この作業によってできたパイロット グラント同盟から再生リハビリテーション研究およびトレーニング (AR3T) 学部スタートアップ パッケージのウェイン州立大学からの瓶に。AR3T はユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子と人間の開発 (NICHD)、国立研究所の神経疾患と脳卒中 (NINDS) と国立研究所の生体イメージング、バイオ エンジニア リング専攻 (NIBIB によってサポートされています。) 賞を受賞番号 P2CHD086843 の下で健康の国立研究所。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

ライブ動物を含むすべての研究機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウェイン州立大学、デトロイト、ミシガン州、アメリカ、によって承認され、ケアおよび実験動物の使用 (のためのガイドに従い、2011 年、第 8 版刊国民アカデミーの出版物、500 第 5 通り、NW、ロック ボックス 285、ワシントン、DC 20055、米国)。承認された IACUC プロトコルに従って痛みや苦痛を伴う手術は全身麻酔で誘導され、イソフルラン吸入 (1.5-5% の効果に) によって維持します。眼瞼の欠如と、ピンチをつま先に撤退の不足によって確認された麻酔やヒゲの応答 (イソフルランの割合は効果を維持するために必要に応じて増加した)。プロトコルの性質上低侵襲、&#34; 滅菌ヒント &#34; 技術が続いた。動物は麻酔でしたが、ワセリンは乾燥を防ぐため目に適用されました。必要; 特別な治療法はありませんでした。ただし、ダイエット ゲルは関与している一般的な麻酔。 捜査官が外科的ホストの公開手順を含まない以来次の MIME、鎮痛を保留する IACUC によって承認された手順に従って 24 時間動物に提供されました。筋肉、それは 1 つの後肢に限られている、通常の機能には影響しませんので、正常な筋肉の再生に影響を与える多くの一般的な鎮痛薬が知られています。 1。動物モデル <ol><li>MIME のホスト マウス <ol><li>使用 NSG GFP マウス (8-10 週、男性) ホストとして筋肉の移植研究 。
		注: これらのマウスは、理想的なホスト同種筋肉移植におけるサイトカイン シグナル、欠乏している、管または xenografting の非筋細胞の他のユーザーによって使用されている成熟 T および B リンパ球とナチュラル キラー細胞の機能を欠いているため < supクラス ="xref"> 14。ユビキタスの GFP 発現ホスト (GFP +) とドナー由来細胞 (GFP) 筋肉繊維を容易に識別できます</li>。
	</ol></li> <li>MIME のドナー マウス <ol><li>ドナー マウスとして使用 c57bl/6 j マウス (12-16 週). 
		注: これらのマウスは、ドナー マウス完全にマップされたゲノムがある彼らは任意の骨格筋病変を持って知られていないし、容易に利用可能な経済的な GFP を発現していないためです</li>。
	</ol></li></ol> 2。ドナー筋肉組織を準備する <ol><li>指導の縫合糸を結ぶと収穫ドナー EDL 筋肉 <ol><li>安楽死させる頚部転位と卓上によって管理される全身麻酔下開胸によるドナー マウス医療酸素 (イソフルラン吸入; 効果 2-5%) によって駆動されるイソフルラン気化器</li>。
		EDL の筋肉にアクセスする <li>では、手術用はさみのペアを使用して、脚の前方の表面に皮膚を開きます。前脚で TA、筋肉を見つけ、TA 筋肉の後ろにある EDL 筋を視覚化する取り外します。EDL 筋肉の後ろに鉗子のペアの先端をスライドさせて、つま先が拡張するかどうか参照してくださいに優しいトラクションを適用 (これは筋肉が EDL であることを確認)。&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 注: ドナー組織領域は外科的、収穫する前に無菌準備中をする必要があります</li>。
		<li>使用 〜 10 cm セグメント 4-0 絹糸、編みこみ、非吸収性、滅菌縫合と EDL 筋の近位および遠位腱にガイディング ・縫合糸を適用する 2 つダブル ノットを作る。( 図 1 a).</li>
		<li>近位部の腱の遠位の EDL の腱を切って、EDL 筋を反映切り</li>。
		<li>ドナー EDL 筋ペトリ皿の場所マウス リンガー液でいっぱい</li>。
	</ol></li></ol> 3。MIME のホスト マウスを準備 <ol><li>麻酔 <ol><li>医療用酸素によって駆動される卓上イソフルラン気化器によって管理される全身麻酔 (吸入イソフルラン; 効果 1.5-5%) の下にホスト マウスを配置します</li>。
		<li>誘導室の麻酔し、動物の他の手順を実行しながら麻酔を維持する鼻の円錐形にマウスを転送します。動物は麻酔下にパッドを加熱等温ゲル熱サポートを提供します</li>。
	</ol></li> <li>皮膚の準備 <ol><li>動物を削除する &#39; s 毛皮、左の後ろ脚の前部側面に脱毛クリームを適用します。右脚は、以後の手順をコントロールの脚として機能します</li>。
		リン酸に浸したワイプで <li>戸建と一緒に脱毛クリームを 2 分クリーンに脱毛クリームを残す毛皮緩衝生理食塩水 (PBS)。毛皮除去後ポビドン ヨード洗浄ソリューションと 70% のエタノールの 3 つの交互おしりふきで肌をスクラブします</li>。
	</ol></li> <li>ホスト TA 筋針トラックを作成する <ol><li>TA 筋肉筋肉に沿ってホストの中心を通って 18 ゲージ (1 in ロング) の手術針を渡す &#39; s 長い軸 ( 図 1 b)。TA 筋の筋腹 ( 図 1 b) の中心を通る長さに沿って cephalo 尾側方向に針を渡します 。
		注: この手順の目的は、ドナーの筋の部分を埋め込むことができます針トラックを作成します。TA 筋の中心にドナー ティッシュを埋め込むことが悪意のある移行し、全体のホストの間で筋を促進するドナー組織から SCs 脛骨筋</li>。
	</ol></li> <li>ホスト脛骨筋の針のトラックに埋め込みドナー組織 <ol><li>手術針がホスト TA 筋肉内、合格指導縫合手術針の内腔を通じてドナー組織の一方の端に、caudo 頭部方向 ( 図 1).</li>
		<li>Caudo 頭部方向にホスト TA 筋から針を撤回針トラックを介してドナー組織を描画します</li>。
		<li>は、ドナー組織の配置を調整するのにドナー組織の尾と頭部の両端にガイドの縫合糸を使用します。ドナー組織がホスト脛骨筋 ( 図 1) 以内に落ち着いていることを確認します</li>。
<li>ドナー組織配置を最適化すると、先の細いピンセットでドナー組織配置に最終的な調整を行うガイディング ・縫合糸を切断します</li>。
		<li>シール皮膚針傷 ( 図 1E -F) 鉗子で傷のエッジを近似し 27 ゲージ手術針の先端で獣医組織接着剤を適用します</li>。
	</ol></li></ol> 4。誘発する協調筋変性と再生に Myotoxin 投与 <ol><li>後 MIME を注入ホスト筋における広範な筋線維損傷を誘発するホスト TA 筋 50 60 μ L 1.2% BaCl 2 (myotoxin) のとドナー組織内に埋め込まれている 15。
	<ol><li>注入 BaCl 2 ホスト TA の長さに沿って 3 つのサイトで筋肉 (近位、中間および遠位 3 分の 1 の筋腹). 
		注: 骨格筋の BaCl 2 cardiotoxins と notexin のような myotoxins の注入再生 16 続いて協調筋線維損傷を誘発する</li>。
	</ol></li></ol> 5。手続き後動物ケア <ol><li>後 MIME や BaCl 2 注入、きれいにホスト マウス &#39; s 左後肢足のエタノールと皮膚を保護するためにワセリンの薄層を適用</li>。
	<li>後手続きスキンケア後鼻の円錐形からホスト マウスを削除します</li>。
	<li>は、寝具なしで孤独な回復ケージにマウスを配置します。熱等温ゲルパッド暖房を通して回復動物サポート配置下で回復ケージの半分を提供します 。
	注: いずれか半分は温水ではありませんので、その動物が必要に応じて加熱パッドから離れて移動可能性があります</li>。
	<li>ホスト マウスは完全に麻酔から回復した後は、その元のケージに動物を返します。動物施設で動物の背中に置きます、フォロー アップの実験を行った。フォロー アップの準備ができるまで、毎日ホスト マウスを監視 &#8211; 例: 3 または 14 日後 MIME で。次の MIME、動物によって監視される研究者同様の獣医のスタッフによって &#8211; これは主に動物が明るく、アラート応答の場合の評価を含む動物の痛みの明白な徴候を示しているまたは移動、餌、飲むと手入れをすることの難しさを抱えている場合を評価して</li>。
</ol> 6。組織コレクション <ol><li>収穫ホスト筋 <ol><li>安楽死させる頚部転位と医療用酸素 (によって駆動される卓上イソフルラン気化器によって管理される全身麻酔下開胸によるホスト マウス吸入イソフルラン;効果 2-5%). 捜査官 IACUC 承認前に安楽死。 全身麻酔下で収穫 TA 筋肉しています</li> <li>ホスト TA の筋肉にアクセスするには、脚の前方の表面の皮膚を開く外科はさみのペアを使用。前脚の脛骨筋を見つける、遠位の腱を切って、筋肉を反映、近位筋の添付ファイル (セクション 2.1 を参照) をカットします</li>。
		<li>(実験中) 左と右 (コントロール) TA の両方を収集筋肉</li>。
	</ol></li> <li>凍結収穫された筋肉をスナップ <ol><li>を置くことによって収穫された筋肉の重さで紙の重さし、計量スケール</li>。
		<li>は簡単に鉱物油に対する凍害保護作用で筋肉を浸しなさい。余分な油をしみ</li>。
		アルミ箔とスナップの <li>場所の筋肉は急速に液体窒素をデュワーでいっぱいでそれらを浸すことによって筋肉を凍結します。ラベル付きクリオバイアルにサンプルを転送し、その後の研究の-80 ° C のフリーザーでのサンプルを格納します</li>。
	</ol></li></ol> 7。組織学的研究 <ol><li>セクショニング筋肉組織の連続断面を収集 <ol><li>-80 ° C のフリーザーからサンプルを含む液体窒素デュワーにそれらを置くことによってクライオスタットに転送します</li>。
		<li>、クリオスタットで同時に 1 つのサンプルを処理します。冷たいかみそりの刃 (刃クライオスタットに格納されている)、約 1-2 mm の厚さは、筋肉のセグメントを生成する脛骨筋の半ば腹を 2 回サンプルをカットします。クライオスタット切片を作るためこのセグメントを維持し、筋肉の残りの部分に戻るそのクリオバイアル</li>。
		<li>凍結コンパウンドの最適切削温度 (OCT)、クライオスタット試料ディスク上に組織の厚いセグメントをセキュリティで保護します。試料ホルダーに試料ディスクを配置します</li>。
		<li>粗面 20 μ m セクションの切断によってサンプル。クライオスタット切片をスライド ガラスにいくつかの 20 μ m セクションを収集します</li>。
		<li>場合、20 μ m の品質は満足、切削厚み 5 μ m に変更し、品質を評価するためにいくつかのセクションを収集します。5 μ m のセクションが品質に満足なら、連続切片を収集します。スライドごとの 2-3 節、3 スライドの十分なセクションを収集します</li>。
		<li>実験 (左) とそれぞれの動物のコントロール (右) TA 筋肉の両方からのセクションを収集します</li>。
	</ol></li> <li>勉強 GFP 発現 注: 筋線維における GFP 発現を研究する準備されたスライド (セクション 7.1) の 1 つのセットを指定します。
	<ol><li>は、セクションで耐フェード媒体の 〜 50 μ L を適用し、ガラス基板を適用します。クリアのマニキュアと coverslip エッジをシールします</li>。
		<li>光と蛍光顕微鏡を用いた (表の材料 を参照)、研究目的と GFP を可視化するための適切なフィルター X 10 のセクション。
		TA 筋の全体の横断面をカバーするための視野の重複の <ol><li>収集のデジタル画像の (~ 15)。各 visual フィールド蛍光から顕微鏡の位相コントラスト モードへの切り替えによって位相コントラスト画像を収集します</li>。
		</ol></li> <li>; 単一コンポジット画像を生成する個々 の画像を並べて表示できます適切な画像処理ソフトウェアで画像を開く例えば 使用、&#34; photomerge &#34; イメージング ソフトウェアの [ファイル] メニューの [オプションに掲げる 材料表</li>。
		<li>は、適切なイメージ解析ソフトウェア (例えば ImageJ) GFP 蛍光画像を開きます。円個々 の筋線維を使用して、&#34; ROI ツール &#34; し、各繊維の平均蛍光強度を記録。
		<ol><li>GFP 発現を示し、正常形態 10 の繊維の平均蛍光強度の平均を取ることによって最大 GFP (蛍光) 強度計算。最大の GFP 強度によって各繊維の平均蛍光強度を分割し、100 を掛けることによって各繊維 %gfp の最大強度を計算します。 図 3 e で示すように、各 TA 筋の GFP 解析の結果を集計します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>デスミンと 4 の蛍光ラベル化による筋線維の整合性と伴なう場所を勉強 &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) それぞれ 。
	注: は、上記のように、筋線維のデスミン ラベリングを勉強する準備されたスライドの 1 つのセットを指定します。
	<ol><li>修正プログラム セクション PBS で 10 分 2% パラホルムアルデヒドで洗って 3 回 PBS のセクション 。
		注意: 適切な個人用保護具 (PPE) を着用は、パラホルムアルデヒドを処理するときを処理するときです</li>。
		<li>0.01% を含む PBS で希釈した 3% ウシ血清アルブミンを持つブロック セクション 30 分トリトン X100。このブロッキング液として来世に呼びますプライマリ希釈します</li>。
		<li>一次希釈液 (レバレッジ) にウサギ抗デスミン免疫グロブリン G (IgG) を希釈します</li>。
		<li>ブロックが完了したら、セクションで希釈した一次抗体を適用し、incubate 一晩 ~ 4 ° c. の洗浄で冷蔵庫で一度 (5 分) のセクション 0.1% を含む PBS トリトン X-100。このソリューションは、最初の洗浄バッファーとして来世呼ばれます</li>。
		<li>洗うセクション PBS で 3 回 (洗浄あたり 5 分) です</li>。
		<li>アンチ山羊を希釈することによって二次抗体ウサギ IgG は 0.01% を含む PBS で (赤の蛍光色素を標識) 準備トリトン X-100</li>。
		<li>セクションに希釈した二次抗体を適用し室温 (~ 23 ° C) 60 分インキュベート</li>
		<li>は、最初の洗浄バッファーで一度 (5 分) のセクションを洗ってください。3 回 (洗浄あたり 5 分) PBS のセクションを洗浄します</li>。
		3 分 <li>適用 DAPI は、PBS で 3 回 (洗浄あたり 1 分) セクションを洗ってください。適用 〜 セクションの媒体が耐フェードを 50 μ l 添加し、ガラス基板を適用。クリアのマニキュアと coverslip エッジをシールします</li>。
		<li>光と蛍光顕微鏡を用いた研究 (材料の表 を参照)、シリアルのセクション目的と可視化のための適切なフィルター × 10 で赤い蛍光染料</li>。
		<li>は、脛骨筋の全体の横断面をカバーするため重複する視野のデジタル画像 (~ 15) を収集します。Visual フィールドごとに適切なフィルター設定への切り替えによって分類する DAPI の蛍光画像を収集します</li>。
		<li>オープン 7.2.4 7.2.3 - の手順で説明するように適切なイメージング ソフトウェアを使用して画像を分析と 。
		注: 研究の筋線維は損傷 (デスミン負)、識別するため、画像が筋線維が中心核 (デスミン陽性線維末梢ではなく、内部である DAPI ラベル核を持つ)、あり、セクションの領域炎症や線維化 (クラスター化、DAPI ラベル核の多くがあるが、筋線維を欠いている部分) がある</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

ここでは、ホスト筋肉組織にドナー筋肉組織を移植する当研究室で開発された、MIME と呼ばれる実験手法の詳細なプロトコルを提案する.これは接木をホスト筋9,10,17におけるドナー細胞の筋形成を促進する上で効果的であることが、すでに開いている筋肉の適応。
MIME の目標は m を刺激する条件の下でホスト筋における筋形成に貢献できる SCs ドナーのソースを提供するものが、筋肉にはホスト (現在はわかりませんこれが発生したかどうか)、ドナー筋組織自体の生着を有効にしません。uscle 再生。私たちの希望は、MIME を最適化し、基本的なおよび前臨床研究でテストされた後、それは筋の筋肉の損失を受けている骨格筋の筋再生を向上を目指す臨床治療をガイドする貴重な洞察力を提供できることです。
まだどのように MIME に変換できること臨床療法などについて答えられなければならない多くの質問がある: ドナー組織の品質を制御する方法ですか?我々 はドナー組織や細胞の免疫拒絶反応を制御する方法は?ドナー組織が筋の細胞を提供した後オフになってそれは線維性瘢痕を残すか。ドナーやホストの筋線維タイプはドナー細胞の筋に影響を与える?どの筋肉は実質的に MIME から寄与できるか。MIME は、安全かつ効果的な評価、ドナー由来の筋を強化でき、上記質問の多くに答える補助治療法を特定する研究を展開しています。
MIME とマウス-マウス同種移植のテストを完了すると、私たちの次のステップは、死体の筋肉組織の筋原性の可能性を評価する死体の人体組織と人間-マウス MIME を行うことです。これらの実験は基本的な橋渡し研究教育体遺贈プログラムなど臓器の命の贈り物プログラムへの取り組みに登録されているドナーから筋肉組織を含む新しい行につながることを期待して.
本稿で示した代表的なデータでは、MIME 後 14 日に GFP を欠いているか、GFP の低レベルを持っているいくつか実行可能な筋線維があることを示唆しています。これらのデータの解釈は GFP ドナー衛星細胞がホスト筋における筋形成に寄与しています。ひと死体組織のホストのマウスの筋肉への注入の準備のためにこの実験を行った。インプラントの表現 (例えばGFP と簡単に区別できる、蛍光レポーター ドナー組織に有用であろうドナー衛星細胞が次の MIME ホスト筋における筋形成に寄与することを明確に示すため、赤色蛍光タンパク質 GFP + ホスト筋に移植したドナー組織を表現する)。
この手法は、主にドナー組織内に存在の SCs の性質によって制限されます。ドナー組織で SCs テクニックはドナー細胞の筋を容易にする可能性、実行可能な場合は中に、すれば彼らは実行可能な筋が発生することはできません。しかし、以来、SCs は非常に弾力性のある、死後約 2 週間のために実行可能、それは実験目的のための収穫後、数分内に注入されたドナー組織はドナー細胞筋13 を容易に可能性が高い.さらに、上記に触れたように、それは (SCs 成熟の筋線維、筋常駐型線維芽細胞を含む) 全体の筋組織からホスト筋に埋め込まれる、線維症が発生する可能性が可能です。しかし、この仮定は、実証的に検討する必要があります。有害収縮、cryoinjury、および実験的 myotoxins から生じる筋損傷文献は、(主に大食細胞) の免疫細胞が効果的に破損した繊維から細胞の破片をクリアし、改造することができることを示唆している、細胞外マトリックスの18。したがって、それは MIME と BaCl2投与宿主免疫細胞変性のドナー筋線維へのアクセスを持っている限り可能性を消去する破片、SCs のドナーだけを残してします。最後に、ドナー由来筋形成の程度はホスト筋に埋め込まれているドナー筋肉組織の量に依存しています。ドナー細胞由来の筋線維が完全に再作成ホスト筋肉コンパートメントの順序でメソッドのような X- または γ 線照射ホスト筋 SCs をアブレーションし、また繰り返される MIME 手順が必要必要になります。
外科的ホスト筋を公開およびホスト筋にドナー組織の部分を縫合がドナー細胞筋9,10,17を促進できることが実証されています。このオープンな外科的アプローチは、筋の進行を追跡し、筋疾患のマウスモデルを生成する、過去に使用されています。MIME 技術の革新的な側面は低侵襲手術公開ホスト筋を必要としないことです。これは医原性の感染症したがって、それはより必要な場合同じホスト筋に MIME を繰り返し実行可能になるホスト動物の不快感の程度のリスクを低減します。
MIME 手法を現在ホスト マウスにドナー筋肉組織をインプラントに続いてオープン外科的アプローチに適した洗練されたことを期待しています。ヒト化マウス モデルの生成を促進すると、ホスト マウス筋生検筋を埋め込むことによってこのことが。さらに、マウスのマウスの移植から私たちの予備的なデータに基づき、MIME がドナー SCs が実行可能な限り人間の死体ドナー組織から筋をドナー細胞性を達成するために効果的なことと見込んでください。最後で追加テストと検証、我々 は MIME 手法が筋疾患をもつ人間でドナー細胞の筋を容易にする新しい治療法の開発を助けることを願っています。
MIME 手法の成功はホスト筋筋膜コンパートメント (下腿) 内ドナー組織を正確に埋め込むに批判的に依存しています。ドナー組織ホスト筋肉コンパートメント内に配置すると場合にのみ、正確な方法でホスト筋に SCs を提供できるそれことが。ドナー組織ホスト筋の外側に配置された場合、その運命になるかが明確じゃないです。MIME の実験モデルで、それは顕著で、表面的に足の前外側の側面に置かれたのでにホスト筋として脛骨筋を使用します。サイズ、向き、および脛骨筋の解剖学的位置により簡単にドナー組織が配置されること正しくホスト TA 筋肉内で MIME を確認します。本稿では、実験的証拠を実施している再ドナー組織ホスト 3 日後 MIME で TA 筋肉内が埋め込まれた本管は 14 日後 MIME でホスト筋におけるドナー細胞の筋です。

分裂にもかかわらず、健全な骨格筋衛星細胞 (SCs)1,2として知られている組織居住者筋細胞の存在のための優れた再生能力を持っています。3,4の見直し。しかし、筋ジストロフィー、外傷や老化促進によって引き起こされる病理学の条件の下で筋再生が追いついていない筋肉の内訳、したがって、進歩的な筋肉繊維の損失は、5を発生します。ホスト筋筋線維の生理学的に関連する番号を生成する試みがある筋から SCs を分離し、多数の筋芽細胞 (および後である) を生成する文化でそれらを展開する効果的な方法が開発されているが6のみ最小限の成功をもたらした。として他の多くの細胞型を持つホスト組織に筋芽細胞を注入するだけで、細胞の大部分はない接が7,8。人間筋芽細胞8注入されたホスト再生欠損マウスの筋肉におけるドナー細胞由来の筋を神経筋電気刺激 (NMES) に促進を示します。他の人は外科的移植筋生検または接続されている SCs と単一の筋線維が SCs と全体の筋線維を植え付けることがあります移植より有利なことを示唆、NMES がなくても適度な筋形成を促進することを示しています。筋細胞だけで9,10。ドナーまたはホスト筋肉に接ぎ木した人工筋肉組織だけで細胞移植よりも良い結果を生成する、組織や組織のような構造は、ドナー細胞の生着のため、重要な手がかりを提供する可能性があります可能です。様々 な細胞タイプ10、11,12を含む細胞療法の研究で次第に明らかになっている概念です。
最近のデータは、SCs の人間から得られるよりも 2 週間事後で生成される細胞文化13をお勧めします。筋組織収穫死後の生きているホストへの注入は、逆に筋線維の損失を評価する予定します。ドナー細胞由来の筋形成を促進するために生きているホストの骨格筋組織へドナー筋肉組織を移植する MIME と呼ばれる手法を開発しました。MIME は、針トラックを作成するホスト筋を通して手術針を渡す必要があります。針トラックを通してドナー筋肉組織の小さなセグメントの描画ホスト筋; に埋め込まれたままドナー組織組織接着剤の針穴の開閉。安楽死させたマウスのテクニックを練習して勉強した後他の実験においては、今、免疫不全、生きたマウスの MIME を実行しているし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を普遍的に表現、3 と 14 日間のフォロー アップ後 MIME。3 日後 MIME ではドナー マウス (GFP-) EDL 筋が TA (GFP +) 筋、ホスト筋に埋め込まれたままのホスト マウスに注入を確認します。14 日後 MIME BaCl2 myotoxin 怪我の損傷や筋を誘発した後我々 を確認約 5%、26%、26%、単一のホスト TA 筋肉に繊維の 43% を示すないホストの貢献、最小限のホストの貢献、適度なホスト貢献、および最大貢献をそれぞれホストします。中心核 (変性とそれに続く再生マーカー) は、MIME および myotoxin 注入後 TA 筋線維の約 95% に見られます。
我々 は、この時点でポイントは、再生繊維の大半が集中的に核形成したとき再生の中間段階をキャプチャするため TA 筋肉を MIME + BaCl2後 14 日と勉強します。我々 はホスト、ドナー由来の筋線維を容易に区別ができるときに我々 は最終的にホストのマウスに人間の死体の筋肉を移植、MIME のためのホストとして GFP + マウスを調べた。この筋から単繊維は TA 筋肉9より大きい頚筋電位を示しているので、実験的ドナー組織としてマウス EDL 筋を使用します。EDL 筋肉は、脛骨筋に相乗も、同様の繊維の種類組成を持ちます。私たちの予備的なデータは、MIME がホスト筋におけるドナー細胞由来筋形成を促進することが示唆されました。

<table><tbody><tr><td>NSG-GFP mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Stock #021937</td><td>Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein</td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)&amp;nbsp;</td><td>Stock #000664</td><td>Control donor mice</td></tr><tr><td>Tabletop isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Item #901801</td><td>Inhaled anesthesia system</td></tr><tr><td>Magic depilatory crea</td><td>Softsheen Carson (New York, NY)</td><td>N/A</td><td>Razorless hair removal cream</td></tr><tr><td>4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures</td><td>Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>SUT106631</td><td>Guiding sutures for donor tissue</td></tr><tr><td>VetBond veterinary tissue adhesive</td><td>3M (Maplewood, MN)</td><td>Catalog #1469Sb</td><td>Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure</td></tr><tr><td>Barium chloride&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>Product #R0854000-500A 854-16&amp;nbsp;</td><td>Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration</td></tr><tr><td>Deltaphase isothermal gel heating pad&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>&amp;nbsp;Item #39DP</td><td>Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia</td></tr><tr><td>HM525NX cryostat&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog #HM525NX&amp;nbsp;</td><td>Cryostat to make frozen sections of muscle</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)</td><td>Catalog Number: H-1000</td><td>Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples</td></tr><tr><td>Rabbit anti Desmin Antibody</td><td>Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)</td><td>RB9014P</td><td>Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog#: A-21069</td><td>Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Seracare (Milford, MA)</td><td>Catalog #5930-0006 or 71-03-01</td><td>Reagent for fluorescent labeling of nuclei</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 microscope</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)&amp;nbsp;</td><td>Product #Axio Scope.A1</td><td>Light and fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe Systems (San Jose, CA)</td><td>Photoshop CS4</td><td>Imaging Software for perform image tiling</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td>Image J for Windows 64-bit Operating System</td><td>Imaging Software for quantitative fluorescence analysis</td></tr></tbody></table>

minimally invasive muscle embedding (mime) - a novel experimental technique to facilitate donor-cell-mediated myogenesis

骨格筋では、住民組織、筋肉繊維生成 (筋原性) 衛星細胞 (SCs)、右の条件の下で新しい筋繊維を形作ることができるため再生能力を所有しています。SCs は筋肉ティッシュから収穫されることが、培養結果の筋細胞は筋ホスト筋へ移植された時の促進に非常に効果的なありません。外科的ホスト筋を公開し、ドナーの筋肉組織、またはそのホスト筋に scs を活用した孤立した筋線維のセグメントを移植、筋芽細胞移植と比較してより良い筋を推進しています。最小侵襲性筋埋め込み (MIME) 呼んで新たな手法を開発しました。針トラックを介してドナー筋肉組織の一部を描画し、ホスト筋に埋め込んで、それをホスト筋の SCs のソースとして可能性がありますドナー組織を残して、ホスト筋を通して手術針を渡す、MIME が含まれます。ここで我々 はその細胞のすべての緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表す免疫不全マウス モデルで MIME を実行する手順の詳細について説明します。ホスト マウスに免疫不全がドナー組織の免疫拒絶反応のリスクを低減し、GFP 発現によりホスト筋線維 (GFP +) とドナー細胞由来筋線維 (GFP-) を簡単に識別。パイロット データは、ホスト マウス脛骨前方 (TA) 筋にドナー マウスから総指伸筋 (EDL) 筋をインプラントに MIME を使用ことができることをお勧めします。(塩化バリウム、BaCl2) myotoxin を MIME 後ホスト筋肉に注入すると、約 5%、26%、26% 単一のホスト TA に繊維の 43% と、ホスト筋におけるドナー細胞由来筋形成の証拠があることも示唆します。筋肉ないホスト貢献、最小限のホストの貢献、適当なホストの貢献最大ホスト貢献のそれぞれを示します。

3 日後 MIME でドナー MIME の注入は、EDL はホスト TA 筋肉コンパートメント (図 2 a-C) 含まれています。予想通り、ドナー マウスから TA 筋肉の断面積に師事蛍光光学系、GFP (図 2 D) 表現しないので緑の蛍光性を示さない。対照的に、ドナー組織が注入されないホスト マウス脛骨筋の断面表示均一蛍光グリーン TA の筋線維で繊維エクスプレス GFP (図 2 e)。ドナー筋肉組織を持つ MIME による注入筋肉の断面積、ホスト筋線維 (GFP +) とドナー筋線維 (GFP-) 間の分界のラインがあります。図 2Eで図 2 D-Fに示すように視野の位相コントラストの画像が表示されます '-F' 、筋線維の領域の存在が実際にことを提案する GFP がないです。信号。
14 日後 MIME と BaCl2注入、残っている TA 筋肉のセクション ラベルまたはデスミン (図 3)、抗体が付いていますシリアル クロスを研究することによって GFP 信号がすべての筋肉繊維によって表されることを学習、(実行可能な筋線維を検出する赤いデスミン ラベリング) MIME 処理の筋肉ではなくホスト マウスから未処理の筋肉。MIME と BaCl2注射ホスト TA 筋、ドナー細胞由来筋 GFP の探索可能なシグナルを示さない多くの desmin(+) 筋線維の存在から明らかである (図 3-D 3 C' -D')。ホストとドナーの筋細胞の可能性の融合から生じるキメラの筋線維は、これらの繊維が出展した GFP 蛍光の中程度のレベルに低で検出できます。多数のキメラの繊維は、ドナー SCs が数百ミクロン ホスト筋の下腿内に移行することができることを示唆 TA 筋全体の直径に表示されます。図 3Eに GFP + 繊維の定量を示します。図 4は、MIME + BaCl2扱われる TA の筋肉全体のシリアルの断面積の高倍率画像を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig1.jpg"> 
図 1.最小限侵襲筋埋め込み (MIME) 関連する手順。 MIME は、全身麻酔下で実行されます。それは、リンゲル液にドナー筋 (ドナー マウス EDL) ~ 10 mg を配置し、その端点(A)に導く縫合糸を結ぶことを含みます。18 ゲージ針はホスト筋(B)の長い軸を通して渡され、ドナー組織針トラック(C)が引かれます。ドナー組織ホスト筋(D)に埋め込まれた左、ガイディング ・縫合糸の切り取り、および針穴が組織接着剤で密封されて (E)。封印された針の傷は、 (F)の矢印で示されます。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig2.jpg"> 
図 2.TA 筋の研究 MIME 後 3 日。 ホスト筋収集 MIME; 後 3 日ホスト TA (矢印; 注針A B)。さらにデータは、TA 筋肉コンパートメント (B ・ C) 以内に埋め込まれたドナー マウス EDL が落ち着いていることを確認します。TA 筋断面積を表示 3 日 NSG GFP TA 筋筋野生型脛骨筋(D)でない蛍光グリーン、NSG GFP TA 筋(E)、明るい蛍光グリーンとホストとドナー間の区別の蛍光画像後 MIME ((F))。D F で視野の位相コントラスト画像のとおり D'-f '、それぞれ。パネル F と F の赤い線 ' ホストとドナー組織間の分界のラインを示しています。スケールバー = 50 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig3.jpg"> 
図 3.TA 筋の研究 MIME 後 14 日。 14 日後の MIME データを収集しました。赤い信号、デスミンの蛍光ラベリングから (デスミンの肯定的な信号は、筋線維が実行可能なを表します)、青の信号は DAPI (汚れの核) から、緑の信号 GFP から。ほぼすべての筋線維は、コントロール脛骨筋 (右後肢) どおりホスト マウスから収穫、デスミン、これらの筋線維が実存し得ることを示唆している (A; 赤い信号) の肯定的です。また、DAPI 染色に基づいて、それは明らかにそのほぼすべての筋線維の筋の核、末梢に位置する健全な筋肉 (A; 青い信号) で予想されます。シリアル制御脛骨筋部は、ほぼすべての筋線維が明るい緑色、GFP の肯定的なことを意味している、表示します。MIME + BaCl2 -脛骨筋 (左後肢) を扱われるドナー細胞筋検出 GFP 蛍光を示さない多くの desmin(+) 筋線維の存在から明らかである (C D、C'-D')。中程度の GFP 蛍光 (キメラ筋線維) に低 Desmin(+) 筋線維が MIME TA 筋の下腿内移行が促進でき SCs ドナーを使用することを示唆している TA 筋肉全体の直径にわたって存在ドナー細胞由来筋。A'-D' A +の青色のボックス内の領域の高倍率画像GFP(+)、中心核の繊維の定量がEで表示されます。スケール バー 50 μ m、100 μ m (A ~ D) = (A'-D')。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" s alt="Figure 4" class="xfigimg"></img alt="Figure 4" class="xfigimg" s>rc="/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg"/> 
図 4.広範な被害と再生の証拠 MIME と BaCl2注入後 14 日。 高倍率は、MIME + BaCl2扱われる TA の筋肉全体のシリアルの断面が掲載されています。データ表示、多く適度である筋線維または強く GFP + が中心部にある核 (A B; 赤デスミンからの信号は、a 青い信号は DAPI、B の緑色の信号は GFP から)。これらのデータは、その変性を示唆していると再生後 BaCl2注入は GFP 発現を影響しません。このコンテキストで MIME + BaCl2扱われる脛骨筋、ほとんどは GFP 発現の中心核の筋線維の存在を示唆しているこれらの繊維が筋 (または再生) の可能性が高い結果であることから重要な貢献をGFP - 筋細胞。これらの観察は、選択したフィールド (C Fの高倍率画像でさらに確認できます。C、D、および E および F、シリアル クロス セクションから領域が重なってA のそれらの領域の場所を示す画像の境界線の色と B)。スケール バー = 100 μ m (A B) と (C F) 50 μ m。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

最小侵襲性筋埋め込み (MIME)、骨格筋組織は筋細胞ドナー細胞の筋に注入時を容易にすることができますを含む証拠に基づいていると呼んで実験手法について述べるホストの筋肉。

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

7.7K ビュー.  Wayne State University. 最小侵襲性筋埋め込み (MIME)、骨格筋組織は筋細胞ドナー細胞の筋に注入時を容易にすることができますを含む証拠に基づいていると呼んで実験手法について述べるホストの筋肉。

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Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

生物工学

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

医学

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

遺伝学

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

生物学

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

発生生物学

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...