Name: mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

GLP-1 immuno-deneyler Addenbrooke Hastanesi Çekirdek Biyokimyasal Deneyi Laboratory tarafından gerçekleştirildi. Bu çalışma, yıllar içinde, Wellcome Trust tarafından desteklenmiştir (şu anda aktif hibe 106.262 / Z / 14 / Z ve 106.263 / Z / 14 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) (hibe MRC_MC_UU_12012 / 3 ve MRC_MC_UU_12012 / 5).

Bütün hayvan prosedürleri Cambridge Hayvan Refahı Üniversitesi ve Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanan ve (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Değişiklik Yönetmelikleri (SI 2012/3039) Hayvanlar uymakta bulundu. Peşin 1. Hazırlık <ol><li> çözülmesi için buz üzerine taban membran matrisi bir kısım (BMM) (yaklaşık 200 uL) yerleştirin. Not: BMM oda sıcaklığında (RT) katılaşır. </li><li> Pre-sıcak 50 ml steril, yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) (herhangi bir ilave ile) ve ~% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS ile takviye edilmiş 40 mL steril kültür ortamı (yüksek glikoz DMEM), 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / mL streptomisin (P / S) ve 37 o C&#39;de bir su banyosu içinde 50 ml lik santrifüj tüpleri içinde, 2 mM L-glutamin) </li><li> Ön-soğutma, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS). </li><li> 15 mg kolajenaz (XI ham) tartın, bir 50 mL santrifüj tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun. <ol><li&gt; DİKKAT: kollajenaz zararlıdır. Bu deri tahrişi (H315) ve ciddi göz tahrişine (H319) neden olur. (H334) solunduğunda eğer alerji veya astım semptomları veya solunum zorluğuna neden olabilir. Solunum tahriş (H335) neden olabilir. , Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın toz oluşumunu önlemek ve toz nefes kaçının. Yeterli havalandırma sağlayınız. </li></ol></li></ol> 2. Doku Koleksiyonu <ol><li> 50 ml bir santrifüj tüpüne ~ 20 ml L-15 ortamı ilave edin ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> servikal dislokasyon veya diğer onaylanmış planı 1 yöntemi ile bir fare öldürülür. Not: intestinal doku tipik olarak bir C57BL6 arka farelerden elde edilir. Ancak, diğer genetik kökenden de 129 / SvEv 15 örn kullanılmıştır. Görüntüleme deneyleri örneğin flüoresan raportör farelerin kullanılması GLU-Venüs 1 gerektirir. Doku, her iki cinsiyetten yetişkin farelerin (2-6 ay) elde edilir. farenin individua yerleştirilmiştirSu ve düzenli mamasına erişimi olan kafesleri Lly havalandırılmış. Bir proje lisansı destekliyorsa Ancak deneyler enteroendokrin hücre fonksiyonu 16, örneğin, bir yüksek yağ diyetin etkisini test etmek yapılabilir. </li><li> Ayır ve yavaşça forseps ve diseksiyon makas kullanılarak (rektum başlatmak için pilordan) fare bağırsak çıkarın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde L-15 ortamında saklayın. </li></ol> 3. Doku Hazırlanması <ol><li> doku karşılamak için yeterli PBS içeren 10 cm&#39;lik bir petri tabağına intestinal doku yerleştirin. (Pilor distal örneğin, üst ince bağırsak, ilk 10 cm), arzu edilen doku içinde 10 cm al. </li><li> Plastik bir Pastör pipet ve soğutulmuş PBS kullanarak bağırsak içeriği çalkalayın. <ol><li> incelikle kavrama, bağırsak segmenti bir ucunu forseps kullanma ve içine bir Pasteur pipet ucu yerleştirin. Soğutulmuş PBS ile içindekileri dışarı yıkayın. majo kadar her iki ucundan da tekrarlayınİçindekiler rity dışarı atılır edilmiştir. taze soğutulmuş PBS içeren bir petri kutusuna aktarın. </li></ol></li><li> forseps kullanarak, aynı anda kas tabakası koparmak değil dikkat ederek adipoz doku ve mezenteri çıkarın. </li><li> Peel kas ince forseps iki set kullanılarak bir mikroskop altında &quot;bir çorap gibi&quot; kapalı katman. NOT: Bu adım gerekli değildir, ancak şiddetle tavsiye edilir. Burada anlatılan birine kas tabakasını kaldırarak alternatif yolları vardır. Örneğin, bağırsak önce kas tabakasının çıkarılması için, uzunlamasına birinci açık kesilebilir. <ol><li> kas görünür bir yakanın bulunduğu doku daha yakın uçta bir başlangıç ​​noktası bulun. Yavaşça bağırsak etrafında tüm yol kas tabakasının az miktarda uzağa çekin. Not: kas tabakası veya bağırsak epitel yırtılmasını önlemek için, daha büyük bir yüzey alanı sıkıştırma yerine t kullanarak germe kuvvetini azaltmakince forseps ips. </li><li> bağırsak ve mümkün olduğunca kas flep kadar kelepçe yavaşça birbirinden çekin ve bağırsak yerinden kas tabakası soyulması başlayın. kas tabakası ve epiteli hem yırtılmasını önlemek için onları birbirine yakın tutmak için forseps konumunu yeniden ayarlamayı tutun. Bu şekilde, bağırsak segmenti ve artıklar, tüm uzunluğu kas tabakası çıkarın. </li></ol></li><li> açık uzunlamasına bağırsak kesin ve taze soğutulmuş PBS ile temin bir petri kutusuna içinde dönen ile yıkayın. Gerekirse kalan chyme ya da mukus kaldırmak için tekrarlayın. </li><li> Cerrahi bir bıçak yardımı ile kıyma doku -1-2 mm2&#39;lik kareler elde etmek ve 20 ml Pasteur pipet kullanılarak 50 ml santrifüj tüpüne PBS soğutulmuş ~ bu ekleyin. Pipet yapışmasını doku parçaları önlemek ucu kesilmiş ve PBS ile ezilip karıştırılarak pipet ıslak. </li><li> Yavaşça ayrıca doku parçaları yıkamak için tüp sallayın. Doku yerleşmek ve dökmek veya p izin verPBS çoğunluğunu kapalı ipette ve PBS berrak görünene kadar taze PBS ile tekrarlayın. </li></ol> BBM kaplı levhalar / kaplar ve Sindirim Orta 4. hazırlanması Not: Aşağıdaki adımlar (37 ° C su banyosu içinde kuluçka kademeli) bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır. <ol><li> (Hiçbir ekleme) ile soğutulmuş, DMEM içinde% 2 BMM çözeltisi hazırlayın. Çalışırken, buz üzerinde çözüm tutmak. % 2&#39;lik bir çözelti için, ekleme 140 uL 7 ml DMEM (yeterli bir tek 24-yuvalı plakanın hazırlanması için) BMM eritilmiştir. <ol><li> 250 ul% 2 BMM çözeltisi, oyuk başına (24-iyi levha) veya cam alt görüntüleme tabak başına ekleyin. </li><li> BMM yeterli polimerizasyonu için izin vermek üzere, 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca kaplı plakalar / tabaklar inkübe edin. </li></ol></li><li> Bir 0.3 mg / ml çözelti oluşturmak ve eritmek için tersine çevrilmesi için (Adım 1.2 ve 1.4 ila) 15 mg kolajenaz (hiçbir eklemelerle), 50 mL önceden ısıtılmış DMEM ekleyin. <ol><li> üzerindece tamamen 20 ml&#39;lik bir şırınga kullanılarak, eritilmiş, yeni bir steril 50 ml santrifüj tüpüne 0.2 um steril filtre içinden kolajenaz çözeltisi filtre edin. sindirim ortamı olarak etiketleyin. </li></ol></li></ol> 5. Doku sindirimi <ol><li> 10 ml serolojik bir pipet kullanarak PBS doku parçasını çıkarın ve steril bir 50-ml santrifüj (bir eklemelerle) soğutulmuş steril DMEM içeren tüp, girdap ekleyin ve sonra DMEM çıkarın. NOT: serolojik pipet yapışmasını doku önlemek doku ile temas ettirilmeden önce DMEM ile ezilerek ıslatın için. </li><li> &#39;Digest&#39; 1 ve 2: hücre artıkları ve tek hücrelerin çıkarılması <ol><li> Doku parçaları 7 ml sindirim ortamı ilave edin ve tüpü bir girdap verir. </li><li> 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Yavaşça (girdap yok) ~ 3 s tüp çalkalayın. </li><li> Bir ayırma, doku sindirim ortamı yerleşmek ve atmak için izin verKüçük hacimli mikroskop altında bakmak için. Not: başlayan Özellikle, son derece sindirim sürecinin ilerlemesini ölçmek için bir mikroskop altında her &#39;digest&#39; (~ 30 ul) bir küçük hacimli kontrol edilmesi önerilir. Birçok kriptler bu aşamada gözlenirse, sarsıntı çok kuvvetli olabilir. Farklı &#39;özet&#39; aşamalar genellikle nasıl göründüğünü temsili görüntüler için, Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> (Taze sindirim ortamı ile) tekrar Adım 5.2.-5.2.4. </li></ol></li><li> &#39;Sindirir&#39; 3 ila 5 XXXII parçaların toplanması <ol><li> dokuya 7 ml sindirim orta ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. <ol><li> İnkübasyon sırasında, 10-12 saniye süre ile her 5 dakikada sallayın. NOT: sarsıntı daha dinç olduğu için sallayarak daha &#39;çözünüklerinin&#39; 1 ve 2. </li></ol></li><li> sindirilmemiş doku 15 ml santrifüj tüpüne sindirim ortamı yerleşmek ve toplamak için izin verin. EğerDoku yanlışlıkla bir ortamla birlikte, bu yerleşmek 10 ml serolojik pipet kullanılarak çıkarın ve sindirilmemiş doku içeren 50 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne geri transfer etmek için toplanır. </li><li> Santrifüj, 100 x g&#39;de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında orta / süpernatan toplandı. </li><li> Süpernatant atılır ve dikkatlice toz haline getirilerek ve bir kenara göre 5 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamında, hücre pelet yeniden askıya. </li><li> mikroskop altında hücre süspansiyonu küçük bir hacim kontrol edin (Kademe 5.2.4 notu bakınız). Not: İdeal olarak, kript fragmanları hücre artıkları ve tek hücreler ile birlikte 3 &#39;sindirimi&#39; de ortaya çıkmaya başlar. &#39;Dijest 4 ve 5 düşük artıklar ile kript parçalarının önemli ölçüde daha fazla sayıda ihtiva eder (Şekil 1). Doku sindirilmesi değildir ve kript fragmanları daha kuvvetli bir şekilde çalkalanır, görünen değilse, yani gerektiğinde yoğunluğu çalkalama ayarlayın. </li><li> Adımları tekrarlayın 5.3.1-5.3.6 5&#39;e kadar &#39;sindirir&#39; olmuşturtamamlanmış veya doku çoğunluğu sindirilmiş kadar (bir 6. sindirimi gerekli olabilir). </li><li> Bir kez &#39;dijest 3-5 (ya da 3-6) elde edilmiştir, santrifüj tüm üst fazlar 100 x g&#39;de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında süpernatantlar sindirimi. </li><li> salgılama deneyleri için, &#39;dijest 3-5 (ya da 3-6) santrifüj leme öncesinde alınan üst fazlar bir araya getirir. Not: Daha az mendil kript parçalarının daha fazla sayıda temiz (hücre artıkları ve tek hücre olmaması) olan sindirimi süpernatant seçin görüntüleme deneyleri için gereklidir. Bu tipik olarak, 4 ya da 5 &#39;digest&#39;. </li><li> Süpernatant atılır ve yavaşça bir kümeleri görünür olana kadar öğütülerek pelet yeniden askıya. Yeniden askıya 10 uM, Y-27632 dihidroklorid ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış bir kültür ortamında pelet (anoikisi 17 önlemek için). salgılama deneyleri ve görüntüleme deneyleri için 2 ml kültür ortamı için 5 mL kullanın. </li><li> filtre100 um filtre ile bir hücre süspansiyonu (herhangi bir sindirilmemiş doku çıkarmak için). (Sırasıyla, sekresyon ve görüntüleme için 7 mL, 4 mL toplam hacim) yıkamak için filtre boyunca önceden ısıtılmış kültür ortamında bir başka 2 mL çalıştırın. NOT: Filtreleme gerekli değildir, ancak, büyük doku parçaları plaka / yemekler uymak değil eğilimindedir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Şekil 1: Primer ince bağırsak kültür yönteminden &#39;sindirmelerinde&#39; temsili görüntüler. (A) &#39;dijest 1 ve 2, esas olarak tek hücreleri ve hücre kalıntısını içeren Tipik malzeme. (B), siyah oklar 3 &#39;digest&#39; ürünlerin bir örneği, sindirimi malzeme görünen kript parçalarını gösterir. Tipik (C) 4 ya da 5 Paneli (D) malzeme sindirimi toplanmış temsil &#39;digest&#39;&#39;dijest 3-5 (C)&#39; de görüldüğü daha büyük bir istenmeyen doku parçaları çıkarmak için bir 100 um filtreden geçirildi. Tüm resimler 20X amacı ile dijital invert mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları 100 um =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> 6. Kaplama bağırsak Kültürleri (kriptik hücreleri için zenginleştirilmiştir) <ol><li> plaka ya da bulaşıklar için aşırı BMM çözeltisini çıkarın ve bunu salgılama başına 250 uL önceden ısıtılmış kültür ortamı ilave edin. NOT: Görüntüleme yemekler kadar çabuk sonraki adıma geçin kurumasını yemeğin önlemek için orta olmadan bırakılır. </li><li> Levha 250 uL hücre süspansiyonu oyuk başına (24-iyi levha) veya cam alt tabak başına. <ol><li> Plaka damla damla iyi boyunca yavaş &#39;zig-zag&#39; hareket. kript fragmanları inci plâkasını önce ~ 5 dakika boyunca çökmesine izin verilmektedirE inkübatör. NOT: Bu kuyu içinde kriptler / hücrelerin eşit dağıtıldığını teşvik etmelidir. </li></ol></li><li> Plaka ya da yemekler, gece boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin. NOT: A &#39;yamalı&#39; tek tabaka oluşturmuş olmalıdır. Üç yıkama aşağıdaki kültürler temsil eden bir görüntü için, Şekil 2A &#39;ya bakınız. </li><li> tabak başına 2 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile &#39;Flood&#39; görüntüleme yemekler. NOT: ~ 72 saate kadar kaplama aşağıdakiler için bu yemekleri görüntüleme için uygun olacaktır. Kolon kültürler genellikle 7 gün öncesine kadar, daha uzun ömürlü. yapışmış olan hücreler için bir yıkama adımı ile çıkarılabilir. Primer kültürler şimdi deneyler için kullanılacak hazırdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+A+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li><li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+chemosensing+mechanisms.">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li><li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incretin-based+therapies+for+type+2+diabetes+mellitus.">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors.">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li><li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture:+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides.">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716,+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium.">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li><li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells.">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1.">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li><li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells.">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li><li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2.">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li><li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells.">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells.">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li><li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans.">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li><li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents.">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li><li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells.">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol bağırsak peptid salgısı ve etiketli enteroendokrin hücrelerinin tek bir hücre görüntüleme çalışması sağlamak için karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. ince bağırsak kültürler başarılı olma olasılığını artırmak amacıyla, protokolü (doku hasat 3 saat içinde, ideal olarak) mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilir bu ve doku buz soğukluğunda bir ortamda tutulur ya da önceki tampon önemlidir sindirim işlemine hücre ölümlerini sınırlayabilir. özellikle kolon kültürlerin değil, şart iken, ince bağırsak kas tabakasının uzaklaştırılması kuvvetle teşvik edilir. ince bağırsak kültür protokolü mümkün olduğunca standardize edilmiştir. Ancak, hiçbir sindirim süreci özdeş olduğuna dikkat etmek önemlidir. Değişkenlik kas atılma derecesiyle mesela bir gün-gün bazında sokulabilir Bu protokol sırasında birçok adımlar, t boyutu vardırO, çalkalama gücünü, kolajenaz vb belirli bir yığınının gücünü doku parçaları &#39;kıyılmış&#39;. Sindirim işlemi ve isteğe uydurmak için çalkalanarak ilerlemesini ve &quot;dijest buna göre sayısını belirlemek için mikroskop altında &#39;dijest farklı her bir hacimde incelemek için büyük önem taşımaktadır, bu nedenle. kript fragmanları gelen belirgin değildir eğer, başlamak için daha nazikçe sallamak için tavsiye edilir ve daha kuvvetli sallayarak başlatmak için, itibaren 3 &#39;sindirmek&#39;. Bizim deneyim, enteroendokrin hücreler kültürde çoğalmadığı ve genellikle 4 gün içinde ince bağırsak kültürlerden kaybolur. Bununla birlikte, bu bağırsak peptidi salgılama deneyleri için yeterli zaman fizyolojik uyaranlara ve / veya farmakolojik maddelerin test edilmesi için (tipik olarak 2 saat, 18-24 saat sonra kaplama üzerinde gerçekleştirilen) sağlar. Salgılama deneyden önce bir gece boyunca inkübasyon gerektiren deneyler de yapılabilir, örneğin vardırboğmaca toksini 15 ile ön muamele durumunda. Yıllar boyunca üretti araştırma üretim hacminde ile kanıtlandığı gibi burada sunulan primer kültürü tekniği, iyi kurulmuş bir yöntemdir. Birincil kültürü modeli, çeşitli besin ve besin olmayan 14, 20, uyaranlara ve inhibitörlerine tepki olarak, GLP-1 1, GIP 18 ve PYY 19 de dahil olmak üzere bağırsak peptidleri, çeşitli salgılanmasını incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, aynı teknik başarılı bir insan bağırsak hücrelerine 21 kültür uygulanmıştır. Çoğu zaman, ilave bir deneysel model, örneğin birlikte, birincil hücre kültür metodu bir kombinasyonu olabilir. ex vivo veya in vivo olarak en kavrayış 6 sağlayabilir. Özellikle ve diğer yöntemlerle tersine, bu teknik im varbağırsak peptid salınımı ölçümü ötesinde nem li uygulamalar. Biz, sırasıyla örneğin kullanılarak Ca2 + ve cAMP sensörleri, GCaMP3 11, 13 ve Epac2camps 14 transgenik raportör farelerden türetilen primer küçük bağırsak kültürleri peptit salınımını gut bağlanmış hücre içi sinyal yollarının sorgulama için güçlü araçlardır olduğunu göstermiştir hem elektrofizyolojik teknikler 12 olarak gösterilmektedir. Genel olarak in vitro modellerde olduğu gibi, primer intestinal kültürleri kültür epitel hücreler polarite kaybı, hem de kan akımı ve innervasyon kaybı da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Enteroendokrin hücre fonksiyonu üzerine bu yapay koşulların olası etkilerini tahmin etmek zordur. Bununla birlikte, primer kültürlerden elde edilen veriler, genellikle in-vivo setti, dönüştürülebilir olmuşturng (GLP-1 sekresyonu 15 kısa zincirli yağlı asitlerin, örneğin etkisi). Birincil bağırsak kültürleri birçok potansiyel uygulamalar ile çok yönlü bir tekniktir. Zaten bağırsak peptid sekresyonunun düzenlenmesi hakkında önemli mekanik önem kazanmasını sağlamıştır.

Bu yöntemin genel hedefi bağırsak peptid salgısı ve enteroendokrin hücrelerinin canlı hücre görüntüleme çalışması sağlamak için izole etmek ve kültür karışık fare bağırsak hücreleri etmektir. Bu prosedürün erken bir versiyonu orijinal olarak Reimann ve arkadaşları tarafından 2008 yılında yayımlandı. 1 ve yana gruptan ilave 20 yayın temelini oluşturmuştur. Bu yazının için, onlar kolon kültürlere daha kurmak daha zor olduğu gibi küçük bağırsak kültürlerin odaklanmayı seçti. Enteroendokrin hücreler, glukagon-benzeri peptid 1 (GLP-1), glukoza bağımlı (GIP) insülinotropik peptid, kolesistokinin (CCK) ve peptid YY (PYY) 2 dahil olmak üzere bağırsak peptidlerin bir dizi salgılar. Bu bağırsak peptidleri gibi bağırsak geçiş, glikoz ile uyarılan insülin salımı ve tokluğun potansiye yavaşlaması olarak tokluk tepkileri düzenlenmesinde önemli fizyolojik rolleri vardır. GLP-1 mimetikleri birND olarak bozulmasını engelleyen ilaçlar tip 2 diyabet tedavisi için lisanslıdır ve bu peptidin 3 endojen salgılanmasını uyarıcı tedavi edici potansiyelinin bir sürekli değerlendirme vardır. enteroendokrin fizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve sekresyon stimüle ya da inhibe edilir, ya hangi mekanizma ile kritik bir öneme sahip, bu nedenle,. Peptid salgısı, in vitro ve ex vivo deneysel model, avantajları ve dezavantajları olan, her bir çeşidi kullanılarak incelenebilir Gut (aynı zamanda in vivo modellerin kullanılmasını kapsayan geniş kapsamlı bir güncel bir değerlendirme için Svendsen et al. 4). Bu tür izole edilmiş perfüze bağırsak 5 ve Ussing odası 6 Ex vivo teknikleri halen çeşitli maddelere tepki olarak bağırsak peptidi salınımını keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin başlıca avantajı olarakBirincil kültürler ile karşılaştırıldığında, enteroendokrin hücrelerinin anlık çevre büyük ölçüde sağlam kalır ve daha önemlisi, hücre polarite korunmuş olmasıdır. Nedenle, bir salgı 6 üzerine etki eden olan hücre yüzeyi ile ilgili bilgiyi elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu, genellikle düşük verimli teknikleri ve bunlardan türetilen verilerin kalitesi kaçınılmaz zaman içinde azalma bağırsak dokularının bütünlüğünün ve canlılığı, dayanır. Bağırsak organoids artık giderek enteroendokrin hücre fonksiyonu ve gelişimi 7 çalışma için in vitro model olarak kullanılmaktadır. Kemirgen ve insan dokusu hem de türetilebilir Organoids, kültür içinde hücre polarite muhafaza 3D &#39;kript benzeri yapıları oluşturan bir yararı vardır. Bununla birlikte, organoid türetilmiş enteroendokrin hücreleri henüz tam olarak karakterize edilmesi için olan ve doğal L cel kendi benzerlikls büyük ölçüde bilinmemektedir. enteroendokrin hücrelerinin üretimi muhafaza ve uzun zaman süreleri için yapay koşullar ayırt edilmez olarak birincil kültürleri, bir adım daha yakın fizyolojik ayarına olma avantajına sahiptir. Bağırsak peptidi salgısının değerlendirilmesi için kullanılan edilmiş Alternatif bir birincil kültür metodu cenin sıçan barsak hücreleri (FRICS) 8 izolasyondur. Bununla birlikte, yetişkin bağırsak doku kültürü az bir başarı elde etmiştir ve bazı farklılıklar FRICS genel yetişkin fare bağırsak hücrelerinin (örneğin glikoz 8) yanıt verme gözlenmiştir. Enteroendokrin-benzeri hücre hatları (örn GLUTag STC-1 ve NCI-H716), geleneksel olarak karşı doğrudan ayırmak için kullanılmıştır. dolaylı etkiler entero- hücrelerde ve salgılama için uyaran bağlanması altında yatan moleküler mekanizmaların tahlil edilmesi; bakınız Kuhre ve ark </em&gt;. L &#39;hücre-benzeri&#39; ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri yoluyla peptid üretimi ve salgılanması için 9. Bu gastrointestinal sistem boyunca dağınık enteroendokrin hücreler, gerekli olmuştur sadece bağırsak epitel hücreleri 10 ve sıralanmış hücrelerin% 1 altında, bizim elimizde, kültür 1&#39;de hayatta yoktur oluşturmaktadır. Hücre hatları bunlar gen sessizleştirme olarak genetik manipülasyonlar için elverişli olan bir büyük ölçüde homojen bir hücre popülasyonu olmasından dolayı yararlı araçlar kalır. Sonuç olarak, transgenik fare, mevcut olmadığında, farmakolojik olarak hedeflenen edilemez proteinlerin rolünü araştırmak için kolaydır. Ancak, hücre hatları her zaman birincil hücrelerin geçerli modeller değildir. Birçok benzerlikler vesileyle GLUTag hücrelere kıyasla birincil L hücrelerinde belirli besinlerin aktive sinyal yollarının farklılıkları sermiştir birincil kültürlerden bulgular varken, örneğin (örn. Peptonlar &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 11). En önemlisi, transgenik flüoresan raportör fareler ile kombinasyon halinde, primer kültürü modeli, hücre içi düzeyde bireysel birincil enteroendokrin hücrelerinin detaylı inceleme sağlar. Birincil kültürler içinde floresan-etiketli L hücreleri yama kalsiyum 11, 13 ve siklik adenosin monofosfat-FRET görüntüleme enteroendokrin alanında önemli gelişmeler vermiştir 14 çalışmalar, 1, 12 çalışmalar ve tek hücreli sıkma için bir grup tarafından kullanılmaktadır fizyoloji. Aşağıdaki protokol, tek bir yetişkin fare ince bağırsağın, 10 cm bölümünden, salgılama deneyler bir 24-çukurlu plaka kullanılarak ya da 16 adete kadar görüntüleme yemeklerin hazırlanması için optimize edilmiştir. protokol kolayca sindirim süreleri ve işbirliği artırarak kolon hücrelerinin çalışma için değiştirilebilirllagenase konsantrasyonu.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>For secretion experiments</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 15 mL, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>For tissue preperation/digestion</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, 50 mL, sterile</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430828</td><td>For tissue preperation/ digestion</td></tr><tr><td>Collagenase XI (Crude)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>For making up digestion medium</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>DMEM High glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>For dissolving matrigel (keep at 4 &amp;deg;C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Forceps/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>High precision tweezer (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>For removing muscle layer</td></tr><tr><td>High resolution digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positive control (secretion experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>For collecting tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td></tr><tr><td>MetaFluor&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescence ratio imaging software</td></tr><tr><td>Mice (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td></tr><tr><td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>For calcium imaging and secretion experiments</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>For photomicrographs of cultures</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>For washing tissue, keep on ice</td></tr><tr><td>Penicillin &amp;amp; Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>For making up culture medium</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positive control (calcium imaging experiment)</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>For dissection/removal of intestine</td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>For dicing tissue</td></tr><tr><td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &amp;micro;m pore size)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td></tr><tr><td>Xenon arc lamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)</td></tr></tbody></table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

bağırsak mide-bağırsak epiteli boyunca yer alan hormon salgılayan enteroendokrin hücreleri ile vücudun en büyük endokrin organdır. fizyolojik önemine rağmen, enteroendokrin hücreler epitel hücre popülasyonunun yalnızca küçük bir bölümünü temsil eden ve geçmişte, kendi karakterizasyon hücre hattı modellerinde bir güven sonuçlanan önemli bir meydan okuma sundu. Burada, karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu birincil kültürleri besin ve bir çok nöropeptid yanıt olarak farmakolojik ajanlar olarak uyarılması ve bağırsak peptidi salgısının engellenmesini temel sinyal yollarını tespit etmek için kullanılmıştır. Ayrıca transgenik flüoresan raportör farelerin kullanılması ile kombinasyon halinde, bu birincil kültürde en floresan etiketli enteroendokrin hücre elde edilmesi için güçlü bir araç haline olduğunu göstermiştiryama sıkıştırma ve tek hücre kalsiyum ve cAMP FRET görüntüleme gibi yöntemler kullanılarak ekstrasellüler seviyesi.

Seri sindirim aşamasının kullanılması kript parçalarının nispeten temiz bir preparasyon toplanması deneyleri için kaplama sağlar. İlk iki dijestleri sindirerek malzeme (Şekil 1A) öncelikle tek hücreler ve hücre kalıntısını uzaklaştırmak. Üçüncü sindirmek sırasında, kript fragmanları sindirilmiş malzeme (Şekil 1B) görünür. Daha az tek hücreleri (Şekil 1C) kript fragmanlarının 4 ve 5, verimi daha fazla sayıda sindirir. 3-5 temiz bir kript fragmanı hazırlanması (Şekil 1D) üretilmesi için kültür için zarar verici olabilir sindirilmemiş doku büyük parçaları, kaldırır sindirimleri toplanmış materyal filtre. Kültürün 18-24 saat sonra, birincil, ince bağırsak hücrelerinin tek tabakaları (Şekil 2A) gözlenir. özellikle cal eksprese eden transgenik farelerde elde edilen kültürlerin kullanılmasıkalsiyum veya magnezyum floresan sensörü, GCaMP3, proglukagon promotör 11 kontrolü altında, L hücreleri kolayca tanımlanabilir ve kültür (Şekil 2B) içinde dağılmış olan. Birincil ince bağırsak kültürlerde, bileşikler Gq -Ca hedefleme 2 + ı ve cAMP i yollar GLP-1 sekresyonunu stimüle bağımlı (salgı deney yöntemi için Reimann ve arkadaşları. 1 e bakınız). Bombesin (BBS, 100 nM) ve forskolin ve 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), eş-başvuru (F / I, 10 uM her) GLP-1 salma nisbetle bir 2 ve 11-kat, stimülasyon tetiklenen bazal sırasıyla (Şekil 2C). GCaMP3 spesifik L hücre sentezleme belirlenmesini ve bireysel L hücrelerinde kalsiyum mobilizasyonu, gerçek zamanlı izleme sağlar. Her ikisi de, 100 nM bombesin (BBS) ve 30 mM potasyum klorür (KCl) bilinen G q gösteren hücre içi kalsiyum geçici bir artış ile uyarılmış &lt;/ alt&gt; - ve primer L hücreleri (Şekil 2D) elektrojenik çiftli yollar. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Şekil 2: Primer, ince bağırsak kültürlerinden türetilen Örnek verileri. (A), sekresyon ve (B) &#39;görüntüleme deneyleri için kullanılan karma primer küçük bağırsak kültürlerin Örnek görüntüleri 24 saat kaplama sonrası. (A), görüntü bir 4x objektif ile dijital ters mikroskop kullanılarak, bir 24-kuyucuklu plakada. Ölçü bar = 500 um. GLU-Cre kullanılarak ve (b) (yeşil hücreler) alanında ROSA26 GCamP3 fareler, L hücreleri x GCaMP3 floresanı ile tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 50 um temsil eder. (F / I, 10 uM her biri) (C), GLP-1 sekresyonu (BBS, 100 nM), bombesin yanıt olarak ölçüldü ve forskolin / 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX). Yüzde, GLP-1 sekresyonu hesaplanmıştıryüzer bölümler ve hücre lizatları, GLP-1 seviyeleri ölçülerek. Veriler her bir durum için, n = 3, ortalamalar ± SEM temsil eder. (D), potasyum klorür (KCl, 30 mM) ve BBS (100 nM) &#39;ye tepki olarak, gerçek zamanlı olarak izlenir (B)&#39; de tarif iki hücre (sitozolik kalsiyum yansıtan) GCaMP3 floresan. Tek hücre görüntüleme 40X yağa batırılmış objektif ile bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir. GCaMP3 75 W ksenon ark lambası ve fluoresans görüntü yazılımı tarafından kontrol edilen bir monokromatörü kullanılarak, 475/10 nm uyarılmıştır. Emisyon bir dikroik aynayı ve 510-560 nm bant genişliği filtre kullanılarak bir yüksek çözünürlüklü şarjla bağlanmış cihaz (CCD) kamera ile kaydedildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Görüntüleme.  Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge.  Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar. 

Video: Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Biyomühendislik

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Gelişim Biyolojisi

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Tıp

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Gut hormonu salgılanması izole kullanarak temel mekanizmaları fare bağırsağı periosteum

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biyoloji

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Murin Bağırsak Kriptlerinden ve Tek Kök Hücreden Organoidlerin 3D Kültürü

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Yazar Spotlight: Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürü ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...