GLP-1免疫アッセイはAddenbrooke病院におけるコア生化学アッセイ研究所によって行われました。 この作品は、長年にわたって、ウェルカムトラストによって支えられてきた（現在アクティブな助成金106262 / Z / 14 / Zおよび106263 / Z / 14 / Z）と医学研究評議会（MRC）（助成金MRC_MC_UU_12012 / 3およびMRC_MC_UU_12012 / 5）。

すべての動物の手順は、ケンブリッジ動物福祉の大学と倫理レビューボディによって承認され、（科学的処置）法1986年改正規則（SI 3039分の2012）を動物に適合しました。 予め1.準備<ol><li>解凍する氷の上基底膜マトリックスの一部（BMM）（〜200μL）を配置します。 注：BMMは、室温（RT）で凝固します。 </li><li>プレ暖かい50mLの無菌高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（添加なしで）及び〜10％ウシ胎児血清（FBSを補充した40mLの滅菌培地（高グルコースDMEM）、100 U / mLペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン（P / S）、および2mM L-グルタミン）37 O℃で水浴中で50mLの遠心管に</li><li>プレ冷却カルシウム及びマグネシウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> 15 mgのコラゲナーゼ（XI粗製）を秤量、50mLの遠心管に加え、氷上に保ちます。 <ol><lI&gt;注意：コラゲナーゼは有害です。これは、皮膚刺激（H315）と強い眼刺激（H319）を引き起こします。 （H334）吸入する場合には、アレルギー、喘息または、呼吸困難を引き起こす可能性があります。これは、呼吸器への刺激（H335）を引き起こす可能性があります。 、適切な個人保護具を使用するダスト形成を避け、ほこりの吸入を避けます。十分な換気を確認してください。 </li></ol></li></ol> 2.組織収集<ol><li> 50 mLの遠心分離管に〜20mLのL-15培地を追加し、氷の上に置きます。 </li><li>頸椎脱臼、またはその他の承認されたスケジュール1の方法により、マウスを安楽死させます。 注：腸組織は、通常C57BL6背景上のマウスから得られます。しかし、他の遺伝的背景はまた、129 / SvEv 15 例えば使用されています。イメージング実験は、 例えば GLU-金星1蛍光レポーターマウスを使用する必要があります。組織は、両性の成体マウス（2-6ヶ月）から取得されます。マウスはindividua内に収容されています水と通常の飼料に自由摂取アクセス LLY-換気ケージ。プロジェクトのライセンスでサポートされている場合は、腸内分泌細胞機能16に、例えば、高脂肪食の効果をテストするための実験を行うことができます。 </li><li>解剖穏やか鉗子と解剖ハサミを使用して（直腸開始する幽門から）マウスの腸を除去します。使用する準備ができるまで氷上にL-15培地中に保管してください。 </li></ol> 3.組織調製<ol><li>組織をカバーするのに十分なPBSを含有する10cmのペトリ皿に腸組織を置きます。 （幽門から遠位例えば上部小腸、上位10 cmの）所望の組織10センチ取ります。 </li><li> プラスチック製パスツールピペット、冷却PBSを用いて腸内容物を洗い流します。 <ol><li>微妙グリップ、腸のセグメントの一端を鉗子を使用して、そこにパスツールピペットの先端を配置します。冷却PBSとの内容をフラッシュします。魔女になるまで両端から繰り返し内容のrityが出てフラッシュされています。新鮮なチルドPBSを含む清潔なペトリ皿に移します。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、同時に筋層をやってのけるないように注意しながら、脂肪組織および腸間膜を削除します。 </li><li> ピール筋肉が細かい鉗子の2セットを使用して解剖顕微鏡下で、「靴下のように」オフ層。 注：この手順は必須ではないが、強くお勧めします。ここで説明したものに、筋層を除去する別の方法があります。例えば、腸前筋層の除去に、長手方向に第一切開することができます。 <ol><li>筋肉の可視フラップが存在する組織のより近位端に開始点を見つけます。静かに腸の周りのすべての道筋層の少量を引き離します。 注：筋層または腸上皮の引き裂きを回避するために、より大きな表面積をクランプするのではなく、Tを使用して張力を減少させます細かい鉗子のIPS。 </li><li>引き離すと腸の周りの筋肉層を剥離開始優しく、腸をクランプし、可能な限り筋肉フラップの同じくらい。筋層と上皮の両方を引き裂く回避するために、一緒に閉じそれらを保つために鉗子の位置を再調整キープ。このようにして、腸のセグメント及び廃棄の全体の長さから筋肉層を除去します。 </li></ol></li><li>縦方向に開いた腸を切断し、新鮮な冷蔵PBSで清潔なペトリ皿に旋回することによって洗浄します。必要に応じて、残りの消化粥や粘液を取り除くために繰り返します。 </li><li> 〜1〜2ミリメートル2の正方形を達成し、〜20 mLにこれらを追加するために外科用メスの刃でミンチ組織をパスツールピペットを用いて50mLの遠心管中でPBSを冷却しました。ピペットに付着組織片を回避するために、先端部を切断し、PBSを用いて粉砕することによりピペットを濡らします。 </li><li>静かに、さらに組織片を洗浄するためにチューブを振ります。組織が落ち着くと注ぐことを許可またはpPBSの大部分をオフipetteし、PBSが明確に見えるまで、新鮮なPBSで繰り返します。 </li></ol> BBMコートプレート/皿、消化中の4の調製 注：以下の手順は、（37℃の水浴中でインキュベーション工程を有する）組織培養フード内で行われるべきです。 <ol><li> （無添加で）冷却されたDMEM中2％BMM溶液を調製します。仕事をしながら、氷の上で解決策を維持します。 2％溶液のために、140μLを加える7 mLのDMEM（単一の24ウェルプレートを調製するのに十分）にBMMを解凍しました。 <ol><li> 250μLの2％BMMウェルあたり溶液（24ウェルプレート）またはガラスボトム撮像皿当たり加えます。 </li><li> BMMの十分な重合を可能にするために37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間コーティングしたプレート/皿をインキュベートします。 </li></ol></li><li> 0.3 mg / mlとの溶液を形成し、溶解させるために反転させる（ステップ1.2および1.4からの）15 mgのコラゲナーゼに（無添加で）50mLの予め温めておいたDMEMを加えます。 <ol><li>にCEは、完全に新しい無菌50mL遠心管に0.2μmの無菌フィルターを通してコラゲナーゼ溶液を濾過、20mlの注射器を使用して、溶解しました。消化媒体として、このラベルを付けます。 </li></ol></li></ol> 5.組織消化<ol><li> 10mLの血清学的ピペットを用いてPBSから組織片を除去し、（無添加で）冷蔵滅菌DMEMを含有する無菌の50mLの遠心管に追加し、旋回した後、DMEMを除去します。 注：組織との接触前にDME​​Mで粉砕して、それを濡らし、血清ピペットに付着した組織を避けるために。 </li><li> 「ダイジェスト」1と2：細胞破片の除去および単一細胞 <ol><li>組織片に7 mLの消化培地を追加し、チューブにスワールを与えます。 </li><li> 37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 </li><li>優しく（旋回ない）〜3秒のためのチューブを振ります。 </li><li>予約、組織を消化培地を解決し、破棄することを許可します顕微鏡で見て、小容量。 注：始めたときに特に、非常に消化プロセスの進捗状況を測定するために顕微鏡下で各「ダイジェスト」（〜30μL）の少量を検査することが推奨されます。多くの陰窩は、この段階で観察されている場合は、振とうしながらも活発かもしれません。異なる「ダイジェスト」のステージは、一般的にどのように見えるかの代表的な画像については、 図1を参照してください。 </li><li> （新鮮な消化培地で）ステップ5.2.-5.2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li> 「ダイジェスト」3〜5：暗号断片のコレクション <ol><li>組織に7 mLの消化培地を追加します。 </li><li> 37℃で10分間インキュベートします。 <ol><li>インキュベーションの間、10〜12秒ごとに5分を振ります。 注：に振盪は「ダイジェスト」1と2振とうよりも活発です。 </li></ol></li><li>未消化組織は15mLの遠心分離管に消化培地を解決し、収集することを可能にします。もし組織が誤って媒体と共に、それは、沈降10mLの血清学的ピペットを使用して除去し、未消化組織を含む50mLの遠心分離管に戻ってそれを転送することを可能に収集されます。 </li><li>遠心分離は、100×gで3分間RTで培地/上清を収集しました。 </li><li>上清を捨て、穏やかな粉砕及び取り分けによって5mLの予め温めた培地に細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>顕微鏡下での細胞懸濁液の少量を検査する（ステップ5.2.4からの注を参照）。 注：理想的には、暗号の断片は「ダイジェスト」3細胞の破片や単一細胞と一緒に表示されるように始めます。 「ダイジェスト」4及び5は、低減細胞破片と陰窩フラグメントの有意に大きな数を含む（ 図1）。組織が消化されていないと暗号フラグメントが表示されない場合は、より積極的に振るすなわち 、必要に応じて強度を振って調整します。 </li><li>手順を繰り返し5.3.1-5.3.6 5まで、「ダイジェスト」はされています完了または組織の大部分が消化されるまで（6 番目のダイジェストが必要とされ得ます）。 </li><li>一度「ダイジェスト」3-5（又は3-6）収集された、遠心機から全ての上清を100×gで3分間RTで上清を消化します。 </li><li>分泌実験のために、遠心分離の前に「ダイジェスト」3-5（または3-6）からの上清を兼ね備えています。 注：あまり組織をイメージング実験のために必要とされ、したがって、暗号フラグメントの数が多いクリーン（細胞デブリと単一細胞の非存在下）でダイジェスト上清を選択してください。これは典型的には4または5「ダイジェスト」。 </li><li>上清を捨て、穏やかない塊が見えなくなるまで粉砕することによりペレットを再懸濁。再懸濁10μMのY-27632二塩酸塩を補充予め温めた培地にペレットを（アノイキス17を防ぐため）。イメージング実験のために分泌実験のために5 mLおよび2mLの培地を使用します。 </li><li>フィルタ100-μmのフィルターを通して細胞懸濁液（任意の未消化組織を除去するため）。 （：それぞれ、分泌および画像化のために7 mLおよび4mLの総容量）を洗浄するためのフィルターを通して予め温めた培地のさらなる2mLの実行。 注：フィルタリングは必須ではないが、しかし、より大きな組織片は、プレート/皿に付着しない傾向があります。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> 図1：プライマリ小腸培養法から「ダイジェスト」の代表的な画像。 「ダイジェスト」1および2は、主に単一の細胞および細胞残屑を含むから、（A）は、典型的な材料。 （B）黒矢印3.「ダイジェスト」から製品の例は、ダイジェスト材料に現れる陰窩の断片を示します。 「ダイジェスト」4または5パネル（D）の代表的な（C）は、から材料を消化プール表します「ダイジェスト」3-5（C）に見られる大きな望ましくない組織片を除去するために100μmのフィルターに通しました。すべての画像は20X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー=100μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 前記メッキ腸培養（陰窩細胞について富化） <ol><li>プレートまたは皿から過剰BMM溶液を除去し、ウェル分泌あたり250μLの予め温めた培地を加えます。 注：イメージング料理はとても迅速に次のステップに進んで乾燥から皿を防止するために、媒体なしで残されます。 </li><li> プレート250μLの細胞懸濁液をウェルあたり（24ウェルプレート）またはガラスボトムディッシュあたり。 <ol><li>プレート滴下遅い「ジグザグ」を運動でも越え。暗号フラグメントが目にプレートを移動する前に〜5分間沈降することを許可します電子インキュベーター。 注：これはウェル内陰窩/細胞の均一な分布を奨励すべきです。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩プレート又は皿をインキュベートし、5％CO 2。 注：「まだら」単層が形成されている必要があります。 3回の洗浄の後に培養物の代表的な画像のために、 図2Aを参照。 </li><li>皿当たり2mLの予め温めた培地と「洪水」撮像料理。 注：これらの料理は、メッキ以下まで〜72時間イメージングのために適しているであろう。結腸培養は、通常、7日までに、長く続きます。付着しなかった細胞は洗浄工程によって除去することができます。初代培養は、今の実験のために使用される準備ができています。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

このプロトコルは、消化管ペプチドの分泌および標識腸内分泌細胞の単一細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ小腸の細胞の単離および培養を記載しています。 小腸培養は成功している可能性を高めるためには、プロトコルが可能なように（理想的には、組織採取の3時間以内）と組織を前氷冷培地または緩衝液中で維持されるよう迅速に行われることが重要です消化プロセスに、細胞死を制限します。それは、特に結腸の文化のために、必須ではないが、小腸からの筋層の除去が強く推奨されます。小腸培養プロトコルは、可能な限り標準化されています。しかし、消化プロセスが同一ではないことに注意することが重要です。変動は、筋肉の除去の程度EG日常的に導入することができるこのプロトコル中の多くのステップは、トンの大きさがあります彼は、揺れの強さ、コラゲナーゼなどの特定のバッチの効力を組織片「を刻みました」。これは、異なる各々のアリコートを検査するために最も重要である。したがって、それに応じて消化プロセスの進捗及びテーラー振盪及び「ダイジェスト」の数を評価するために顕微鏡下で「消化します」。暗号フラグメントは、より積極的に揺れを開始し、3年以降「ダイジェスト」から明らかでない場合は、で始まるとするより優しく振ることをお勧めします。 私たちの経験から、腸内分泌細胞は、培養中で増殖しないと、通常は4日以内に小腸培養物から失われています。それにもかかわらず、これは、生理的刺激及び/又は薬剤を試験するために（典型的には2時間、18〜24時間後にメッキにわたって行わ）十分な時間が腸ペプチド分泌実験を行うことを可能にします。分泌実験前に一晩のインキュベーションを必要とする実験も実現可能であるなど百日咳毒素15による前処理の場合です。 ここで紹介する初代培養技術は、それが年間で生産している研究成果の量によって証明されるように、十分に確立された方法です。初代培養モデルは、多様な栄養素および非栄養14、20回の刺激および阻害剤に応答して、GLP-1、GIP 18およびPYY 19を含む腸ペプチドの種々の分泌を研究するために使用されてきました。また、同じ技術は、正常ヒト腸細胞21の培養に適用されています。多くの場合、追加の実験モデルなどとともに初代細胞培養法の組み合わせ。 エキソビボまたはインビボにおいては、ほとんどの洞察6を提供することができます。特に他の方法とは対照的に、この技術は、IMを持っています腸ペプチド放出の測定を超えportantアプリケーション。我々は、トランスジェニックレポーターマウス由来の初代小腸培養は、例えば、それぞれのCa 2+およびcAMPセンサー、GCaMP3 11、13及びEpac2camps 14を用いて、消化管ペプチドの分泌に結合された細胞内シグナル伝達経路の問い合わせのための強力なツールであることを実証していますだけでなく、電気生理学的手法12。 全てのin vitroモデルと同様に、一次腸の培養物は、培養中の上皮細胞の極性の喪失、ならびに血液供給と神経支配の喪失を含む特定の固有の限界を有しています。腸内分泌細胞機能に対するこれらの人工的な条件の潜在的な影響を推定することは困難です。しかし、初代培養から得られたデータは、多くの場合、in vivoで settiに翻訳可能となっていますNG（GLP-1分泌15の短鎖脂肪酸の例効果）。 主な腸の培養は、多くの潜在的な用途で汎用性の高い技術です。彼らはすでに腸ペプチド分泌の調節に重要なメカニズムの洞察を提供しています。

この方法の全体的な目標は、腸ペプチド分泌と腸内分泌細胞の生細胞イメージングの研究を可能にするために、混合ネズミ腸細胞を分離し、文化です。この手順の初期のバージョンは、もともとライマンらによって2008年に出版されました。 1、以来、私たちのグループからさらに20本の出版物の基礎を形成しています。この原稿のために、我々は、彼らが結腸の文化よりも確立するより挑戦しているよう小腸の文化に焦点を当てることにしました。 腸内分泌細胞は、グルコース依存性ペプチド（GIP）、コレシストキニン（CCK）およびペプチドYY（PYY）2インスリン分泌、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）を含めた腸ペプチドの配列を分泌します。これらの消化管ペプチドは、腸の輸送の遅延として食後応答を組織にグルコース刺激インスリン放出および満腹感の誘導の増強を重要な生理的役割を果たしています。 GLP-1模倣物ANDその分解を阻害する薬物は、現在、2型糖尿病の治療のために認可されており、このペプチド3の内因性の分泌を刺激する治療的可能性の継続的な評価があります。腸内分泌生理学のより良い理解及び分泌が刺激または阻害されるかれるメカニズムは、非常に重要で、従って、です。 ペプチドの分泌は、インビトロおよびエクスビボ実験モデル、利点と欠点を有するそれぞれのさまざまな方法を使って研究することができる腸（また、in vivoモデルの使用をカバーする包括的な最近の総説についてはSvendsen ら 4を参照）。そのような単離された灌流腸5とウッシングチャンバ6としてエクスビボ技術は、現在、種々の物質に応答して腸ペプチド分泌を探索するために使用されています。これらのメソッドの主な利点として、初代培養物と比較して、腸内分泌細胞の直接の環境はほとんど無傷のままで、重要なのは、細胞の極性が保存されていることです。したがって、分泌6に作用される細胞表面に関する情報を引き出すことが可能です。しかし、これらは一般的に、低スループット技術であり、それらから得られたデータの品質は必然的に時間をかけて低下し、腸組織の完全性と実行可能性に大きく依存しています。 腸オルガノイドは今、ますます腸内分泌細胞機能と開発7の研究のためのin vitroモデルとして使用されています。マウスおよびヒト組織の両方に由来することができるオルガノイドは、培養中の細胞極性を維持3D「陰窩様」構造を形成するという利点を有します。しかしながら、オルガノイド由来の腸内分泌細胞は、まだ完全には特徴付けされなければならないとネイティブLのCELに対するそれらの類似性LSはほとんど不明のまま。初代培養物は、腸内分泌細胞は長期間にわたって人工条件下で維持し、分化していないとして、ステップ近い生理学的設定にあるという利点を有します。 腸ペプチド分泌の評価のために使用されてきた別の初代培養方法は、胎児ラットの腸細胞（FRICs）8の単離であります。しかし、成人の腸組織の文化はあまり成功していると、いくつかの違いがFRICs 対大人のマウスの腸細胞（ 例えば 、グルコース8）の応答で観察されています。 腸内分泌様細胞株（ 例えば GLUTag、STC-1およびNCI-H716）は、伝統的に対直接区別するために使用されています。間接的な影響腸内分泌細胞上および分泌に刺激を結合根底にある分子メカニズムを分析します。 Kuhre らを参照してください</em&gt;。 「Lセル状」不死化細胞株によるペプチド産生および分泌のための9。消化管に沿って点在腸内分泌細胞は、腸管上皮細胞10と分類された細胞のすぐ下に1％を占めているので、これは私たちの手の中に、文化1で生存しない、必要がありました。細胞株は、彼らがそのような遺伝子サイレンシングなどの遺伝子操作を助長している、主に均一な細胞集団であるという事実のために便利なツール残ります。したがって、トランスジェニックマウスが利用できない場合、薬理学的に標的にすることができないタンパク質の役割を調査することは容易です。しかし、細胞株は、常にプライマリ細胞の有効なモデルではありません。多くの類似点がありますが、初代培養からの調査結果は、機会に例えば （例えば、GLUTag細胞と比較して主L細胞内の特定の栄養素によって活性化されるシグナル伝達経路の違いを強調している。ペプトン&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 11）。決定的に、トランスジェニック蛍光レポーターマウスと組み合わせて、初代培養モデルは、細胞内レベルで個々の一次腸内分泌細胞の詳細な検査を可能にします。初代培養物内蛍光標識L細胞は1、12件の研究、および単一細胞カルシウム11、13及びサイクリックアデノシン一リン酸-FRETイメージング腸内分泌の分野における重要な進歩をもたらしてきた14件の研究を、クランプパッチのための私達のグループによって使用されています生理。 以下のプロトコルは、24ウェルプレートを用いて、分泌実験を行うために最適化された、または単一成体マウスからの小腸の10cmの部分から最大16枚の撮像皿の調製のためのものです。プロトコルは、簡単に消化時間を増加させることにより結腸細胞の研究や共同のために変更することができますllagenase濃度。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>For secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bombesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4272</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 ml, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml, sterile</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430828</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI (Crude)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>For making up digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4500 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td>For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps/Tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT520</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td><a href="https://ufslive.admin.cam.ac.uk/OA_HTML/OA.jsp?OAFunc=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;OASF=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;reqHeaderId=%7B%21%21VHZooXq3GHQ6ng85h4o4sA%7D&amp;retainAM=Y&amp;addBreadCrumb=Y&amp;_ti=372495995&amp;oapc=18&amp;oas=dSLT2zPz7cgLm-ZkBP6Y6Q.." title="MatTek glass bottom dishes P35G-0-14-C">P35G-0-14-C</a></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision tweezer (110 mm)</td>
			<td>IDEAL-TEK</td>
			<td>3480641 (5 SA)</td>
			<td>For removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution digital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-ER</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td>For collecting tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaFluor&#160;</td>
			<td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence ratio imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL6)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>For calcium imaging and secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (EVOS XL Core)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>For photomicrographs of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4234</td>
			<td>For cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>For washing tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT554</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>0308</td>
			<td>For dicing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip</td>
			<td>BD</td>
			<td>300613</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp 75W</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

腸は、消化管上皮の長さに沿って配置ホルモン分泌腸内分泌細胞と体の最大の内分泌器官です。それらの生理学的重要性にもかかわらず、腸内分泌細胞は、上皮細胞集団のごく一部を表しており、過去には、その特性は、細胞株モデルへの依存度が得られ、かなりの挑戦を提示しています。ここで、我々は、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養のための詳細なプロトコルを提供します。これらの一次培養物を栄養および神経ペプチドの数、ならびに薬理学的薬剤に応答して腸ペプチド分泌の刺激および阻害の根底にあるシグナル伝達経路を同定するために使用されてきました。さらに、トランスジェニック蛍光レポーターマウスの使用との組み合わせで、我々はこれらの初代培養物が中に蛍光タグ付き腸内分泌細胞の検査のための強力なツールとなっていることを証明しましたそのようなパッチクランプ及び単一細胞カルシウムおよびcAMP-FRETイメージングなどの方法を用いてtracellularレベル、。

シリアル消化工程の使用は、暗号フラグメントの比較的きれいな準備のコレクションは実験のためにメッキすることができます。最初の2回のダイジェストが消化物質（ 図1A）から主に単一の細胞および細胞残屑を除去します。第三の消化中、陰窩断片を消化物質（ 図1B）に表示されます。少数の単一細胞（ 図1C）と、図4及び図5収量陰窩断片のより多くを消化します。消化物3-5からプールした物質を濾過して清浄な陰窩断片調製物（ 図1D）を製造、培養に有害であり得る、未消化組織のより大きな部分を除去します。 培養の18〜24時間後に、一次小腸細胞の単層を（ 図2A）が観察されます。具体的には、CALを発現するトランスジェニックマウスから生成された培養物を用いてcium蛍光センサー、GCaMP3は、プログルカゴンプロモーター11の制御下で、L細胞を容易に同定および培養（ 図2B）内に散在しています。プライマリ小腸培養物において、化合物は、G、Q -Caを標的2+ IおよびcAMP iは経路がGLP-1の分泌を刺激依存性（分泌実験方法のためライマンら 。1参照）。ボンベシン（BBS、100 nm）を、フォルスコリンの同時適用及び3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMそれぞれは）、のGLP-1放出に対する刺激を2-および11倍誘発さ基礎であった（ 図2C）。 GCaMP3の特定L細胞発現は、識別及び個々のL細胞内カルシウム動員のリアルタイムモニタリングを可能にします。 100nMのボンベシン（BBS）及び30 mMの塩化カリウム（KClの）の両方が知られているG qの指標細胞内カルシウムの一過性増加を刺激しました&lt;/サブ&gt; -一次L細胞（ 図2D）における起電結合経路。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> 図2：一次小腸培養物に由来する代表的なデータ。 （A）分泌および（B）イメージング実験のために使用される混合プライマリ小腸培養物の例画像は24時間めっきを投稿します。 （A）画像は、4X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて、24ウェルプレートから採取しました。スケールバー= 500μmで。 GLU-Creを使用（B）は ROSA26 GCamP3マウスをX、視野内のL細胞（緑色細胞）GCaMP3の蛍光により同定しました。スケールバーは50μmで表しています。 （C）GLP-1分泌は（BBS、100 nm）を、フォルスコリン/ 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）（F / I、10μMずつ）をボンベシンに応答して測定されました。パーセンテージGLP-1分泌を算出しました上清および細胞溶解物中のGLP-1レベルを測定することによって。データは、各条件についてN = 3の平均±SEMを表します。 （D）（B）に概説2つのセルのGCaMP3蛍光（細胞質カルシウムを反映する）は、塩化カリウム（KClを、30mMの）とBBS（100nMで）に応答してリアルタイムで監視します。単一細胞イメージングは​​、40X油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて行きました。 GCaMP3 75 Wキセノンアークランプ、蛍光イメージングソフトウェアによって制御されるモノクロメーターを使用して、10分の475のnmで励起しました。発光は、ダイクロイックミラーと、510から560 nmの帯域フィルタを用いた高解像度デジタル電荷結合素子（CCD）カメラで記録しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K ビュー.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge. このプロトコルは、混合、マウス小腸の細胞の単離および培養を記載しています。これらの一次腸の培養物は、多くの技術を使用して、腸ペプチド分泌の根底にあるシグナル伝達経路の研究を可能にします。 

ビデオ: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

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後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法

マウス胎児腸全体培養システム

ネズミ弁内皮細胞の単離

タンパク質の品質管理システムを学びます