骨格筋再生を調節するヒト筋肉前駆細胞を分離することで、ドナーの変動を維持しながら再生プロセスの根本となるプロセスを調査することができます。この技術は、少量の組織と少数の細胞を用いたその表向きの分析から、ヒトの筋肉前駆細胞の大きな収量を得ることを可能にする。この方法は、ヒトの筋肉前駆細胞を分離して増殖および分化能力を追跡し、これらのデータを骨格筋再生プロセスに関連付けるために特別に設計されています。
この非常に簡単な技術の最も困難な側面は、すべてのステップが細胞の収率と純度を最適化するために再現的に行われることを保証することです。セルの分離を成功させるためには、複数の手順を完了する必要があります。いくつかの手順は、視覚的に観察されている場合は理解しやすいです。
生検組織からヒトの筋肉前駆細胞を分離するには、無菌状態下で無菌ペトリ皿に筋肉組織を入れ、滅菌メスを使用して組織を1ミリメートル立方体にミンチする。すべての組織がミンチされたら、PBSの10ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに部分を移し、組織を邪魔することなく上澄を慎重に吸引する前に、組織が重力によって沈降することを可能にする。ちょうど実証したように断片を2回目に洗浄した後、PBSを低グルコースダルベックの改変イーグル培地の10ミリリットルに置き換えます。
組織が落ち着いた後に上清を取り除き、3ミリリットルの消化培地で再懸濁する。1ミリリットルの血清学的ピペットで10分ごとに筋肉片のトリチュレーションで、30分間摂氏37度で組織を置きます。インキュベーションの最後に、83マイクロリットルの追加消化媒体と24マイクロリットルのディスパーゼ溶液をサンプルに加え、均一なスラリーが達成されるまで広孔ピペットチップで5〜10分ごとに組織をトリチュレートします。
均一なスラリーは、ヒトの筋肉前駆細胞の最大回復に重要です。スラリーが標準的な1,000マイクロリットルのピペット先端を通過しない場合は、消化を続けます。Pax7陽性細胞を単離するには、プロトコルに従って細胞を染色し、ゲートする。
1平方インチ当たり20ポンドの圧力で100マイクロメートルのノズルを備えたフローサイトメーター上のCD56、CD29ダブルポジティブヒト筋肉前駆細胞を、蛍光活性化細胞選別バッファーの300マイクロリットルクッションを含む回収管にソートします。その後、並べ替えられたヒト筋肉前駆細胞を、10倍の4番目の細胞に3.5倍の4番目の細胞で事前に温めた成長培地を含むコラーゲンコーティングされた24ウェルプレートに播種する。合流スキャンを実行するには、プレートをイメージングサイトメーターにロードし、[新規スキャンの作成]および[プレートカテゴリ]、[プレートプロファイル]、[プレートID]を選択します。
背景と比較してセルが白く表示されるフォーカス平面を見つけ、[手動登録]を選択します。マウスを使用して、スキャンする必要があるすべてのウェルをハイライト表示し、[スキャンの開始] を選択します。ウェル領域全体が自動的にスキャンされます。
プレートとセルタイプに最適な解析設定を選択し、[解析開始]を選択します。イメージングサイトメーターを使用して、最初に合流を測定します。次に、画像サイトメーター上の細胞を数え、各ウェルの培地を200マイクロリットルの染色溶液に交換する。
摂氏37度で15分後、染色液を新鮮なハムのF12の100マイクロリットルに交換してください。プレートをイメージングサイトメーターに戻し、[アプリケーション]で[細胞生存率]および[ライブデッドトータル]を選択します。ライブチャンネルは明視野画像になり、デッドチャンネルはヨウ化プロピジウム染色を表示し、トータルチャンネルはHoechst 33342染色になります。
[フォーカス設定] で、[自動登録] をクリックします。[合計] チャネルで、チャネルを青に設定します。[フォーカスの検索]を使用して核にフォーカスを移動し、[オフセットを設定]をクリックしてフォーカスを選択します。
Dead チャネルの下で、チャンネルを赤に設定し、[フォーカスを探す] を使用して、デッド セルにフォーカスを移します。[オフセットの設定] をクリックしてフォーカスを選択し、[スキャンの開始] を選択してスキャンを開始します。次に、プレートとセルタイプに適した解析パラメータを選択し、[解析開始]を選択して解析を開始します。
分析が完了したら、分析がセルを適切にカウントしたことを視覚的に確認します。スキャンと分析が満足のいく場合は、プレートをインキュベーターに戻し、それ以外の場合は分析パラメータを再スキャンまたは変更します。ヒトの筋肉前駆細胞は、死んだ細胞または破片を排除するために、側および前方散乱領域に基づいて最初の格子イベントによって同定され、続いて7-AADに対して陰性であり、したがって生存可能である細胞のみを選択することによって同定することができる。
CD56およびCD29細胞表面マーカーの両方に陽性である細胞は、ヒトの筋肉前駆細胞集団を表す。ヒト筋肉前駆細胞は、それらのPax7発現によっても同定することができる。実際、Pax7はFACSの後の総人口で濃縮され、複数の通路を通って維持される。
ここでは、代表的な合流スキャンが示されている。緑色のアウトラインは画像サイトメーターによって生成され、選択した分析設定に基づいてイメージングサイトメーターがどのように合流を決定するかを示しています。異質性と核数はドナー間で一般的です。
この異質性を発見し、正確に特徴付けるのは、イメージングサイトメーターの重要なアプリケーションです。しかし、ユニークなドナーからの合流点測定と核数は非常に相関性が高い。ヒト筋肉前駆細胞は、ミオチューブを形成するように分化し、それらの胚性ミオシン重鎖発現によって区別され得る。
すべてのドナーから同じ集団の細胞を単離するためにフローサイトメーター上の格言パラメータを選択する際に一貫性を保ることが重要です。一度単離されると、ヒト筋肉前駆細胞は、ヒト筋肉前駆細胞の増殖および分化のユニークな代謝要件を特定するなど、複数の目的に使用することができる。ヒトの筋肉前駆細胞の分離により、ヒトおよびマウスの筋肉前駆細胞における細胞表面マーカー発現の違いが判別された。
