慢性関節疾患における軟骨修復には、損傷した組織を効率的に再生するための高度な細胞ベースの治療法が必要です。このプロトコールは、人工多能性幹細胞を軟骨細胞ベースのスフェロイドに分化させるための段階的な方法を提供し、組織工学および細胞治療のアプリケーションをサポートします。慢性関節疾患における軟骨修復には、損傷した組織を十分に再生するための高度な細胞治療が必要です。
このプロトコールは、人工多能性幹細胞を軟骨細胞ベースのスフェロイドに分化させるための段階的な方法を提供し、組織工学および細胞治療のアプリケーションをサポートします。主な課題は、iPS細胞由来細胞における1型コラーゲンの発現を最小限に抑えて線維性軟骨を予防すること、成熟したハイライン軟骨形成のための条件を作り出すこと、スフェロイドを安定させるための3D培養法の改善、および臨床量の細胞材料を生産するためのスケーラブルなアプローチの開発です。このプロトコルは、軟骨細胞の代替供給源としてiPS細胞を使用することで利点を提供し、侵襲的な手順なしでスケーラブルな生産を可能にします。
3D培養により軟骨細胞の表現型をよりよく維持し、自然な軟骨の発達を模倣することで、軟骨特異的マーカーの発現が高い天然の軟骨細胞によく似た細胞が得られます。iPS細胞由来軟骨細胞の成熟度と機能性を高めるための効果的な方法を開発し、生体内での長期安定性を確保し、線維化した三次元培養材料を作製し、臨床応用のためのスケーラブルな細胞材料を作製する。まず、摂氏121度に設定されたオートクレーブで15ポンド/平方インチで30分間はさみを滅菌します。
はさみが乾いたら、遠心分離管を高さ7〜8ミリメートルのリングにスライスします。次に、付着力の低い、未処理の、または微生物学的なペトリ皿を、適切な破砕ツールを使用して小片に粉砕します。約1グラムのプラスチック粒子を10ミリリットルのクロロホルムに一晩、ドラフト内で溶解します。
液体プラスチック溶液の粘度を検証して、ピペッティングに適していることを確認します。溶液が薄すぎる場合は、プラスチック粒子を1〜3グラム追加します。濃くなりすぎた場合は、約5ミリリットルのクロロホルムで希釈してください。
60mmのペトリ皿の中央にオートクレーブプラスチックリングを置きます。次に、リングの内側に液体プラスチックを塗布して、プラスチックノブを形成します。皿を覆わずに層流フードで2〜3時間乾かします。
乾燥後、皿を紫外線に20〜30分間さらします。まず、プラスチック製のノブが入った改造されたペトリ皿を入手します。軟骨採取の2日後、60mmのシャーレを使用してハンク溶液で軟骨片を洗います。
次に、オートクレーブハサミを使用して軟骨を直径約1〜2ミリメートルの断片に切断します。軟骨片を15ミリリットルのチューブに移し、オービタルシェーカーインキュベーターでDMEM中の0.01%コラゲナーゼ2型溶液で8〜12時間消化します。消化後、軟骨断片をDMEMで加え、チューブを300Gで10分間遠心分離します。
洗浄液を廃棄した後、断片を軟骨細胞培養培地に再懸濁し、0.1%ゼラチン溶液でプレコートした接着性T25フラスコに播種してインキュベートします。次に、細胞外タンパク質を含むマトリックスでプレコートされた6ウェルプレートで人工多能性幹細胞を培養します。軟骨細胞系への分化を開始するために、最初の2日間は培地AでiPS細胞を培養します。
3日目に、培地AをCHIR-99021とrho-kinase阻害剤を除外した溶液に交換し、他のすべての成分は変更しません。10日目に、軟骨細胞様細胞を軟骨形成を促進するように調製された培地Bに移し、次いで1.5%アルガロースを電子レンジで約60〜90秒間700ワットで溶融する。液化したら、75マイクロリットルのアガロースを96ウェル細胞懸濁培養プレートの各ウェルに加え、室温で硬化させます。
次に、各ウェルに150マイクロリットルのDMEMを加え、プレートを二酸化炭素インキュベーターで少なくとも12時間インキュベートします。12日目に、アンドロゲンに関連する表現型の変化を観察して、スフェロイドの開始に進みます。0.05%トリプシン溶液を使用して、プレートから80%の密度で細胞を剥離します。
等量のDMEMを10%FBSで添加した後、細胞を15ミリリットルのチューブに移し、200Gで5分間遠心分離します。細胞を1ミリリットルの培地Bに再懸濁し、0.1%ゼラチン溶液でプレコートした75平方センチメートルの細胞培養フラスコに移します。細胞が単層として80%のconfluencyに達すると、トリプシンでそれらを再度切り離し、培地B.Nowでそれらを再懸濁します 1.5%アガロースでコーティングされた96ウェルプレートに細胞を分配します ウェルあたり100, 000細胞の密度で、150マイクロリットルの培地B.インキュベート スフェロイドが形成されるまで、細胞を最小1日と最大3日間培養します。
次に、端がトリミングされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、スフェロイドをウェルから15ミリリットルのチューブに移します。スフェロイドを2〜3分間落ち着かせ、上清を取り除きます。次に、スフェロイドを、4°Cでテンパリングした解凍したばかりの原液の基底膜マトリックス溶液に浸します。
30分後、チューブを100Gで1分間遠心分離し、スフェロイドを回収します。最後に、スフェロイドを準備したミニバイオリアクターに移し、6ミリリットルの培地を追加しますB.ミニバイオリアクターを二酸化炭素インキュベーター内に配置します。分化の19日後、細胞の99%が軟骨形成マーカーaggrecan、コラーゲン1型、コラーゲン2型、およびSOX9を発現しました。
高品質の軟骨球は、分化の30日目に遺伝子発現分析を通じて評価された軟骨細胞遺伝子マーカーの少なくとも90〜95%の発現を持つものとして同定されました。成熟したスフェロイドは一貫した形態形成を示し、2か月後には典型的な直径1〜2ミリメートルに成長し、より大きなスフェロイドは空洞または壊死を伴う中央ゾーンを示しました。
