この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌協会、クヌート・アンド・アリス・ヴァレンベルグ財団（KAW）、およびフォア・ヴェストラゴタランセリージョン・オブ・ザ・イヤーによって支持された。

CLLサンプルを収集するための倫理的承認は、2007年5月21日から、次の登録番号：EPN Gbg dnr 239/07である。すべてのCLL患者は最近改訂された基準8に従って診断され、サンプルは診断時に収集された。研究の患者は、書面による同意が得られた後、スウェーデン西部の様々な血液学部門から含まれていた。この研究では、白血病細胞の腫瘍パーセンテージが70％以上であるCLL末梢血単核細胞（PBMC）試料のみを選択した。 1.準備<ol><li>製造者の指示に従って、市販の単離キット（ 材料表参照）を用いて、CLLおよび正常な健康な末梢血サンプルからのDNA抽出のためのPBMCを単離する。 </li><li>オートクレーブ1.5mLチューブ。メチル化DNA結合キットのすべての試薬を解凍します（ 材料表を参照）。&lt;/ li&gt; <li>ビーズを洗浄し、キットで提供されるMBDタンパク質を希釈するために、DNaseフリーの水を使用して、キットが提供する5xストック洗浄バッファーから1xビーズ洗浄バッファーを調製します。 </li><li>以下の項目を事前に入手または準備する：3M酢酸ナトリウム、無水エタノール、およびDNA沈殿のための70％エタノール（ 材料表 ）。 </li></ol>ゲノムDNA抽出および超音波処理<ol><li>市販のDNA抽出キット（ 材料表 ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、患者および正常なPBMCサンプルからゲノムDNAを単離する。 260nmの分光光度計を用いてゲノムDNAを定量する。 注：DNA抽出カラムの容量は5~600万個の細胞です。したがって、5百万個以上のセルを持つサンプルに複数のカラムを使用することが重要です。 100μLの10mM Tris EDTA（TE）緩衝液を合計して等量でDNAを2回溶出する。メチルで使用されるMBD-ビオチンタンパク質MBDシークエンシングのためのminerキットは一本鎖DNAに結合しません。したがって、溶出したDNAを凍結または4℃で保存して二本鎖の性質を保持することは非常に重要です。 </li><li> TEバッファー（pH 8）を用いて各サンプルのゲノムDNA 5μgを合計200μLに希釈し、25 ng /μLの最終濃度を与えます。 </li><li>合計30サイクル（1サイクルにつき30秒間および30秒間オフ; 5サイクルごとに、サンプルを底部に集めるためにチューブを短時間回転させる）のために、超音波処理器（ 材料表 ）を用いて特別に設計されたチューブで超音波処理を行う。 注：これは150 bp〜300 bpの範囲の断片化したDNAを生成しますが、これはこのプロトコールに最適です。 </li><li> DNA電気泳動イメージング装置を使用して、市販のプレキャスト2％アガロースゲル上で1μLの断片化DNAサンプルおよびDNAサイズラダーを実行することによって、MBD配列決定の次のステップに進む前に、すべてのサンプルの超音波処理範囲をチェックする。視覚化する彼は標準的なUVトランスイルミネーターを使用しています。 </li></ol> MBD-ビオチンタンパク質との結合前のビーズ調製<ol><li>キットによって提供されるストックチューブから磁気ストレプトアビジンビーズを再懸濁し、均一に懸濁液を得るために上下に穏やかにピペッティングする。ビーズをボルテックスしたり、乾燥させたりしないでください。 </li><li> 50μLのビーズ（断片化したDNAサンプル5μgごとに）を別個の清潔で標識された1.5mLチューブに入れる。 50μLの1×ビーズ洗浄バッファーを加えて最終容量100μLにします。 注：ビーズを洗浄するために0.5 mLのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ストライプを使用する場合は、キットプロトコールで述べたように、チューブあたり約150〜200μLの洗浄バッファーを使用します。しかし、1.5mLチューブの場合は、ビーズ洗浄のために、チューブあたり少なくとも250μL〜300μLの洗浄バッファーを添加してください。 </li><li>チューブを磁気スタンド上に1分間置いて、すべての磁気ビーズをチューブの内壁に集中させる磁石に面している。 200μLピペットを使用して、ビーズに触れることなく、液体を取り出します。 </li><li>チューブを磁気スタンドから取り出し、1×ビーズ洗浄緩衝液250μLを加え、ビーズをピペットで静かに混合する。 </li><li>すべてのサンプルについてステップ3.3と3.4を少なくとも4〜5回繰り返し、最後に1xビーズ洗浄バッファー250μLに再懸濁する。氷上に置いておいてください。 </li></ol> MBDビオチンタンパク質を洗浄したビーズに結合させる<ol><li>チューブを分離するために35μLのMBDタンパク質（DNAサンプル1μgにつき7μL）を添加し、1倍ビーズ洗浄バッファーを使用して全量を250μLにします。 </li><li>洗浄したビーズ250μLに250μLの希釈したMBDタンパク質を添加し、室温で1時間、エンドツーエンド回転させる。 </li><li> ビーズおよびタンパク質を1時間混合した後、磁気ストレプトアビジンビーズで結合したMBDタンパク質ビオチンを洗浄する。 <ol><li>チューブを磁気スタンド上に1分間置き、t彼はピペットを使ってビーズに触れることなく液体です。 250μLの1×ビーズ洗浄バッファーを添加し、チューブを室温で5分間回転ミキサー上に置く。 </li></ol></li><li>再度4.3.1ステップを2回繰り返し、洗浄したMBDビオチンビーズを1xビーズ洗浄バッファー200μLに再懸濁し、ビーズをメチル化DNA捕捉のために準備する。 注：このようにして2-3回洗浄すると、バックグラウンドの非結合MBDタンパク質ビーズがすべて除去され、MBDタンパク質結合ビーズと断片化ゲノムDNAとの効率的な結合が改善される。 </li></ol> 5.断片化されたゲノムDNAを有するMBD-ビオチンビーズの結合<ol><li>清潔な1.5 mLのDNase-freeチューブに、100μlの5×ビーズ洗浄バッファーと180μlの断片化ゲノムDNAを加えます（ステップ2.3）。 DNaseを含まない水を用いて最終容量を500μLにする。 </li><li>断片化したゲノムDNAの残りの20μLに380μLのDNaseフリー水を加え、凍結する。これらのサンプルを入力DNとして使用するAは、最終的に溶出されたメチル化DNAサンプルとともに後にそれらを制御し、沈殿させる（ステップ7.1参照）。 </li><li>洗浄したMBDビオチンビーズを含むチューブ（ステップ4.4）を磁気スタンド上に1分間置き、ビーズを乱さずに液体を除去する。ビーズ洗浄バッファーで希釈した500μLの断片化ゲノムDNAを添加する。 </li><li>すべてのチューブをパラフィンフィルムでしっかりと密封し、4〜8℃で終夜の回転スタンド（8〜10rpm）に一晩放置する。 注：DNAとビオチン - ビーズの結合反応は室温で1時間行うことができますが、4℃で一晩放置すると最終的なメチル化DNAの回収率を向上させることができます。 </li></ol> 6.非結合DNAの除去およびビーズからのメチル化DNAの溶出<ol><li> DNAおよびMBDビーズ結合反応の後、チューブを磁気ラック上に1分間置き、すべてのビーズをチューブの内壁に集中させる。 </li><li>触らずにピペットで上清を除去する。この結合していないDNAサンプル画分を氷上に保存する。 </li><li>ビーズに200μLの1×ビーズ洗浄バッファーを加え、室温で3分間回転スタンドにチューブを置きます。磁気スタンドにチューブを置き、液体を除去する。残りの未結合DNAを除去するためにもう2回洗浄を繰り返す。 </li><li>最終洗浄後、DNAを溶出させるためにキットに含まれている200μLの高塩溶出バッファー（2,000mM NaCl）を加えます。 </li><li>チューブを回転スタンド上に室温で15分間置く。磁気スタンド上に1分間置き、ピペットを使用して上清を注意深く新しい清潔な1.5 mLチューブに移す。 </li><li> 200μLの高塩溶出バッファーを添加し、チューブを室温で15分間回転させて溶出を繰り返します。最初の溶出液200μLを含む同じチューブに2回目の溶出液を加えます。 注：最終溶出されたDNAの最終的な400μLは、エタノール沈殿の準備ができており、精製された次世代シーケンシングに適したDNA </li></ol> 7.エタノール沈殿とメチル化DNAの濃縮<ol><li> 1μLのグリコーゲン（20μg/μL;キットに含まれています）を加えます。 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）40μL;氷冷した無水エタノール800μLを溶出したDNA400μLとステップ5.2で調製した400μLの入力DNAサンプルに加えた。 </li><li>ボルテックスしてチューブをよく混合し、-80℃で一晩インキュベートする。 </li><li>チューブを12,000 xg（最高速度）と4℃で遠心分離する。ペレットを乱すことなく上清を慎重に捨て、70％エタノール500μLを添加し、チューブをボルテックスする。 </li><li> 4℃で15分間最高速度で再度遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く除去する。室温で1分間最高速度でチューブを遠心分離し、ピペットチップを使用して残留エタノールを完全に除去する。 </li><li>室温で5分間ペレットを空気乾燥させる。成人。 DNAペレットに10μLのDNaseフリー水を加えます。メチル化DNA定量（ステップ7.6）、MBDシーケンシング（ステップ7.7）、および分析（セクション8および9）に進む。 </li><li>製造元の指示に従って、市販の蛍光定量キット（ 材料表参照）を使用して、回収したメチル化DNAサンプルを定量します。 </li><li>注：このプロトコールを使用して、30〜50ngの最終DNAを各サンプルから回収した。 DNAサンプルは、下流のライブラリー構築とハイスループットMBDシーケンシングのためにドライアイスで送る準備ができています</li><li>参考文献9に記載されているように、市販のプラットフォーム（ 材料表 ）を用いてDNAライブラリーの構築および高スループットMBD配列決定を行う。 注：最終的なメチル化DNAの初期品質管理のために、すべてのサンプルについて50-bpペアエンド配列を使用してライブラリー調製を行います。シーケンシング後の品質管理のために生データを処理する。ステップ8.1で詳述し、以下に説明するように（ステップ8.2〜9.6）、バイオインフォマティクスアプローチおよび統計的方法を用いてそれをさらに処理する。 </li></ol> 8.バイオインフォマティクス分析法1：CLL関連の分化メチル化領域（cllDMRs）の同定<ol><li> Trimmomatic 10やCutadaptなどの利用可能な品質管理ツールを使用して、取得した49-bpの読み取り値（FASTQ形式）を清掃します。 FastQCツールキットを使用して、切り取られた読み取りの品質をクロスチェックします。 java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP：adapters.fasta：2：30：10 </li><li> きれいにされたFASTQファイルを、短い読み込みゲノムアライナBowtieと参照ゲノム11に対して整列させる。以下のようにパラメータを指定します。 <ol><li>最大2つの不一致を許容します（Bowtieパラメータ： -v 2）。 </li><li>報告書を読み込みごとに6つの最適なアラインメント（Bowtieパラメータ： -m 6）に制限して制御するマルチマッピング読み取りの場合 bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq&gt; SAMPLE.sam 注：SAMtoolsを使用して、整列後の個々のサンプルに対して生成されたSAMファイルをBAMに変換します。 samtoolsビュー-bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam </li></ol></li><li> CLLサブグループ12からの濃縮/メチル化領域を予測するために、整列したサンプル（BAM）上のChIP-Seq（MACS）ピーク呼出しのモデルベースの分析を用いる。 注：比較I：対照群としてInputサンプルを使用し、処置群として正常およびCLL患者サンプルの両方を使用する。このステップは、すべての負のピーク（入力/バックグラウンドが豊富なピーク）を収集することです。比較例II：対照群として正常試料群を用い、治療群としてCLL患者試料群を使用する。得られた陽性ピークはCLL過メチル化領域であり、陰性ピークは正常または示差メチル化領域（DMR）よりもCLL低メチル化領域である。 macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs </li><li>比較の削除BEDtoolsを使用して、差別的にメチル化された領域（DMR）のピークをバックグラウンドで除去します。 bedtools subtract -a &lt;CLL_enriched_regions&gt; -b &lt;Input_enriched_regions&gt; </li><li> DMRに富む反復要素（SINE-Alu、LINE など ）の割合を予測します。 <ol><li> fastacmdを使用して、参照ゲノムHG19からの染色体座標によるDMRのFASTA配列を抽出する。 fastacmd -d HG19_genome.fa -s染色体-L開始、終了-l50000&gt; DMRs.fasta </li><li> RepeatMaskerコマンドラインツールを使用して、DMRのFASTAシーケンスに存在する繰り返し要素の割合を予測します。 RepeatMasker -gc -gccalc -s -species人間-html DMRs.fasta </li></ol></li><li> Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot;を使用して予測されたDMRに利用可能なEnsembl [PMC4919035] oをアノテートするr Gencode [PMID 22955987]転写注釈（タンパク質コードと非コード転写物）。 annotatePeaks.pl DMRs.bed &lt;GENOME&gt; -gtf &lt;EnsemblまたはGencode GTF&gt; 注：これは、異なる遺伝子領域（ すなわち、プロモーター、エキソン、イントロン、3&#39;UTRおよび5&#39;UTR）および遺伝子間領域にわたるピークの分布に関する情報を提供する。 DMRに関連する転写物または遺伝子は、示差的にメチル化された遺伝子（DMG）と呼ばれる。 </li><li> CLL DMG（タンパク質コード遺伝子のみ）によって強化された機能を検索するには、更新された機能データベースまたは最新の機能データベースを使用した濃縮ツールを使用してください。 注記：Functional Annotation（GeneSCF）に基づくGene Set Clustering 14は、更新されたKEGGおよびGene Ontologyを参照データベースとして使用する、機能的濃縮分析のためのリアルタイムベースのツールです。 </li></ol> 9.バイオインフォマティクス分析方法2：CLL関連の識別が著しく異なる有機的にメチル化された領域（clI sigDMR&#39;s） <ol><li>メソッドI（セクション8）からステップ8.1-8.5を実行し、ステップ9.2〜9.6で説明した利用可能なツールを利用してリードカウントベースの微分濃縮分析を使用して、分析パイプラインにもう1つのレベルの統計情報を追加します。 </li><li> 「Subread」パッケージ15の 「featureCounts」を使用して、NormalおよびCLL患者サンプルの個々のピークまたはDMRにマップされた読み取りの数を数えます。 subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam 注記：マッピング品質フィルタを導入して、品質の悪い読み取り値を定量化しないようにすることができます（ -Q 30など）。この手順では、取得したDMRのSAFファイルを準備します。 SAFファイル形式の詳細については、このリンクhttp://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/を使用してください。 </li><li> Normalの個々のピークの読み取り回数を含むRAW読み取りカウントテーブルを使用します。d入力16としてedgeR内の患者サンプルグループをCLLする。 注：正常対CLL患者のサンプルグループを比較してsigDMRを検索する。微分濃縮分析を行うには、詳細な手順についてはedgeRのガイドに従ってください（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf）。 </li><li> edgeRで予測される誤検出率（FDR）とログフォールド変化を使用してsigDMRをフィルタリングする16 。 </li><li> Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot;を使用して予測されるsigDMRに、利用可能なEnsemblまたはGencode転写アノテーション（タンパク質コーディングおよび非コード転写物）を注釈する。 annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &lt;EnsemblまたはGencode GTF&gt; -CpG 注：これは、異なる遺伝子領域（ すなわち、プロモーター、エキソン、イントロン、3&#39;UTRおよび5&#39;UTR）および遺伝子間領域にわたるピークの分布に関する情報を提供する。 siに関連する転写産物または遺伝子gDMRはsigDMGと呼ばれる。 </li><li> CLL sigDMG（タンパク質コード遺伝子のみ）により強化された機能を見つけるために、更新された機能データベースまたは最新の機能データベースを持つ濃縮ツールを使用してください。 注：機能的濃縮分析のリアルタイムツールの1つであるGeneSCFは、KEGGおよびGene Ontologyを参照データベースとして使用します。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq（メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング）およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃...

近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ（マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む）を開発した。 異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病（CLL）を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた、 &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得られ、多数のサンプルを分析するのに最適なオプションです。しかしながら、この方法は、ゲノム5,6中の 5mCレベルと5hmCレベルとの間の改変を区別することができない。さらに、マイクロアレイに基づく方法は完全なcを提供しないゲノムの超過。 私たちの研究室7の最近の研究では、重亜硫酸塩変換ではなく、免疫沈降に基づく方法を用いて、CLL患者および正常な健常対照における全体的な規模で高度にCpGが豊富な差別的にメチル化された領域を同定した。 Inmethyl-CpG結合ドメイン（MBD）の次世代配列決定（MBD-seq）では、二本鎖断片化DNAの濃縮はCpGメチル化の程度に依存する。この方法は、重亜硫酸塩変換法の欠点を克服することができ、バイアスのないPCRおよびPCR非依存的な方法でCpGメチル化のゲノムワイドカバレッジを提供することもできる。さらに、重亜硫酸塩変換に基づくマイクロアレイ法とは異なり、MBD-seqを使用して、長い散在性核要素（LINE）、短い散在核要素（SINE）、長い末端反復配列（LTRS）などの反復要素のメチル化状態を分析することができる。 等 。しかしながら、亜硫酸水素塩の変換方法と比較して、MBD-seqプロトコルは比較的大量の入力DNAを必要とする。また、配列決定の質およびデータは、使用される抗体の特異性、親和性および品質に依存する。 現在の研究では、次世代シーケンシングのためにメチル化DNAを濃縮するための詳細なMBD-seqプロトコルについて説明しています。これは市販のメチル化DNA結合濃縮キット（ 材料表に記載されている）と、メチル化シーケンシングデータを視覚化して解釈してCLL特異的なハイパーサイトおよびハイポメチル化領域を同定する計算パイプラインを使用しています。基本的に、この方法は、メチル化CpGで富化されたDNAを抽出するためのメチル化CpGとのヒトMBD2タンパク質相互作用のMBDの能力を利用し、メチル化DNAのハイスループットシーケンシングが続く。

<table><tbody><tr><td>Dneasy Blood and tissue kit</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep solution</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td>1114544</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor standard sonication device</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX bioruptor tubes 1.5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase safe imager combo kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% Agarose gels</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Methylated DNA enrichment kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Tube Shaker/Rotators</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanool</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse free water</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA precipitant (3M sodium acetate)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 mL tubes</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Hiseq2000 Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&amp;nbsp; Bath</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotater</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comprehensive dna methylation analysis using a methyl-cpg-binding domain capture-based method in chronic lymphocytic leukemia patients

癌における長い非コードRNA（lncRNA）の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病（CLL）において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン（MBD）タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング（MBD-seq）に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ（5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル）に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子（cllDMG）が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。

MBD-seqは最近、CLL患者および一致した正常な健常対照に対して行われ、CLL特異的差次的に過剰および低メチル化された遺伝子を同定した7 。 CLLおよび正常な健康サンプルから生成されたデータを分析するために使用される実験的および生物情報パイプラインを図1Aおよび1Bに示す 。これらの分析は、IGHV変異およびIGH...

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Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

comprehensive-dna-methylation-analysis-using-methyl-cpg-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K ビュー.  Gothenburg University. この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。 

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of DNA samples. It is resourceful, requires small amounts of DNA, and takes around 4&#8211;5 h of hands-on work. In the presented technique, DNA samples are first denatured then hybridized to probes that target DNA at either methylated or reference sites as a control. Hybridized DNA is separated into parallel reactions, one undergoing only ligation and the other undergoing ligation followed by HhaI-mediated digestion at unmethylated GCGC sequences. The resultant DNA fragments are amplified by PCR and separated by capillary electrophoresis. Methylated GCGC sites are not digested by HhaI and produce peak signals, while unmethylated GCGC sites are digested and no peak signals are generated. Comparing the control-normalized peaks of digested and undigested versions of each sample provides the methylation dosage ratio of a DNA sample. Here, MSPA is used to detect the effects of osteosarcoma-derived extracellular vesicles (EVs) on the methylation status of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) in mesenchymal stem cells. LINE-1s are repetitive DNA elements that typically undergo hypomethylation in cancer and, in this capacity, may serve as a biomarker. Ultracentrifugation is also used as a cost-effective method to separate extracellular vesicles from biological fluids (i.e., when preparing EV-depleted fetal bovine serum [FBS] and isolating EVs from osteosarcoma conditioned media [differential centrifugation]). For methylation analysis, custom LINE-1 probes are designed to target three methylation sites in the LINE-1 promoter sequence and seven control sites. This protocol demonstrates the use of MSPA for LINE-1 methylation analysis and describes the preparation of EV-depleted FBS by ultracentrifugation.

Described here is the use of a methylation-specific probe amplification method to analyze methylation levels of LINE-1 elements in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Ultracentrifugation, a popular procedure for separating extracellular vesicles from fetal bovine serum, is also demonstrated.

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

がん研究

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid storage processes contributing to the development of the disease. We demonstrate a complete protocol from selection to epigenetic data analysis of patients with and without obesity. All steps from the protocol were tested and validated in a pilot study. 32 women participated in the study, in which 15 individuals were classified with obesity according to Body Mass Index (BMI) (45.1 &#177; 5.4 kg/m2); and 17 individuals were classified without obesity according to BMI (22.6 &#177; 1.8 kg/m2). In the group with obesity, 564 CpG sites related to fat mass were identified by linear regression analysis. The CpG sites were in the promoter regions. The differential analysis found 470 CpGs hypomethylated and 94 hypermethylated sites in individuals with obesity. The most hypomethylated enriched pathwayswere in the RUNX, WNT signaling, and response to hypoxia. The hypermethylated pathways were related to insulin secretion, glucagon signaling, and Ca2+. We conclude that the protocol effectively identified DNA methylation patterns and trait-related DNA methylation. These patterns could be associated with altered gene expression, affecting adipogenesis and lipid storage. Our results confirmed that an obesogenic lifestyle could promote epigenetic changes in human DNA.

The present study describes the workflow to manage DNA methylation data obtained by microarray technologies. The protocol demonstrates steps from sample preparation to data analysis. All procedures are described in detail, and the video shows the significant steps.

DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

生物学

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DNA Methylation Analysis

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the methylation of clusters of methylation sites, called &#8220;CpG islands&#8221;, near promoters and other gene regulatory elements may contribute to the stable silencing of genes, for example, during epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation. At the same time, aberrant CpG methylation has been shown to be associated with cancer.In this video, the biological functions and mechanisms of DNA methylation will be presented, along with various techniques used to identify methylation sites in the genome. We will then examine the steps of bisulfite analysis, one of the most commonly used methods for detecting DNA methylation, as well as several applications of this technique.

DNA メチル化解析

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Source: Jia, Z. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55565">A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes&#39; phenotype at various stages in culture.