Name: mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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GLP-1免疫アッセイはAddenbrooke病院におけるコア生化学アッセイ研究所によって行われました。 この作品は、長年にわたって、ウェルカムトラストによって支えられてきた（現在アクティブな助成金106262 / Z / 14 / Zおよび106263 / Z / 14 / Z）と医学研究評議会（MRC）（助成金MRC_MC_UU_12012 / 3およびMRC_MC_UU_12012 / 5）。

すべての動物の手順は、ケンブリッジ動物福祉の大学と倫理レビューボディによって承認され、（科学的処置）法1986年改正規則（SI 3039分の2012）を動物に適合しました。 予め1.準備<ol><li>解凍する氷の上基底膜マトリックスの一部（BMM）（〜200μL）を配置します。 注：BMMは、室温（RT）で凝固します。 </li><li>プレ暖かい50mLの無菌高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（添加なしで）及び〜10％ウシ胎児血清（FBSを補充した40mLの滅菌培地（高グルコースDMEM）、100 U / mLペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン（P / S）、および2mM L-グルタミン）37 O℃で水浴中で50mLの遠心管に</li><li>プレ冷却カルシウム及びマグネシウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> 15 mgのコラゲナーゼ（XI粗製）を秤量、50mLの遠心管に加え、氷上に保ちます。 <ol><lI&gt;注意：コラゲナーゼは有害です。これは、皮膚刺激（H315）と強い眼刺激（H319）を引き起こします。 （H334）吸入する場合には、アレルギー、喘息または、呼吸困難を引き起こす可能性があります。これは、呼吸器への刺激（H335）を引き起こす可能性があります。 、適切な個人保護具を使用するダスト形成を避け、ほこりの吸入を避けます。十分な換気を確認してください。 </li></ol></li></ol> 2.組織収集<ol><li> 50 mLの遠心分離管に〜20mLのL-15培地を追加し、氷の上に置きます。 </li><li>頸椎脱臼、またはその他の承認されたスケジュール1の方法により、マウスを安楽死させます。 注：腸組織は、通常C57BL6背景上のマウスから得られます。しかし、他の遺伝的背景はまた、129 / SvEv 15 例えば使用されています。イメージング実験は、 例えば GLU-金星1蛍光レポーターマウスを使用する必要があります。組織は、両性の成体マウス（2-6ヶ月）から取得されます。マウスはindividua内に収容されています水と通常の飼料に自由摂取アクセス LLY-換気ケージ。プロジェクトのライセンスでサポートされている場合は、腸内分泌細胞機能16に、例えば、高脂肪食の効果をテストするための実験を行うことができます。 </li><li>解剖穏やか鉗子と解剖ハサミを使用して（直腸開始する幽門から）マウスの腸を除去します。使用する準備ができるまで氷上にL-15培地中に保管してください。 </li></ol> 3.組織調製<ol><li>組織をカバーするのに十分なPBSを含有する10cmのペトリ皿に腸組織を置きます。 （幽門から遠位例えば上部小腸、上位10 cmの）所望の組織10センチ取ります。 </li><li> プラスチック製パスツールピペット、冷却PBSを用いて腸内容物を洗い流します。 <ol><li>微妙グリップ、腸のセグメントの一端を鉗子を使用して、そこにパスツールピペットの先端を配置します。冷却PBSとの内容をフラッシュします。魔女になるまで両端から繰り返し内容のrityが出てフラッシュされています。新鮮なチルドPBSを含む清潔なペトリ皿に移します。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、同時に筋層をやってのけるないように注意しながら、脂肪組織および腸間膜を削除します。 </li><li> ピール筋肉が細かい鉗子の2セットを使用して解剖顕微鏡下で、「靴下のように」オフ層。 注：この手順は必須ではないが、強くお勧めします。ここで説明したものに、筋層を除去する別の方法があります。例えば、腸前筋層の除去に、長手方向に第一切開することができます。 <ol><li>筋肉の可視フラップが存在する組織のより近位端に開始点を見つけます。静かに腸の周りのすべての道筋層の少量を引き離します。 注：筋層または腸上皮の引き裂きを回避するために、より大きな表面積をクランプするのではなく、Tを使用して張力を減少させます細かい鉗子のIPS。 </li><li>引き離すと腸の周りの筋肉層を剥離開始優しく、腸をクランプし、可能な限り筋肉フラップの同じくらい。筋層と上皮の両方を引き裂く回避するために、一緒に閉じそれらを保つために鉗子の位置を再調整キープ。このようにして、腸のセグメント及び廃棄の全体の長さから筋肉層を除去します。 </li></ol></li><li>縦方向に開いた腸を切断し、新鮮な冷蔵PBSで清潔なペトリ皿に旋回することによって洗浄します。必要に応じて、残りの消化粥や粘液を取り除くために繰り返します。 </li><li> 〜1〜2ミリメートル2の正方形を達成し、〜20 mLにこれらを追加するために外科用メスの刃でミンチ組織をパスツールピペットを用いて50mLの遠心管中でPBSを冷却しました。ピペットに付着組織片を回避するために、先端部を切断し、PBSを用いて粉砕することによりピペットを濡らします。 </li><li>静かに、さらに組織片を洗浄するためにチューブを振ります。組織が落ち着くと注ぐことを許可またはpPBSの大部分をオフipetteし、PBSが明確に見えるまで、新鮮なPBSで繰り返します。 </li></ol> BBMコートプレート/皿、消化中の4の調製 注：以下の手順は、（37℃の水浴中でインキュベーション工程を有する）組織培養フード内で行われるべきです。 <ol><li> （無添加で）冷却されたDMEM中2％BMM溶液を調製します。仕事をしながら、氷の上で解決策を維持します。 2％溶液のために、140μLを加える7 mLのDMEM（単一の24ウェルプレートを調製するのに十分）にBMMを解凍しました。 <ol><li> 250μLの2％BMMウェルあたり溶液（24ウェルプレート）またはガラスボトム撮像皿当たり加えます。 </li><li> BMMの十分な重合を可能にするために37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間コーティングしたプレート/皿をインキュベートします。 </li></ol></li><li> 0.3 mg / mlとの溶液を形成し、溶解させるために反転させる（ステップ1.2および1.4からの）15 mgのコラゲナーゼに（無添加で）50mLの予め温めておいたDMEMを加えます。 <ol><li>にCEは、完全に新しい無菌50mL遠心管に0.2μmの無菌フィルターを通してコラゲナーゼ溶液を濾過、20mlの注射器を使用して、溶解しました。消化媒体として、このラベルを付けます。 </li></ol></li></ol> 5.組織消化<ol><li> 10mLの血清学的ピペットを用いてPBSから組織片を除去し、（無添加で）冷蔵滅菌DMEMを含有する無菌の50mLの遠心管に追加し、旋回した後、DMEMを除去します。 注：組織との接触前にDME​​Mで粉砕して、それを濡らし、血清ピペットに付着した組織を避けるために。 </li><li> 「ダイジェスト」1と2：細胞破片の除去および単一細胞 <ol><li>組織片に7 mLの消化培地を追加し、チューブにスワールを与えます。 </li><li> 37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 </li><li>優しく（旋回ない）〜3秒のためのチューブを振ります。 </li><li>予約、組織を消化培地を解決し、破棄することを許可します顕微鏡で見て、小容量。 注：始めたときに特に、非常に消化プロセスの進捗状況を測定するために顕微鏡下で各「ダイジェスト」（〜30μL）の少量を検査することが推奨されます。多くの陰窩は、この段階で観察されている場合は、振とうしながらも活発かもしれません。異なる「ダイジェスト」のステージは、一般的にどのように見えるかの代表的な画像については、 図1を参照してください。 </li><li> （新鮮な消化培地で）ステップ5.2.-5.2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li> 「ダイジェスト」3〜5：暗号断片のコレクション <ol><li>組織に7 mLの消化培地を追加します。 </li><li> 37℃で10分間インキュベートします。 <ol><li>インキュベーションの間、10〜12秒ごとに5分を振ります。 注：に振盪は「ダイジェスト」1と2振とうよりも活発です。 </li></ol></li><li>未消化組織は15mLの遠心分離管に消化培地を解決し、収集することを可能にします。もし組織が誤って媒体と共に、それは、沈降10mLの血清学的ピペットを使用して除去し、未消化組織を含む50mLの遠心分離管に戻ってそれを転送することを可能に収集されます。 </li><li>遠心分離は、100×gで3分間RTで培地/上清を収集しました。 </li><li>上清を捨て、穏やかな粉砕及び取り分けによって5mLの予め温めた培地に細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>顕微鏡下での細胞懸濁液の少量を検査する（ステップ5.2.4からの注を参照）。 注：理想的には、暗号の断片は「ダイジェスト」3細胞の破片や単一細胞と一緒に表示されるように始めます。 「ダイジェスト」4及び5は、低減細胞破片と陰窩フラグメントの有意に大きな数を含む（ 図1）。組織が消化されていないと暗号フラグメントが表示されない場合は、より積極的に振るすなわち 、必要に応じて強度を振って調整します。 </li><li>手順を繰り返し5.3.1-5.3.6 5まで、「ダイジェスト」はされています完了または組織の大部分が消化されるまで（6 番目のダイジェストが必要とされ得ます）。 </li><li>一度「ダイジェスト」3-5（又は3-6）収集された、遠心機から全ての上清を100×gで3分間RTで上清を消化します。 </li><li>分泌実験のために、遠心分離の前に「ダイジェスト」3-5（または3-6）からの上清を兼ね備えています。 注：あまり組織をイメージング実験のために必要とされ、したがって、暗号フラグメントの数が多いクリーン（細胞デブリと単一細胞の非存在下）でダイジェスト上清を選択してください。これは典型的には4または5「ダイジェスト」。 </li><li>上清を捨て、穏やかない塊が見えなくなるまで粉砕することによりペレットを再懸濁。再懸濁10μMのY-27632二塩酸塩を補充予め温めた培地にペレットを（アノイキス17を防ぐため）。イメージング実験のために分泌実験のために5 mLおよび2mLの培地を使用します。 </li><li>フィルタ100-μmのフィルターを通して細胞懸濁液（任意の未消化組織を除去するため）。 （：それぞれ、分泌および画像化のために7 mLおよび4mLの総容量）を洗浄するためのフィルターを通して予め温めた培地のさらなる2mLの実行。 注：フィルタリングは必須ではないが、しかし、より大きな組織片は、プレート/皿に付着しない傾向があります。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> 図1：プライマリ小腸培養法から「ダイジェスト」の代表的な画像。 「ダイジェスト」1および2は、主に単一の細胞および細胞残屑を含むから、（A）は、典型的な材料。 （B）黒矢印3.「ダイジェスト」から製品の例は、ダイジェスト材料に現れる陰窩の断片を示します。 「ダイジェスト」4または5パネル（D）の代表的な（C）は、から材料を消化プール表します「ダイジェスト」3-5（C）に見られる大きな望ましくない組織片を除去するために100μmのフィルターに通しました。すべての画像は20X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー=100μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 前記メッキ腸培養（陰窩細胞について富化） <ol><li>プレートまたは皿から過剰BMM溶液を除去し、ウェル分泌あたり250μLの予め温めた培地を加えます。 注：イメージング料理はとても迅速に次のステップに進んで乾燥から皿を防止するために、媒体なしで残されます。 </li><li> プレート250μLの細胞懸濁液をウェルあたり（24ウェルプレート）またはガラスボトムディッシュあたり。 <ol><li>プレート滴下遅い「ジグザグ」を運動でも越え。暗号フラグメントが目にプレートを移動する前に〜5分間沈降することを許可します電子インキュベーター。 注：これはウェル内陰窩/細胞の均一な分布を奨励すべきです。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩プレート又は皿をインキュベートし、5％CO 2。 注：「まだら」単層が形成されている必要があります。 3回の洗浄の後に培養物の代表的な画像のために、 図2Aを参照。 </li><li>皿当たり2mLの予め温めた培地と「洪水」撮像料理。 注：これらの料理は、メッキ以下まで〜72時間イメージングのために適しているであろう。結腸培養は、通常、7日までに、長く続きます。付着しなかった細胞は洗浄工程によって除去することができます。初代培養は、今の実験のために使用される準備ができています。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

このプロトコルは、消化管ペプチドの分泌および標識腸内分泌細胞の単一細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ小腸の細胞の単離および培養を記載しています。 小腸培養は成功している可能性を高めるためには、プロトコルが可能なように（理想的には、組織採取の3時間以内）と組織を前氷冷培地または緩衝液中で維持されるよう迅速に行われることが重要です消化プロセスに、細胞死を制限します。それは、特に結腸の文化のために、必須ではないが、小腸からの筋層の除去が強く推奨されます。小腸培養プロトコルは、可能な限り標準化されています。しかし、消化プロセスが同一ではないことに注意することが重要です。変動は、筋肉の除去の程度EG日常的に導入することができるこのプロトコル中の多くのステップは、トンの大きさがあります彼は、揺れの強さ、コラゲナーゼなどの特定のバッチの効力を組織片「を刻みました」。これは、異なる各々のアリコートを検査するために最も重要である。したがって、それに応じて消化プロセスの進捗及びテーラー振盪及び「ダイジェスト」の数を評価するために顕微鏡下で「消化します」。暗号フラグメントは、より積極的に揺れを開始し、3年以降「ダイジェスト」から明らかでない場合は、で始まるとするより優しく振ることをお勧めします。 私たちの経験から、腸内分泌細胞は、培養中で増殖しないと、通常は4日以内に小腸培養物から失われています。それにもかかわらず、これは、生理的刺激及び/又は薬剤を試験するために（典型的には2時間、18〜24時間後にメッキにわたって行わ）十分な時間が腸ペプチド分泌実験を行うことを可能にします。分泌実験前に一晩のインキュベーションを必要とする実験も実現可能であるなど百日咳毒素15による前処理の場合です。 ここで紹介する初代培養技術は、それが年間で生産している研究成果の量によって証明されるように、十分に確立された方法です。初代培養モデルは、多様な栄養素および非栄養14、20回の刺激および阻害剤に応答して、GLP-1、GIP 18およびPYY 19を含む腸ペプチドの種々の分泌を研究するために使用されてきました。また、同じ技術は、正常ヒト腸細胞21の培養に適用されています。多くの場合、追加の実験モデルなどとともに初代細胞培養法の組み合わせ。 エキソビボまたはインビボにおいては、ほとんどの洞察6を提供することができます。特に他の方法とは対照的に、この技術は、IMを持っています腸ペプチド放出の測定を超えportantアプリケーション。我々は、トランスジェニックレポーターマウス由来の初代小腸培養は、例えば、それぞれのCa 2+およびcAMPセンサー、GCaMP3 11、13及びEpac2camps 14を用いて、消化管ペプチドの分泌に結合された細胞内シグナル伝達経路の問い合わせのための強力なツールであることを実証していますだけでなく、電気生理学的手法12。 全てのin vitroモデルと同様に、一次腸の培養物は、培養中の上皮細胞の極性の喪失、ならびに血液供給と神経支配の喪失を含む特定の固有の限界を有しています。腸内分泌細胞機能に対するこれらの人工的な条件の潜在的な影響を推定することは困難です。しかし、初代培養から得られたデータは、多くの場合、in vivoで settiに翻訳可能となっていますNG（GLP-1分泌15の短鎖脂肪酸の例効果）。 主な腸の培養は、多くの潜在的な用途で汎用性の高い技術です。彼らはすでに腸ペプチド分泌の調節に重要なメカニズムの洞察を提供しています。

この方法の全体的な目標は、腸ペプチド分泌と腸内分泌細胞の生細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ腸細胞を分離し、文化です。この手順の初期のバージョンは、もともとライマンらによって2008年に出版されました。 1、以来、私たちのグループからさらに20本の出版物の基礎を形成しています。この原稿のために、我々は、彼らが結腸の文化よりも確立するより挑戦しているよう小腸の文化に焦点を当てることにしました。 腸内分泌細胞は、グルコース依存性ペプチド（GIP）、コレシストキニン（CCK）およびペプチドYY（PYY）2インスリン分泌、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）を含めた腸ペプチドの配列を分泌します。これらの消化管ペプチドは、腸の輸送の遅延として食後応答を組織にグルコース刺激インスリン放出および満腹感の誘導の増強を重要な生理的役割を果たしています。 GLP-1模倣物ANDその分解を阻害する薬物は、現在、2型糖尿病の治療のために認可されており、このペプチド3の内因性の分泌を刺激する治療的可能性の継続的な評価があります。腸内分泌生理学のより良い理解及び分泌が刺激または阻害されるかれるメカニズムは、非常に重要で、従って、です。 ペプチドの分泌は、インビトロおよびエクスビボ実験モデル、利点と欠点を有するそれぞれのさまざまな方法を使って研究することができる腸（また、in vivoモデルの使用をカバーする包括的な最近の総説についてはSvendsen ら 4を参照）。そのような単離された灌流腸5とウッシングチャンバ6としてエクスビボ技術は、現在、種々の物質に応答して腸ペプチド分泌を探索するために使用されています。これらのメソッドの主な利点として、初代培養物と比較して、腸内分泌細胞の直接の環境はほとんど無傷のままで、重要なのは、細胞の極性が保存されていることです。したがって、分泌6に作用される細胞表面に関する情報を引き出すことが可能です。しかし、これらは一般的に、低スループット技術であり、それらから得られたデータの品質は必然的に時間をかけて低下し、腸組織の完全性と実行可能性に大きく依存しています。 腸オルガノイドは今、ますます腸内分泌細胞機能と開発7の研究のためのin vitroモデルとして使用されています。マウスおよびヒト組織の両方に由来することができるオルガノイドは、培養中の細胞極性を維持3D「陰窩様」構造を形成するという利点を有します。しかしながら、オルガノイド由来の腸内分泌細胞は、まだ完全には特徴付けされなければならないとネイティブLのCELに対するそれらの類似性LSはほとんど不明のまま。初代培養物は、腸内分泌細胞は長期間にわたって人工条件下で維持し、分化していないとして、ステップ近い生理学的設定にあるという利点を有します。 腸ペプチド分泌の評価のために使用されてきた別の初代培養方法は、胎児ラットの腸細胞（FRICs）8の単離であります。しかし、成人の腸組織の文化はあまり成功していると、いくつかの違いがFRICs 対大人のマウスの腸細胞（ 例えば 、グルコース8）の応答で観察されています。 腸内分泌様細胞株（ 例えば GLUTag、STC-1およびNCI-H716）は、伝統的に対直接区別するために使用されています。間接的な影響腸内分泌細胞上および分泌に刺激を結合根底にある分子メカニズムを分析します。 Kuhre らを参照してください</em&gt;。 「Lセル状」不死化細胞株によるペプチド産生および分泌のための9。消化管に沿って点在腸内分泌細胞は、腸管上皮細胞10と分類された細胞のすぐ下に1％を占めているので、これは私たちの手の中に、文化1で生存しない、必要がありました。細胞株は、彼らがそのような遺伝子サイレンシングなどの遺伝子操作を助長している、主に均一な細胞集団であるという事実のために便利なツール残ります。したがって、トランスジェニックマウスが利用できない場合、薬理学的に標的にすることができないタンパク質の役割を調査することは容易です。しかし、細胞株は、常にプライマリ細胞の有効なモデルではありません。多くの類似点がありますが、初代培養からの調査結果は、機会に例えば （例えば、GLUTag細胞と比較して主L細胞内の特定の栄養素によって活性化されるシグナル伝達経路の違いを強調している。ペプトン&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 11）。決定的に、トランスジェニック蛍光レポーターマウスと組み合わせて、初代培養モデルは、細胞内レベルで個々の一次腸内分泌細胞の詳細な検査を可能にします。初代培養物内蛍光標識L細胞は1、12件の研究、および単一細胞カルシウム11、13及びサイクリックアデノシン一リン酸-FRETイメージング腸内分泌の分野における重要な進歩をもたらしてきた14件の研究を、クランプパッチのための私達のグループによって使用されています生理。 以下のプロトコルは、24ウェルプレートを用いて、分泌実験を行うために最適化された、または単一成体マウスからの小腸の10cmの部分から最大16枚の撮像皿の調製のためのものです。プロトコルは、簡単に消化時間を増加させることにより結腸細胞の研究や共同のために変更することができますllagenase濃度。

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>For secretion experiments</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>For tissue preperation/digestion</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL, sterile</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430828</td><td>For tissue preperation/ digestion</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>For making up digestion medium</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>DMEM High glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>For dissolving matrigel (keep at 4 &amp;deg;C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Forceps/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>High precision tweezer (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>For removing muscle layer</td></tr><tr><td>High resolution digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>For collecting tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td></tr><tr><td>MetaFluor&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescence ratio imaging software</td></tr><tr><td>Mice (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td></tr><tr><td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>For calcium imaging and secretion experiments</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>For photomicrographs of cultures</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>For washing tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;amp; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>For dicing tissue</td></tr><tr><td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Xenon arc lamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)</td></tr></tbody></table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

腸は、消化管上皮の長さに沿って配置ホルモン分泌腸内分泌細胞と体の最大の内分泌器官です。それらの生理学的重要性にもかかわらず、腸内分泌細胞は、上皮細胞集団のごく一部を表しており、過去には、その特性は、細胞株モデルへの依存度が得られ、かなりの挑戦を提示しています。ここで、我々は、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養のための詳細なプロトコルを提供します。これらの一次培養物を栄養および神経ペプチドの数、ならびに薬理学的薬剤に応答して腸ペプチド分泌の刺激および阻害の根底にあるシグナル伝達経路を同定するために使用されてきました。さらに、トランスジェニック蛍光レポーターマウスの使用との組み合わせで、我々はこれらの初代培養物が中に蛍光タグ付き腸内分泌細胞の検査のための強力なツールとなっていることを証明しましたそのようなパッチクランプ及び単一細胞カルシウムおよびcAMP-FRETイメージングなどの方法を用いてtracellularレベル、。

シリアル消化工程の使用は、暗号フラグメントの比較的きれいな準備のコレクションは実験のためにメッキすることができます。最初の2回のダイジェストが消化物質（ 図1A）から主に単一の細胞および細胞残屑を除去します。第三の消化中、陰窩断片を消化物質（ 図1B）に表示されます。少数の単一細胞（ 図1C）と、図4及び図5収量陰窩断片のより多くを消化します。消化物3-5からプールした物質を濾過して清浄な陰窩断片調製物（ 図1D）を製造、培養に有害であり得る、未消化組織のより大きな部分を除去します。 培養の18〜24時間後に、一次小腸細胞の単層を（ 図2A）が観察されます。具体的には、CALを発現するトランスジェニックマウスから生成された培養物を用いてcium蛍光センサー、GCaMP3は、プログルカゴンプロモーター11の制御下で、L細胞を容易に同定および培養（ 図2B）内に散在しています。プライマリ小腸培養物において、化合物は、G、Q -Caを標的2+ IおよびcAMP iは経路がGLP-1の分泌を刺激依存性（分泌実験方法のためライマンら 。1参照）。ボンベシン（BBS、100 nm）を、フォルスコリンの同時適用及び3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMそれぞれは）、のGLP-1放出に対する刺激を2-および11倍誘発さ基礎であった（ 図2C）。 GCaMP3の特定L細胞発現は、識別及び個々のL細胞内カルシウム動員のリアルタイムモニタリングを可能にします。 100nMのボンベシン（BBS）及び30 mMの塩化カリウム（KClの）の両方が知られているG qの指標細胞内カルシウムの一過性増加を刺激しました&lt;/サブ&gt; -一次L細胞（ 図2D）における起電結合経路。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> 図2：一次小腸培養物に由来する代表的なデータ。 （A）分泌および（B）イメージング実験のために使用される混合プライマリ小腸培養物の例画像は24時間めっきを投稿します。 （A）画像は、4X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて、24ウェルプレートから採取しました。スケールバー= 500μmで。 GLU-Creを使用（B）は ROSA26 GCamP3マウスをX、視野内のL細胞（緑色細胞）GCaMP3の蛍光により同定しました。スケールバーは50μmで表しています。 （C）GLP-1分泌は（BBS、100 nm）を、フォルスコリン/ 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMずつ）をボンベシンに応答して測定されました。パーセンテージGLP-1分泌を算出しました上清および細胞溶解物中のGLP-1レベルを測定することによって。データは、各条件についてN = 3の平均±SEMを表します。 （D）（B）に概説2つのセルのGCaMP3蛍光（細胞質カルシウムを反映する）は、塩化カリウム（KClを、30mMの）とBBS（100nMで）に応答してリアルタイムで監視します。単一細胞イメージングは​​、40X油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて行きました。 GCaMP3 75 Wキセノンアークランプ、蛍光イメージングソフトウェアによって制御されるモノクロメーターを使用して、10分の475のnmで励起しました。発光は、ダイクロイックミラーと、510から560 nmの帯域フィルタを用いた高解像度デジタル電荷結合素子（CCD）カメラで記録しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.4K ビュー.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge. このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。 

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Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

生物工学

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

医学

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

免疫・感染学

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

免震を用いた消化管ホルモン分泌のメカニズム潅流ラット小腸

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

生物学

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...