Name: chondrogenic pellet formation from cord blood-derived induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
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この作業は、韓国保健医療技術研究開発プロジェクト（HI16C2177）の助成を受けて行われました。

このプロトコルは、カトリック大学（KC12TISI0861）の制度審査委員会によって承認された。再プログラミングに使用したCBMCは、ソウル・セント・メアリー病院の臍帯血バンクから直接入手した。 1. iPSCとの軟骨形成分化<ol><li> CBMC-iPSC生成 <ol><li>先の研究23に示されたプロトコルを用いてCBMC-hiPSCを生成する。 </li><li>血球を15 mLコニカルチューブに集め、血球計数器を使用して数えます。 </li><li> 3×10 5細胞を調製し、515×gおよびRTで5分間遠心分離する。吸引によって上清を捨て、血球培地0.5mLに細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞をコーティングされていない24ウェルプレートのウェルに移し、製造者の推奨に従って、センダイウイルス混合物を添加する。 </li><li> 1,150 xgおよび30℃で30分間プレートを遠心分離する。 </li><li>後部37℃、5％CO 2で一晩（O / N）インキュベートする。 </li><li>翌日、形質導入された細胞をマトリックス被覆ウェルに移す。 30℃で30分間1,150 xgでプレートを遠心分離する。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、1mLのiPSC培地を添加し、37℃、5％CO 2で細胞O / Nを維持する。 </li><li> 37℃および5％CO 2で付着細胞を維持する。毎日培地を交換し、新鮮なiPSC培地に交換してください。 注：コロニーは、形質導入後14日目〜21日に出現する。 </li></ol></li><li> EB生成 <ol><li> 37℃および5％CO 2で hiPSCを維持する。新鮮なEssential 8（E8）培地と交換して、培地を毎日交換してください。 </li><li> E8培地でビトロネクチンでコーティングした100 mmディッシュで2 x 10 6個の hiPSCを調製します。 </li><li>培養ディッシュからE8培地を除去し、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。 </li><li> 1を加えるmLの1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。 </li><li> 3mLのE8培地で細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。室温（RT）で2分間250xgで細胞を遠心分離する。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、E8培地5 mLに細胞を再懸濁する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を計数し、100mmペトリ皿ごとに2×10 6個の細胞を調製する。調製した細胞を、10μMのρ-関連キナーゼ（ROCK）阻害剤を含むE8およびEB培地（1：1）の10mL混合物中に再懸濁する。 </li><li> 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。 </li><li>翌日、ピペットで集めたEBを採取する。細胞を250xgで1分間遠心分離する。上清を除去し、10mLの新鮮なE8培地にEBを再懸濁する。 </li><li>生成されたEBを5日間拡大し、毎日の変更をfresで行うh E8培地。さらに成熟するために、培養培地をE7培地に交換する。 37℃、5％CO 2でさらに5日間EBを維持し、新鮮なE7培地で毎日培地を交換する。 注：E7培地は、FGF2を含まないE8培地である。 </li></ol></li><li> EBからの伸長細胞誘導 <ol><li> 1％ゼラチン6mLを100mmディッシュに加え、37℃および5％CO 2で30分間インキュベートする。 </li><li>使用前にゼラチンを取り出し、2〜3時間完全に乾燥させます。 </li><li> EBを50 mLコニカルチューブに移す。 EBがコニカルチューブの底に落ち着くようにします。 EBを乱すことなく上清を除去する。 </li><li> EBを20％ウシ胎児血清（FBS）を含む10mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に再懸濁する。 EBをゼラチンコートされた100mmディッシュに移す。 10μMのROCK阻害剤を添加する。 </li><li>細胞を37℃、5％CO 2で7日間インキュベートし、維持する。私を変えるROCK阻害剤を添加することなく1日おきに投与する。 </li></ol></li><li> 軟骨形成のペレット形成 <ol><li>皿から培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li> 1 mM EDTA 1 mLを加え、37℃、5％CO 2で2分間インキュベートする。 </li><li> 20％FBSを含む5mLのDMEMを用いて細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。 </li><li>細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。上清を捨て、20％FBSを含む10mLのDMEMにペレットを再懸濁する。 </li><li>濾過し、40μmの細胞ストレーナーを用いて細胞塊を捨て、単一の細胞を回収する。血球計数器を用いて単一細胞を計数する。 </li><li>細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。 100μLの軟骨形成分化培地（CDM）を含む15mLコニカルチューブ中にペレットあたり上清および種子3×10 5細胞を除去する。 </li><li>ペレット形成のために、細胞を5分間、680×gおよびRT。 注：ペレットは、軟骨形成性のペレットの分化の間、15mLの円錐管中に維持される。 </li><li> 37℃および5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 </li><li> 2〜3日ごとにCDMを変更してください。 3日以内に、ペレットは平らで回転楕円体の形態を示す。 37℃および5％CO 2で21日間ペレットを維持する。 </li></ol></li></ol> 2.染色による軟骨形成ペレットのキャラクタリゼーション<ol><li> 軟骨形成包埋 <ol><li>包埋する前に、58℃でパラフィンを調製し、溶解する。 </li><li>ペレットを1 mLの4％パラホルムアルデヒドに1.5 mLチューブで室温で2時間固定する。 注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒である。眼、皮膚、粘膜との接触を避ける。暴露を最小限にし、吸入を避ける。 </li><li>ガセットの1つの層をカセットに置き、ピペットを使用して固定ペレットを移す。折りたたむことでペレットを覆うカセット蓋を閉じます。 </li><li> 100mLの70％エタノール（EtOH）中で10分間ずつ2回脱水を開始する。 80％および95％EtOH中で連続的に10分間洗浄することによりペレットを脱水する。 </li><li>ペレットを10分間100％EtOHに移す。新鮮なEtOHで3回繰り返します。 </li><li> 「清澄化」するために、溶液をEtOHとキシレンの100mL、1：1混合物と交換し、続いてEtOHとキシレンの1：2混合物をそれぞれ10分間交換する。ペレットを100％キシレンで2回、それぞれ10分間インキュベートすることによって残りのEtOHを除去する。 </li><li>パラフィン浸透のために、ペレットを連続キシレンおよびパラフィン混合物中でインキュベートする。パラフィン浸透プロセス全体を58℃で実施する。ペレットを100mLのキシレンとパラフィンの2：1混合物に30分間インキュベートする。 </li><li>溶液をキシレンとパラフィンの1：1混合物100mLと交換し、30分間インキュベートする。 </li><li>この溶液をキシレンとパラフィンの1：2混合物100mLに交換し、30分。 </li><li>最終的な浸潤のために、ペレットを100％パラフィンの最初の浴に移し、2時間インキュベートする。 </li><li>ペレットを100％パラフィンの第2の浴に移し、58℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>翌日、ピンセットを使ってペレットを金型に静かに移す。パラフィンディスペンサーからモールドにパラフィンを加えます。パラフィンを4℃で30分間固めます。 </li><li>切片を7μmでスライスし、切片をスライド上に移す。スライドを一晩乾燥させ、使用準備が整うまでRTで保存します。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li> 100％、90％、80％、および70％EtOHの各100mLを順次5分間ずつ移動させることにより、スライドを脱パラフィンする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li></ol></li><li> アルシアンブルー染色 <ol><li>スライドを1％アルシアンブルー溶液50 mLに30分間インキュベートする。 NOTE：アルシアンブルーを3％酢酸溶液で希釈する。酢酸を用いてpHを2.5に調整する。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で2分間すすいでください。 </li><li>スライドを脱イオン水（DW）ですすぎ、核高速赤色溶液で2分間対比染色する。 </li><li>スライドをガラス瓶に入れ、水道水で1分間すすいでください。 </li><li> 2.3.5）手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> トルイジンブルー染色 <ol><li>スライドを50mLのトルイジンブルー溶液で4分間インキュベートする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li><li>手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学的染色 <ol><li>内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、スライドを3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。 </li><li> 1：100に希釈した一次抗体（抗COL1A1および-COL2A1）200μLをトリスバスライドに1％ウシ血清アルブミン（BSA）と5％正常ヤギ血清（NGS）を含む生理食塩水（TBS）を加え、4℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>翌日、スライドをガラス瓶に入れ、0.1％ポリソルベート20（TBST）を含む50mLのTBSでそれぞれ5分間3回洗浄する。 </li><li>スライドに2次抗体（ヤギ抗ウサギIgG抗体、1％BSAおよび5％NGSを含有するTBS中に1：200希釈）200μLを適用し、RTで40分間インキュベートする。 </li><li>ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。 </li><li>シグナル増幅のために、HRP結合ストレプトアビジン溶液をスライドにアプライし、10分間インキュベートする。 </li><li>ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。 </li><li> DAB-ペルオキシダーゼ基質溶液を混合し、各スライドに200μLの溶液を適用し、1分間インキュベートする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li><li>対比染色Mayerのヘマトキシリンで1分間処理した。 </li><li> DWでスライドを洗う。 </li><li>手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> 脱水とマウント <ol><li> 70％、80％、90％、および100％EtOHの各100mLを順番に移動させてスライドを脱水する。 </li><li>スライドを1分間、キシレンの2回の変更に浸漬する。 </li><li>カバースリップに50μLのマウント溶液を加え、スライドを上に置きます。 </li></ol></li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、CBMCからhiPSCを首尾よく生成した。ヤマナカ因子24を含むセンダイウイルスベクターを用いて、CBMCをhiPSCに再プログラミングした24 。分化には3例を用い、すべての実験でこのプロトコールを用いて軟骨原性ペレットを作製した。多くの研究により、hiPSCの軟骨細胞への分化に関するプロトコールが報告されている25,26,27,28。しかし、CBMC-hiPS...

hiPSCsの使用は、薬物スクリーニングおよび種々の疾患の機械的研究のための新しい戦略を表す。再生的な観点から、hiPSCsはまた、関節軟骨1,2などの治癒能力が限定された損傷組織の置換のための潜在的な供給源でもある。 天然の関節軟骨の再生は、数十年にわたり挑戦されてきた。関節軟骨は柔らかく白い組織で、骨の端を覆い、摩擦から保護します。しかし、損傷したときの再生能力は限られており、自己修復はほとんど不可能である。したがって、数十年にわたって軟骨の再生に焦点を当てた研究が進行中である。 従来、軟骨形成系統へのインビトロ分化は、通常、膝関節から単離したBMSCまたは天然軟骨細胞を用いて行った3 。原因それらの軟骨形成能、BMSCおよび天然軟骨細胞は、軟骨形成におけるそれらの使用を支持する多くのメリットを有する。しかし、それらの限定された拡大および不安定な表現型のため、これらの細胞は、関節軟骨欠損の再構築にいくつかの限界に直面する。 インビトロ培養条件下では、これらの細胞は3-4継代後にそれら自身の特徴を失う傾向があり、最終的にそれらの分化能力に影響を及ぼす4 。また、天然軟骨細胞の場合、これらの細胞を得る際には、膝関節へのさらなる損傷が不可避である。 BMSCまたは天然軟骨細胞とは異なり、hiPSCはインビトロで無期限に増殖することができる。適切な培養条件では、hiPSCは軟骨分化の代替源として大きな可能性を秘めています。しかし、hiPSCの本質的な特性を変えることは難しい5 。さらに、それはいくつかの複雑なin vitro ste特定の細胞型にhiPSCsの運命を導くps。これらの合併症にもかかわらず、hiPSCsの使用は、自己複製能力が高く、軟骨細胞を含む標的細胞に分化する能力があるため、依然として推奨されている6 。 軟骨形成分化は、通常、MSC様前駆細胞を用いて、ペレット培養またはマイクロマス培養などの三次元培養系で行われる。 hiPSCを使用する場合、MSC様前駆細胞を生成するプロトコルは、既存のプロトコルとは異なる。いくつかのグループは、表現型をMSC様細胞に直接変換するために、hiPSCの単層培養を用いる。しかし、ほとんどの研究では、EBを用いてMSC8,9,10,11に似た外殖細胞を生成しています。 様々なタイプの成長因子を用いてコンドロゲを誘導するnesis。通常、BMPおよびTGFβファミリータンパク質は、単独でまたは組み合わせて使用​​される。分化は、GDF5、FGF2、およびIGF1などの他の因子によっても誘導されている12,13,14,15。 TGFβ1は、MSCs 16において用量依存的に軟骨形成を刺激することが示されている。他のアイソタイプであるTGFβ3と比較して、TGFβ1は、軟骨前軟骨間細胞の凝縮を増加させることによって軟骨形成を誘導する.TGFβ3は、間葉細胞増殖を有意に増加させることにより軟骨形成を誘導する17 。しかし、TGFβ3は、TGFβ1より研究者により頻繁に用いられる7,10,18,19。 BMP2は、ヒトにおける軟骨形成性マトリックス成分に関連する遺伝子の発現を増強するインビトロ条件下での関節軟骨細胞20 。 BMP2は、TGFβタンパク質21と組み合わせてMSCにおける軟骨形成に重要な遺伝子の発現を増加させる21 。 BMP2は、SmadおよびMAPK経路22を介してTGFβ3の効果を相乗的に増強することも示されている22 。 この研究では、CBMC-hiPSCを、低付着ペトリ皿中でEB培地を用いてEBに凝集させた。伸長細胞は、EBをゼラチンコートディッシュに付着させることによって誘導された。外胚葉細胞を用いた軟骨形成分化をペレット培養により行った。 BMP2およびTGFβ3の両方による処理は、細胞を首尾よく凝縮させ、軟骨形成ペレット形成のための細胞外マトリックス（ECM）タンパク質蓄積を誘導した。この研究は、CBMC-hiPSCを用いた単純で効率的な軟骨形成分化プロトコルを示唆している。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-well Plate</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;E8 Medium Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Conc.: 543 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&amp;nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medium (Conc.: 10.7 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&amp;nbsp; (Conc.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc.: 20 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>Human TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium&amp;nbsp; (Conc.: 64 &amp;mu;g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Quality Control Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II antibody</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Duksan</td><td>115&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&#039;s hematoxylin solution</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, Coated</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chondrogenic Differentiation Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Chondrogenic media component (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 64 &amp;mu;g/mL)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&amp;amp;D</td><td>355-BM-050</td><td>Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Recombinant Hman TGF-beta3</td><td>R&amp;amp;D</td><td>243-B3-002</td><td>Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Dexamethasone-Water Soluble&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Chondrogenic media component (Conc.:10&lt;sup&gt;-7&lt;/sup&gt; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Chondrogenic media component (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Chondrogenic media component (40 &amp;mu;g/ml)</td></tr></tbody></table>

chondrogenic pellet formation from cord blood-derived induced pluripotent stem cells

人間の関節軟骨は、それ自体を修復する能力が欠けている。従って、軟骨変性は治癒的ではなく、保存的治療によって治療される。現在、 エクスビボで増殖した軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）を用いて損傷軟骨を再生する努力がなされている。しかしながら、これらの細胞の制限された生存能力および不安定性は、軟骨再建におけるそれらの適用を制限する。ヒトに誘導された多能性幹細胞（hiPSC）は、再生的応用のための新しい選択肢として科学的な注目を集めている。無制限の自己複製能力と多能性を有することにより、hiPSCは、軟骨修復のための新しい置換細胞源として注目されている。しかし、高品質の軟骨形成性のペレットを大量に得ることは、臨床応用への大きな課題です。この研究では、胚様体（EB）由来の外胚葉細胞を軟骨分化のために使用した。成功した軟骨形成は、PCRおよびアルシアンブルー、トルイジンブルー、およびコラーゲンI型およびII型（それぞれCOL1A1およびCOL2A1）に対する抗体で染色した。我々は、臍帯血単核細胞由来iPSC（CBMC-hiPSC）の軟骨形成性ペレットへの分化のための詳細な方法を提供する。

この研究では、EB細胞から伸長細胞を誘導することにより、CBMC-hiPSCから軟骨形成性ペレットを作製した。多分化能が高いことが確認されたCBMC-hiPSCを用いて軟骨形成分化を誘導した11 。我々のプロトコルの簡単なスキームを図1Aに示す 。分化の前に、iPSCコロニーを拡大した（ 図1B ）。拡大されたiPSCをEBと?...

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Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K ビュー.  The Catholic University of Korea. ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。 

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

発生生物学

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

生物工学

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a step-by-step method for differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into chondrocyte-based spheroids, supporting tissue engineering and cell therapy applications. The differentiation process is carefully structured to promote chondrogenic lineage commitment, beginning with iPSCs cultured in specific media that sequentially guide cells through critical stages of differentiation. Initially, iPSCs are expanded to reach optimal confluency before induction toward chondrogenic lineage using a series of defined media changes. By day 10, cells are transitioned to a chondrogenesis-promoting medium that enhances the formation of chondrocyte-like cells expressing key markers of mature chondrocytes. Further aggregation in 96-well agarose-coated plates leads to the formation of three-dimensional spheroids, which are then cultured in custom mini-bioreactors designed to simulate a microenvironment that encourages extracellular matrix (ECM) deposition. By enabling scalable production of chondrocyte spheroids that mimic native cartilage characteristics, this approach offers a promising, reproducible solution for developing cell-based treatments for cartilage defects, providing broad utility for clinical and research applications in musculoskeletal regenerative medicine.

This study describes a method for producing chondrocytic spheroids by aggregating cells into spheroids under low-adhesion conditions using gravity, followed by culturing the resulting spheroids in mini-bioreactors.

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

軟骨内骨化による骨再生のための人工軟骨インプラント

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

著者スポットライト:血管新生人工軟骨統合による骨再生の強化 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

要約

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ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成