Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
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作業はCPRIT研究研修賞RP140105でサポートされているだけでなく、部分的にR01 GM114142を許可し、ウィリアム＆エラ・オーエンス医学研究財団（NIH）米国国立衛生研究所によってサポートされています。

全ての組織は、治験審査委員会の委員会の承認後に得られ、すべての参加者は、分子分析やフォローアップ調査の両方に同意したとき。プロトコルは、サンアントニオにあるテキサス大学健康科学センターで人間学委員会によって承認されています。 1.メチルDNA結合キャプチャ（MBDCap） <ol><li> サンプル採取およびDNA単離 <ol><li>患者のパラフィン包埋組織試料からバルク腫瘍または正常組織サンプルを収集します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、パラフィン包埋組織サンプルからゲノムDNAを単離するための市販のDNAミニキットを使用します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、ここで説明する手順でメチル化DNA濃縮キットを使用してください。 </li></ol></li><li> 最初のビーズ洗浄 注：ビーズは、ゲノムにDNAのメチル化を検出MBDビオチンタンパク質と結合するために使用されます。ビーズは、通常は中断されます原液インチこの液体を洗い流すためにこれらのステップを使用してください。 <ol><li>優しく均一な懸濁液を得るために、ピペッティングにより（ 材料表を参照してください）ストレプトアビジンビーズのストックを再懸濁します。ボルテックスによってビーズを混在させないでください。 </li><li>入力DNAの1μgのために、1×バインド/洗浄緩衝液の90μLとチューブにビーズのADD10μL。 1分間回転させます。ボルテックスで混合しないでください。 </li><li> 1分間磁気ラック上にチューブ（複数可）を配置します。 </li><li>ピペットを用いて液体を除去し、液体を捨てます。 </li><li>ビーズに1×バインド/洗浄緩衝液250μLを加え、1分間回転させます。 </li><li>二回1.2.5 - を繰り返して、1.2.3を繰り返します。 </li></ol></li><li> ビーズにMBDビオチンタンパク質を結合します <ol><li>入力DNAの1.2μgのために、各チューブにMBDビオチンタンパク質の7μL（3.5μgの）を追加します。 </li><li> 100μLの最終容量を作るためにタンパク質に1×バインド/洗浄緩衝液93μLを追加します。 </li><li>ビーズタンパク質を混ぜます1時間室温で回転ミキサーで混合。 </li></ol></li><li> 断片化したDNA（入力） <ol><li> TE緩衝液96μL、24μL5倍のバインド/洗浄緩衝液中で全ゲノムDNAの1.2μgのを追加することにより、超音波処理したDNAを120μL溶液を作製します。 25回 - 30の電源のONと超音波処理の間に30の電源OFF、20を使用してください。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って350 BP - 150の範囲にあることが断片の大きさを確認するために市販の高感度DNAキットバイオアナライザーシステムを用いて超音波処理したDNA溶液1μlを実行します。 </li></ol></li><li> MBD-ビーズを洗浄 <ol><li> 1分間磁気ラック上MBD-ビーズを含むチューブを置きます。 </li><li>ビーズに触れずにピペットで液体を除去し、廃棄します。 </li><li> 1×バインド/洗浄緩衝液250μLでビーズを再懸濁します。 </li><li> 5分間室温で回転ミキサー上でビーズを混ぜます。 </li><li>二回1.5.4 - を繰り返して、1.5.1を繰り返します。 </l私&gt; </ol></li><li> 断片化DNA捕捉反応（1μgのインプットDNA） <ol><li> MBD-ビーズを含むチューブにDNA /バッファー混合物を転送します。 </li><li>室温で1時間、回転ミキサー上でDNAとMBD-ビーズを混ぜます。また、4 O℃でO / Nを混ぜます</li></ol></li><li> ビーズからの非捕捉されたDNAを削除します <ol><li> DNAとMBD-ビーズを混合した後、管の内壁にビーズのすべてを集中するために1分間磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>ピペットを用いて上澄み液を取り出して、非メチル化DNAのようなきれいなDNアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに保存します。氷の上でこのサンプルを保管してください。 </li><li>ビーズを洗浄したビーズに1×バインド/洗浄緩衝液の200μLを追加します。 </li><li> 3分間回転ミキサー上でビーズを混ぜます。 </li><li> 1分間磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>ピペットを用いて液体を除去し、マイクロチューブに保存します。 </li><li>キャップのための合計で2以上の洗浄画分のために1.7.6 - インプットDNAの≤1μgののチャ反応、リピートは1.7.3を繰り返します。 </li></ol></li><li> 単一の画分の溶出 <ol><li>高塩緩衝液の低塩緩衝液ミックス（1：1）を溶出バッファー（千のNaCl）を取得します。 </li><li>溶出バッファー（千のNaCl）の200μLでビーズを再懸濁します。 </li><li> 3分間回転ミキサー上でビーズをインキュベートします。 </li><li> 1分間磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>磁気ラック上の所定の位置にチューブを、ピペットチップでビーズに触れることなくピペットで液体を除去し、清潔なDNアーゼフリーの1.5 mLのマイクロ遠心チューブに保存します。氷の上でこのサンプルを保管してください。 </li><li> （総容量は400μLになります）、同じチューブ内で第二のサンプルを収集し、一度1.8.4 - を繰り返して、1.8.1を繰り返します。氷上でプールされたサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li> エタノール沈殿（DNAのクリーンアップ） <ol><li>各noncaptured、洗浄、および溶出画分FRに前のステップオム、1μLのグリコーゲンを追加（20μgの/μL、キットに含まれる）、3M酢酸ナトリウムの1/10サンプル量、pHが5.2（サンプルの400μLあたり例えば 、40μL）と100％の2試料体積エタノール（ 例えば 、400あたり800μLのサンプルμL）。総容量は1241μLです。 </li><li>十分に混合し、少なくとも2時間、-80 O Cでインキュベートします。 </li><li> 4 O℃で11363×gで15分間チューブを遠心</li><li>ペレットを乱さないように注意し、上清を捨てます。 </li><li>冷70％エタノール500μLを追加します。 </li><li> 4 O℃で11363×gで5分間遠心操作を</li><li>ペレットを乱さないように注意し、上清を捨てます。 </li><li>一度1.9.7および任意の残留する上清を除去 - 、手順1.9.6を繰り返します。 </li><li>約5分間のペレットを空気が乾燥します。完全にペレットを乾燥させないでください。 </li><li> DNアーゼを含まない水または他の37.5μLでDNAペレットを再懸濁バッファの適切な量。 </li><li>氷の上にDNAを配置したり、さらに使用するまで-20 O Cで以下のDNAを保存します。 </li><li> （ 例えば 、蛍光定量システムを使用し、 材料表を参照）、DNAの合計量が20 ngの上にあることを確認してください。 </li></ol></li></ol> 2.シーケンシング<ol><li>配列決定のためにMBDCap手順から回収したDNA断片を使用してください。各サンプルは、配列決定されるためには、20の合計 - 40 ngのDNAは、ライブラリの準備のために必要とされます。 </li><li> DNA-seqのライブラリーの調製のために完全に自動化されたライブラリー構築システムを使用（ 材料表を参照）、製造業者によって供給される標準的なプロトコルに従ってください。ライブラリーを調製するための400bp - サイズ200のDNA断片を選択します。自動化ライブラリ作成システムは、ライブラリーの調製手順を標準化し、マニュアル作成のために、サンプル全体の変動を最小限に抑えることができます。 </li><li>アダプターの素数を使用しますRSとは、100倍の濃度に希釈します。このうち、各サンプルについて10μLを使用します。 </li><li>ステップ2.2に続いて、反応を取り出し、および蛍光定量システムを（ 材料表を参照）を使用して、DNA-seqのライブラリーを定量化します。 <ol><li> PCR増幅手順を設定します。 PCRマスターミックスの選択は、ゲノムのGC富化領域のPCR効率を改善することです。 PCRチューブでは、15μLのDNA-seqのライブラリを追加し、25μLのPCRマスターミックス（ 材料表を参照）、2μLのPCRプライマーミックス（ 材料表を参照）、および8μLH 2 O </li></ol></li><li>出発物質が異なるためにサイクリング時間および温度を変化させること、PCRマスターミックスの製造業者からのPCR勧告に従ってください：15秒98°Cのの98°Cの 45秒間、Xサイクル、65°Cの 30秒間、72°Cの 30のためにS、および1分間、次いで72 入出力 C。 4 O℃でホールド<ol><li> PERF（ - 10サイクル8）ライブラリーDNAの10 nMの - 2で終わるために十分なサイクルをORM。 </li></ol></li><li>製造業者のプロトコルに従ってPCR精製ビーズの1の比率（ 材料表を参照してください）：1を用いたPCR反応をクリーンアップします。 </li><li> 30μLの溶出緩衝液 - 20で溶出します。 </li><li>バーコード各サンプルとプール4サンプル一緒にフローセルの1レーンへ。 （ 材料表を参照してください）配列決定のための標準的な50塩基対の単一の読み取りプロトコルを使用してください。 </li></ol> 3.バイオインフォマティクス解析注：配列決定から得られたさらなるプロセス生FASTQファイルは、品質管理を実行し、ゲノムへの短いDNA配列（読み取り）マッピングします。 <ol><li>使用ボウタイショートリード・アライナ、各サンプルFASTQファイルにゲノムマッピングツールは、参照ゲノムに読み込むマップします。多くのリードマッピングツールは、このステップを実行するために利用可能であり、個人の好みに基づいて使用することができます。 <ol><li> whol 2のミスマッチまで許可参照ゲノムにマッピングしながら電子を読み込みます。各読み取りのための20の最良のアラインメントまで報告してください。例えば、ボウタイ-v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;を使用します。 </li></ol></li><li>多重マッピングされた濃縮された領域の検出を改善するために読み取る回復するLONUT 9を使用してください。それは上記と呼ばれるピークのいずれかに十分接近しているときに、各読み取りの場合は、最大1つのアライメントが回収されることになります。たとえば、次のコマンドを使用します。perlのlonut.pl -g hg19 250 -p 99 -w &lt;alignFile&gt; &lt;outputPath&gt;。 LONUTは、次の手順を実行します。 <ol><li>分割アラインメントは、一意に読み込んでマッピングされ、多重読み込みマッピングされました。一意にマッピングされた上でコールピークがピーク呼び出し側ベルト11を使用して読み込みます。例コマンドで250と-p 99 -wオプションは、ベルトのためのものです。 </li><li>結合一意回収LONUTから得られ、合わせた読み取り読み取りで読み取りマッピングされ、床形式で、さらなる分析に使用されます。 COMBINの数を計算しますedは、将来の標準化のために読み込みます。 </li></ol></li><li>ビン読み込みます。抽出物は、perlのスクリプトを使用して、関心領域に読み込みます。perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; -up &lt;上流延びる長さ&gt; -dn &lt;下流延びる長さ&gt;。 sampleInfoFileに記載されている各ベッドのファイルについては、perlスクリプトは、以下のタスクを実行します。 注：perlスクリプトのための補助的な符号化ファイルを参照してください。 <ol><li>ビンは、24染色体のために、固定されたビンサイズ、 例えば 、100bpの中に読み取ります。 </li><li> refGeneFileで指定された各遺伝子について、オプション-upと-dnによって指定延びる長さまで、転写開始部位（TSS）の周りのビンを抽出します。例えば、アップとダウンストリームTSSの4キロバイトである領域のデータを抽出します。ビンのサイズは100bpで、このデータは81ビンを有する抽出し、中央ビンがTSSに対応します。 </li><li>アンチセンス鎖上の遺伝子については、上流のビンは常にナンプラーであるように、左から右に抽出された領域を反転perlスクリプトを使用して左側のをced。 </li><li> 2キロバイトの上流には、左、上流の4キロバイト;：さらに三つのサブ領域にTSS±4キロバイトの領域を分割中東、アップとダウンストリーム2キロバイト。 4キロバイトの権利、下流2キロバイト</li><li>各サンプルについて、のカウントは3.3.3で計算された読み取りマッピングされた組み合わせの総数で各ビンに読み込む分けます。正規化は、サンプルの特定の読み取り違いを解消し、異なる試料全体に読み込みを比較することができます。 </li></ol></li><li>左領域から得られた読み取り正規化された上で統計的検定を行うために（スクリプトファイルに示されているように）腹部のように説明した地域では、通常とケース群との間の差動メチル化を検出するために、bashスクリプトを実行します。 注：bashスクリプトのための補助的な符号化ファイルを参照してください。差別的メチル化されている領域に基づいて、7の組み合わせがあります。 全領域：TSS±4キロバイトの地域全体の差動メチル化 MiddleLeft：真ん中と左の両方の領域における差動メチル化 MiddleRight：ミドルと右の両方の領域での差動メチル化 フランク：左右の領域の両方の差動メチル化 左：左領域における差動メチル化のみ 右：右側領域における差動メチル化のみ ミドル：中間領域における差動メチル化のみ</li><li>竜巻プロットの差動メチル化を可視化するために、同じbashスクリプトを使用してください。別々のパネルにハイパーとハイポメチル化遺伝子をプロットし、それぞれ、3.4で説明したように、領域の組み合わせの順番に並べ替えます。 </li></ol>

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このプロトコルは、サンアントニオのテキサス健康科学センターの大学の博士ティム・黄博士ビクタージンの研究室で開発されています。

MBDCap-seqの技術は、患者15に多数のコホートを調査する際に、コスト効果の高い代替として考え親和性富化アプローチ3、です。ここで紹介するパイプラインは、データ分析と解釈にサンプル調達から包括的アプローチを説明します。最も重要なステップの一つは、DNAのメチル化が起こる場合、これはそのままゲノム中のGC富化領域のPCR効率を改善するために、PCR増幅手順を設定します。また?...

DNAメチル化を介して、遺伝子のエピジェネティックな調節は、本体1内の異なる組織型の安定した分化によって細胞運命を決定するために必要不可欠な機構の1つです。このプロセスの調節不全は、癌2を含む様々な疾患を引き起こすことが知られています。 このプロセスは、主にDNA 3のCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル基の付加を含みます。現在、多くの研究2-8に概説したように、それぞれが独自の利点を有し、このメカニズムを調査するために使用されるいくつかの異なる技術があります。ここでは、我々は、DNAのメチル化領域を同定するために、親和性濃縮技術を使用してメチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）と呼ばれるこれらの技術のいずれかを説明します。この技術は、メチル化CpG部位を含むゲノムDNA断片を濃縮するMBD2タンパク質のメチル結合能力の上に構築します。私たちは、商業メチル化DNA濃縮キットを利用しますこれらのメチル化領域を単離するため。私たちの研究室では、この技術を用いて患者サンプルの数百人をスクリーニングしており、ここでは大規模な患者コホートを調査するために使用することができる総合的な最適化されたプロトコルを、提供します。 任意の次世代シーケンシング技術で明らかなように、MBDCap-seqのも、正確にサンプル全体にメチル化のレベルを定量するために、特定のバイオインフォマティクスのアプローチが必要です。配列決定データ9、10の正規化と分析プロセスを最適化するために多くの最近の研究がなされています。 LONUT - - 患者多数のサンプルを横切って、公正な比較を可能にするために、各サンプルの線形正規化に続いて、このプロトコルでは、我々は、一意のリードリカバリ手法を実装するこれらの方法のいずれかを示します。

<table><tbody><tr><td>Methylminer DNA enrichment Kit</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Sonication Device</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate, pH 5.2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>Fully automated library construction system</td></tr><tr><td>Adapter Primers</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>PCR primer mix</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Fluorometric Quantitation System</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR Purification beads</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

メチル化は、異なる組織型の安定的発展と分化に必要な遺伝子の正確な制御を担当してDNAに不可欠なエピジェネティック修飾の一つです。このプロセスの調節不全は、多くの場合、癌のような種々の疾患の特徴です。ここでは、最近の配列決定技術、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）のいずれかを概説し、大規模患者コホートのための種々の正常および疾患組織中のメチル化を定量化するために使用されます。私たちは、最適な定量化を達成するために、バイオインフォマティクスパイプラインに沿って、この親和性富化アプローチの詳細なプロトコルを記述します。この技術は千methylomeプロジェクト（がんMethylomeシステム）の一環として、様々な癌タイプにわたって数百人の患者を配列決定するために使用されてきました。

私たちは、とりわけ、乳房12、子宮内膜13、前立腺14、および肝臓癌を含む多様な癌の型から多数の患者におけるDNAメチル化の変化を研究するためにMBDCap-seqのを使用しました。ここでは、最近12公開された乳癌の研究からいくつかの情報を示しています。この例では、示差異なるゲノム領域にわたって法線に対して腫瘍においてメチル化されたCpGアイランドを同定するための?...

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.6K ビュー.  University of Texas Health Science Center at San Antonio. ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。 

ビデオ: Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

遺伝学

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

生物学

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

神経科学

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

がん研究

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

生物工学

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

要約

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慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

メチル化DNA免疫沈降

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

ゲノムDNAから5 - ヒドロキシの選択的捕獲

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

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慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

メチル化DNA免疫沈降

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

ゲノムDNAから5 - ヒドロキシの選択的捕獲

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択