DNAメチル化は、最も研究されたエピジェネティックシグネチャの1つです。多くの癌は、異常な遺伝子発現および他のゲノム異常に関連するDNAメチル化レベルの変化によって特徴付けられる。長く介在する核元素は、通常はメチル化のレベルが高い反復的なトランスポス可能なゲノム配列です。
しかし、癌では多くの場合、過剰メチル化され、活性化し、染色体不安定性を引き起こし得る。本研究では、骨肉腫由来の細胞外小胞を用いた間葉系幹細胞を治療し、がんEVがMECにおけるLINE-1メチル化に影響を及ぼすかどうかを調べた。哺乳類細胞培養培地の不可欠な構成要素であるウシ胎児血清には、多数のウシ由来のEVが含まれています。
これらのEvsは、私たちの関心のある細胞からのEvsの分析を妨げるので、EVの分離のために細胞を成長させると、EV枯渇したFBSを使用することが重要です。超遠心チューブでFBSを取り、超遠心分離バケツに入れておきます。スイングローターにロードする前に、お互いの10ミリグラム以内にバケツのバランスを取ります。
ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で19時間100,000 Gで走ります。実行後、上清の明るい色の上層を慎重に収集し、50ミリリットルのチューブに移します。暗褐色のペレットはFBSのEVを含んでいるため、邪魔したり、パイプを入れたりしないでください。
上清を0.22ミクロンフィルターを通して新しい50ミリリットルチューブに入れる。このフィルター滅菌、EV枯渇したFBSは、EV分離のために細胞を成長させるときに細胞培養培地に添加できるようになりました。EVを使い果たした培地で増殖した骨肉腫細胞から、条件付き培地を収集する。
細胞および細胞の破片を除去するために、2500 Gで条件付き培地を摂氏4度で20分間遠心する。上清を超遠心チューブに移し、以前と同じバランスをとります。チューブを摂氏4度で2時間100,000Gで遠心分離します。
慎重に下部に1ミリリットルの周りに残して上清を捨てます.EVペレットを洗浄して再中断するために、約20ミリリットルのPBSをチューブとピペットに静かに加えます。チューブのバランスをとり、同じ設定で超遠心分離の別のラウンドを実行します。
慎重に上清を除去し、穏やかなピペット処理により、PBSの200マイクロリットルでEVペレットを再懸濁します。EVは低結合チューブに保管してください。精製されたEVは、ウェスタンブロッティング、ナノ粒子追跡解析、透過型電子顕微鏡法を特徴とする。
24ウェルプレートにウェルあたりプレート15,000 MSC。24時間後、古い培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄し、EV枯渇培地に変更します。OS-EV を含むセルをスケジュールされたタイム ポイントで処理します。
EV処理を停止した後、適切な方法を用いて細胞からDNAを抽出する。メチル化分析では、カスタムメイドのメチル化特異的プローブ増幅法を用いた。以前のように、PavicicなどによってカスタマイズされたLINE-1プローブを設計します。
メチル化プローブの場合、プロモーター領域内にHhaI制限部位を含む3つの配列を選択する。制御プローブの場合、残りのLINE-1配列からHhaI制限部位を欠いた7つの配列を選択します。TEバッファー中のDNAサンプル70ナノグラムを5マイクロリットルに希釈する。
サンプルを摂氏98度で10分間加熱し、摂氏25度まで冷却します。各サンプルに3マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーションミックスを加え、サーモサイクラーを実行してプローブをDNAにハイブリダイズできるようにします。室温で、各サンプルに30マイクロリットルのポストハイブリダイゼーションミックスを加えます。
10マイクロリットルを2チューブに移します。両方のチューブをサーモサイクラーに入れ、少なくとも1分間摂氏48度でインキュベートします。サンプルは摂氏48度ですが、チューブの最初のセットに10マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、2番目のチューブセットにライゲーション-消化ミックスの10マイクロリットルを加えます。
次のサーモチルカープログラムを実行します。次に、チューブを回転させ、同時にサーモサイクラーを摂氏72度に設定します。各チューブに5マイクロリットルのポリメラーゼミックスを加え、チューブをサーモサイクラーに入れます。
PCR プログラムを実行します。PCRプログラムの実行中に、サイズ標準の2.5マイクロリットルを含む1ミリリットルフォルマミドの溶液を調製します。この溶液の10マイクロリットルを光学96ウェルプレートの各列にピペットする。
PCR後、未消化のサンプルと消化したサンプルを、それぞれ1~100~200に希釈し、超純水で希釈します。希釈PCR製品を2マイクロリットルの96ウェルプレートに加えます。気泡を取り除くために15〜20秒間200Gでプレートを遠心します。
毛細管電気泳動によるサンプルのフラグメント分析を行う。毛管電気泳動を開くと、電気泳動解析ソフトウェアが得られます。サンプルを選択し、メニューから MLPA にパネルを設定します。
パネルをクリックし、コントロールDを押して、この設定をすべてのサンプルに適用します。同様に、すべてのサンプルのマイクロサテライトのデフォルトに解析方法を設定します。すべてのサンプルを選択し、緑の再生ボタンをクリックして分析を実行し、すべてのサンプルを選択してグラフボタンをクリックしてプローブのピークを視覚化します。
個々のピークの解像度を高くするには、ピーク領域を拡大します。LINE-1 プローブミックスのプローブに対応する 10 個のピークがすべてラベル付けされていることを確認します。[遺伝子タイプ] タブで、結果を CSV 形式でエクスポートします。
データ分析ソフトウェアで CSV ファイルを開き、データを列に並べ替えます。3つのメチル化部位のピークにサイズに基づいてラベルを付けます。残りの7つのピークは、制御プローブに対応しています。
ここでは、約117塩基対のサイズを持つLINE-1 2Mプローブピークを使用しています。各サンプルについて、7 つのコントロールのピークの合計ピーク領域を計算します。LINE-1プローブのピーク面積をこの合計で割ります。
各サンプルについて、消化されたサンプルの値を未消化試料の値で割って、メチル化投与量比を求める。ウェスタンブロッティング分析では、TSG101、HSP70、およびCD63に対して観測された信号を持つOS-EVの存在を確認しました。カルネキシンシグナルの不在は、EVサンプルが純粋であることを示した。
純度の追加の指標は、OS-EVサンプルに存在する様々なサイズの無傷の小胞を有するTEMで観察された。OS-EV粒子濃度及びサイズ分布をNTAにより測定した。EVの80%は50〜200ナノメートルのサイズ範囲であった。
ここでは、EV治療の異なる時点でのMSCからのLINE-1のメチル化投与量比を見ることができます。灰色の線は、ポイント 0 からのベースラインメチル化レベルを表します。ポイント3では、EVの投与後の平均メチル化投与量比の低下があり、それによりハイパーメチル化を示す。
このEVの過メチル化効果は、ポイント7ではあまり顕著ではありません。ここでは、メチル化分析のための単純で、高感度で、堅牢な手法を示しました。バイサルファイト変換を伴わない少量のDNAを必要とし、パラフィン埋め込みサンプルから単離されたDNAにも適しています。
実験と分析の部分を含む全体の方法は、約2日かかります。ゲノム中のLINE-1のコピー数が多いため、通常サンプルではLINE-1のベースラインメチル化が高くなっています。したがって、この方法で観察されるサンプルのメチル化レベルの差は微妙であり得る。
