管外分化のプロトコル

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ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

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ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

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多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

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