This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1.神経文化注：線維芽細胞の多能性幹細胞におけるリプログラミング、背側終脳の系統へのコミットメント、導出、増幅、及び後期皮質前駆細胞（LCP）の銀行がBoissart ら 4で説明しました。 LCP様細胞の神経分化はまた、わずかな修正を加えたBoissart ら 4に従って行きました。他の手順は、ニューロンへの分化に続いて誘導多能性幹細胞への線維芽細胞の直接再プログラミングのために開発されています。それはピラミッド型グルタミン酸作動性ニューロンの選択的な製造を可能にするため、このプロトコルを保持しました。 <ol><li>ポリオルニチン（DPBSで1/6に希釈し、原液濃度0.01％）、DPBSで3回洗浄し、O / Nでカバーガラスを6ウェル培養プレートを扱います。その後流フードの下で少なくとも10時間（ストック濃度1mg / mlの、DPBS中で500倍に希釈）ラミニンを追加<html> 。 </li><li> DMEM / F12からなる培地3mlの（500 ml）を、N2サプリメントの2バイアル（各5ml）中のガラスカバースリップで6ウェル培養プレート（50,000細胞/ cm 2）低密度でNSCをプレートし、派遣、 B27サプリメントの2バイアル（各10ml）、ペン - ストレプトマイシン（ペニシリン= mlおよびストレプトマイシン= 10,000単位/ mlの10,000単位/）、2-メルカプトエタノール（ストック液：50 mM）の1mlを10ミリリットルとラミニン（1 / 500）、成長因子を含みません。重要なステップ：細胞クラスタリングを減少させるためにゆっくり回転運動を細胞に添加することによって慎重にこの工程を行います。 </li><li>培地を除去します。カバーガラスに付着した神経細胞を維持し、凝集を回避するために、新鮮なラミニン溶液を2μg/ mlを含む新鮮なN2B27培地を追加します。 3日ごとに培地を変更します。乾燥から細胞を防ぐために、新鮮な培地を添加する前に、残りの培地（200μL）の一部を保管してください。また、急速に進行し、全体積（3ml）に変更します。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 2。レンチウイルス形質導入注意：GFPレンチウイルスベクターは、親切にパスツール研究所（パリ）で博士ウーヴェMaskos研究所によって提供され、公表されたプロトコール5に従って調製しました。 GFP発現は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターにより駆動されます。この研究では、ウイルス力価は、400 ngの/μL（PBS 1Xで原液）でした。 <ol><li>文化ごとのGFPレンチウイルスベクターウェル（6ウェルプレート）の40 ngのを含むストック溶液1μlを追加することにより、ウイルス粒子による成熟のいずれかの段階で人間のiPS細胞由来の神経細胞を形質導入し、新鮮な培養培地中で48時間インキュベートします。注：このプロトコルでは、インキュベーションの期間は、脊椎構造の良好なラベル付けを可能にします。 </li></ol> 3.免疫蛍光注：全脊椎の形態の標識化を改善するために、免疫蛍光標識は、透過処理条件下で、抗GFP抗体を用いて行きました。 </p&gt; <ol><li>培養培地を除去し、室温で10分間、4％パラホルムアルデヒド中でカバーガラス上で形質導入した細胞を固定し、その後、1×PBS中で（10分毎）で3回洗浄します。 </li><li> PBS中で飛び込むのカバーガラスが0.05％トリトン（100倍）し、室温で1時間、10％ウマ血清を補充し、その後、1×PBS中で3回洗浄します。 </li><li> 1×100μlのPBSを加え、GFPに対して惹起され、各カバースリップ上で1000倍に希釈（1 /千）4％ウマ血清及び一次抗体を補いました。暗箱Oでインキュベート/ N 4℃で、次いで1×PBSで3回洗浄します。 </li><li> PBS中でアレクサフルオロ488結合抗体（1/200）を希釈のTween 20の0.5％を補充し、室温で1時間インキュベートします。その後、1×PBS中で3回洗浄し、蛍光顕微鏡用のメディアをマウントして、スライドガラス上にカバースリップをマウントします。 </li></ol> 4.樹状突起棘イメージング<ol><li>共焦点レーザー走査顕微鏡で共焦点イメージングを実行します。 </li><li>ピラミッド型の形態Aとの健全なニューロンを選択NDフル樹状樹枝状分岐し、別々の実験からの条件当たり少なくとも10のニューロンを定量化します。デンドライトあたり100ミクロン - 60を定量化します。 </li><li>目的とGFPの励起のための488nmレーザーライン、20μWの周りのサンプルレベルでの典型的なピークパワーで40X油NA = 1.3を使用して画像を取得します。 80nmの周りにピクセルサイズが適切に樹状突起棘をサンプリングします。 注意：ノイズは樹状突起と棘の適切なセグメント化を妥協しないで画像の後続の解析コールを。前述の空間サンプリングおよび電力設定では、我々は3.15マイクロ秒の画素滞留時間は、そのようなイメージを構築するのに十分な光子を収集するのに十分であることを観察しました。薄暗いサンプルについては、画質が2〜4のスキャンを平均することによって改善することができます。いくつかのXYタイルの獲得は、処理の前に縫合しなければならない関心領域をカバーするために必要とされ得ます。 </li><li>に、Z​​スタックを取得し、全ニューロンの量を試料にZは20〜30のZスライスを得、150ナノメートルから300ナノメートルの範囲でスペーシング。 注：これらの設定で達成横方向の空間分解能は234 nmであると軸方向分解能は591 nmです。ここで選択されたサンプリングは十分であるが、軸方向の解像度が画像化される脊柱の最小サイズよりも大きいように、分析は、樹状突起から側方に延びて棘を好みます。 </li></ol>樹状突起棘の5 3D定量注：以下のセクションでは、具体的には、分析のためのIMARISソフトウェアの使用を記載しています。代替の実装では、同様の結果を提供することができますNeuronStudio 15またはをMetamorph 8、を含む、存在します。 次のキー設定を使用します。 <ol><li>前処理段階として、ソフトウェアが提供する画像処理施設を通じてガウスフィルタを使用。 画像処理&gt; Smoo経由でガウスフィルタ処理を実行します事&gt;ガウスフィルタ。 X-Yの画素サイズに等しくなるように、フィルタの幅を設定します。 </li><li>ソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールを使用して、樹状突起の半自動トレースを実行します。 <ol><li>まず、ソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用することにより、樹状突起の直径を推定します。 </li><li> サーパスタブで、 フィラメントのツールをクリックしてください。優れた堅牢性のために、このプロトコルは、半自動追跡に依存しています。 スキップ自動作成をクリックしてください。モジュールインターフェイスは現在、 描画]タブを示しています。ここでは、タイプ、および入力の方法、 デンドライトと推定デンドライト直径てAutoPathを選択します。 </li><li>ボックスにカーソルを回し、ポインタの選択モードを使用します。樹状突起の出発点に、Shiftキーを押しながら右クリックします。注：このソフトウェアは、最初の計算を実行します。 </li><li>樹状突起に沿ってポインタを移動します。出発点から（表します青い球のようにED）、最も可能性の高い樹状突起のパスを表す黄色の線が示されています。樹状突起のエンドポイントで、Shiftキーを押しながら左クリックします。 </li></ol></li><li>自動化された棘のセグメンテーションを行います。注：トレース樹状突起上の棘は、モジュールインタフェースによって自動的に発見されることになります。 <ol><li>モジュールインターフェイスでは、 作成タブをクリックします。 リビルドドロップダウンリストでは、 デンドライトの直径を再構築し、キープデータ ]チェックボックスをオンに選びます。 [再構築]をクリックします。 </li><li>セグメント化されたボリュームは実際の樹状突起のボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして 、 距離マップからの最短距離を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。 </li><li>最小の背骨の頭の直径と最大長を決定し、再びソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用して、その後突破タブに戻ってくるとパラメータを入力します。 Fあるいはこのプロトコルは、200の周り値 - 最小の直径が300nmであり、最大長さ4μmのは良い出発点です。 許可支店棘ボックスをチェックしないでください。 [次へ]ボタンをクリックします。 </li><li>棘を表す青色の点は、実際の背骨の頭に局在するように、 シード点のしきい値を調整します。 [次へ]ボタンをクリックします。注：コアの計算は、現在行われていると長くなる可能性があります。 </li></ol></li><li>モジュールインターフェイスの[ツール]タブに移動して、棘を分類します。 分類棘をクリックします。プロンプトが表示され、ユーザインタフェースでは、次のようにその形態によって定義された4つのクラスが存在することを確認してください：スタビー：長さ&lt;1μmで、キノコ：長さ（背骨）&gt; 3、最大幅（ヘッド）&gt;（首）の幅を意味する×2。ロング薄い：平均幅（ヘッド）≥平均幅（首）;糸状仮足のような：長さ≤4ミクロン（無頭）。 注：MOduleインターフェースは、分類の結果を含む4新しいフィラメントのオブジェクトを生成します。 </li><li>エクスポート統計データ：これらの4オブジェクトインタフェースのいずれかで、[統計]タブに移動します。 ボタンをファイルにエクスポートすべての統計情報をクリックします。 注意：他の統計値は、樹状突起のためにエクスポートすることができます（ 例えば 、長さ、面積、角度、ボリュームを分岐、直径、枝の深さを意味する、 など 。）、および棘のために（明確なの例えば、真直度、添付ファイルの面積、長さとボリューム脊椎部、脊椎直径、密度、 など 。） </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

錐体ニューロンの形態学的特徴の定量化は、ソフトウェアに依存していました。フィラメントトレーサーインタフェースはニューロンおよび棘の分割のために使用し、XTモジュールは、それらの分析に使用しました。 私たちの技術の精度を分析するには、まず文化6、7、ヒト脳組織3ラット成熟錐体ニューロンを使用して発行されていると測定された形態?...

皮質錐体ニューロンの樹状突起棘は、げっ歯類、霊長類、およびヒトの脳におけるこれらのニューロンのサブタイプの基礎と先端樹状突起に沿って分布している小型・薄型の突起があります。彼らは、ほとんどの興奮性シナプスのサイトであり、学習や認知過程における重要な機能を表示します。ヒト樹状突起棘の詳細な構造は、技術的には、電子顕微鏡2によって研究されています。しかし、このようなアプローチは、時間がかかり、重いワークロードを表します。より最近では、樹状突起棘の形態の三次元（3D）再構成は、大きな手動脊椎分析3に合わせた特定のソフトウェアを使用してヒト脳皮質において報告されています。 免疫蛍光に結合された緑色蛍光タンパク質（GFP）技術は、蛍光顕微鏡によって脊椎の識別および形状測定のための正確なツールを表します。このアプローチは、容易に培養されたニューロンに適用することができます。ハウ版、データは人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来のヒト神経細胞のスパインの成熟と形態の分析に報告されていません。 本研究の目的は 、in vitroで培養したヒトの神経細胞からの樹状突起棘のイメージングを可能にするプロトコルを記述するためでした。 IMARISソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールとGFP標識、共焦点顕微鏡および三次元解析は、本プロトコールに使用しました。神経幹細胞（NSC）からIVへの層IIの皮質グルタミン酸作動性ニューロンを得るために必要な培養ステップはまた、ここで簡単に説明されています。人間NSCの生産のためのプロトコル全体は、すでに他の場所で4公開されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

樹状突起棘は、中枢神経系の興奮性シナプスのシナプス後の区画に対応して小さな突起があります。これらは、樹状突起に沿って分布しています。その形態は、神経活動に大きく依存している、と彼らは動的です。樹状突起棘は、その表面上およびシナプス後密度のレベルでグルタミン酸受容体（AMPAおよびNMDA受容体）を発現します。各脊椎は、ニューロンが独立して、その状態や地域活性を制御することができます。脊椎形態は広範囲のin vivoアプローチやげっ歯類組織より得られた神経細胞培養の両方を使用して、脳皮質のグルタミン酸作動錐体細胞で研究されています。齧歯類培養ニューロンと一次元の定量分析1に示すように、神経病理学的条件は、変更された脊椎誘導および成熟に関連することができます。本研究は、人間corticを使用して、脊椎の形態の3次元定量分析のためのプロトコルについて説明しアルニューロンは、神経幹細胞（後期皮質前駆細胞）に由来します。これらの細胞は、最初に誘導された多能性幹細胞から得ました。このプロトコルは、異なる培養期間での脊椎形態の分析を可能にし、精神疾患を有する患者から得られたものと対照個体から得られた人工多能性幹細胞との間の比較可能性を有します。

<html>本研究は、iPS細胞由来錐体ニューロンの培養樹状突起のスパイン・定量化のための標準化されたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、脊椎の人間の神経細胞の成熟と標準的なげっ歯類の神経細胞培養におけるスパインの成熟などにおける in vivo動物モデルとの比較可能性の分析を可能にします。 図1Aは、皮質錐体ニューロンの生成?...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K ビュー.  Institut Pasteur. 錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。 

ビデオ: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

発生生物学

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...