この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。

1. 誘導 PFVエシェリヒア属大腸菌に表現で
<ol><li>
大腸菌BL21(DE3) pLysS の 20 μ L に PFV の発現プラスミド (10 ng/μ L) の 1 μ L を追加 (市販の細胞の 20 μ 因数が > 2 × 106 CFU/μ g のプラスミド) 1.5 mL チューブに。指タップまたはフリック チューブでそっと混ぜます。孵化で氷の 5 分。
	<ol>
<li>まさに 30 衝撃を熱 42 ° C の水のお風呂と 2 分間氷にすぐに戻ります。</li>
		<li>カタボライト抑制 (SOC) メディアで室温超最適スープの 80 μ L を追加します。225 回転/分 (rpm) 揺れと 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>100 mm × 15 mm シャーレ ルリア スープ (LB) 寒天の 25 mL を含む混合物の 25 μ L をプレート (1 L LB 寒天: 15 g 寒天 10 g 食塩 5 g 酵母エキス、バクト トリプトン 10 g) と 100 μ g/mL アンピシリン (100 mg/mL 原液)。</li>
		<li>第 2 同一プレート上の変換セルの残りの 75 μ L をプレートします。37 ° C で一晩を蓋板を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プレートを取得変換大腸菌。LB の 3 mL を接種する単一コロニーを使用 (1 L LB: 10 g, 塩化ナトリウム 10 g、イースト 5 g、バクト トリプトンの抽出) ポリプロピレン文化 14 mL 丸底チューブの 100 μ g/mL アンピシリンと補われます。225 rpm の揺れで 37 ° C で 8 ~ 時間孵化させなさい。
	<ol>
<li>文化の 3 mL を 50 mL LB 100 μ g/mL アンピシリンと 250 mL の三角フラスコに 34 μ g/mL クロラムフェニ コール (34 mg/mL 原液) 補足に追加します。225 rpm の揺れで 37 ° C で一晩文化を孵化させなさい。</li>
		<li>1 L LB、100 μ g/mL アンピシリン、クロラムフェニ コール μ g/mL 34 4 L 三角フラスコに文化の 53 mL に転送します。225 rpm の揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>600 の光学濃度を測定定期的に文化の nm (外径600)。最初に、すべての h 文化外径600を確認します。文化目的 OD600に達すると、ないにはびこるに 15 分毎に確認してください。0.9 と 1.0 の間の OD600に文化を育てなさい。文化の温度を下げ、旋回し、フラスコを氷浴に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SDS-PAGE 分析の変化によって文化の 1 mL を 1.5 mL チューブを後で分析に転送します。
	<ol>
<li>室温で 14,000 x g でおよび microfuge で 1 分間遠心分離によって 1.5 mL チューブに細胞をペレットします。上清を捨てます。ピペッティングで 150 μ L リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でペレットを再懸濁します。PBS は、CaCl2と MgCl2なしまたは可能性があります。</li>
		<li>SDS-PAGE サンプルバッファー x 2 の 150 μ L を追加 (150 mM トリス-HCl、pH 6.8, 1.2% SDS 0.0018% ブロモフェノール ブルー、15% β-メルカプトエタノール (βME) 30% グリセロール) とピペットまたは渦流によって徹底的にミックスします。3 分で店-20 ° C の沸騰</li>
	</ol>
</li>
	<li>細菌培養に追加: 最終濃度 0.25 mM イソプロピル-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG、0.25 M 原液) と 50 μ M ZnCl2 (50 mM 原液)。IPTG は T7 プロモーターから PFVの遺伝子の発現を誘導して PFV インチ加温直後 4 h 225 rpm で振とうしながら 25 ° C で文化のアミノ ターミナル亜鉛フィンガー ドメインの正しい折りたたみのための補足として ZnCl2を追加フラスコを氷浴に転送します。1.3 で上記のように同じプロトコルの SDS-PAGE 解析の文化の 1 mL を保存します。</li>
	<li>
適切に大きさで分類された遠心ボトルに細菌培養を転送します。たとえば、1 L 文化は 4 滅菌使い捨て 250 mL コニカル底ポリプロピレン ボトルに転送する可能性があります。3000 × g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵卓上遠心でボトルをスピンします。注ぐことによって培養上清を捨てます。
	<ol>
<li>ピペッティングで 25 mL (ボトルあたり 6.25 mL) 冷 PBS (CaCl2と MgCl2有無にかかわらず) の容量 1 L 培養からペレットのすべてを再懸濁します。結合し、細菌懸濁液を 50 mL の円錐管に転送します。3,000 x g で 4 ° C で 20 分間の冷蔵遠心でスピンします。注ぐまたはピペットで上澄みを廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットで 10 mL 再懸濁バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) プロテアーゼ阻害剤) の細菌のペレットを再懸濁します。スナップは、50 mL のチューブを水没する十分な液体窒素デュワー フラスコにチューブを配置することによって、ペレットを凍結します。慎重に液体窒素からチューブを削除し、-80 ° C で保存 注意: 細菌のペレットは、-80 ° C で数ヶ月間保存します。我々 は次の 2 年間-80 ° C のストレージのアクティブなタンパク質のロスを見なかった。</li>
	<li>
サンプルの分析前誘導期およびポスト誘導 8.3 cm、幅 7.3 cm、高さ 0.75 mm 厚 SDS-PAGE ゲル層を積層 1.5 mL 6% ポリアクリルアミドゲルで (125 mM トリス-HCl、pH 6.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 6% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed) と 3.5 mL の 10%ポリアクリルアミド層の解決 (375 mM トリス-HCl、pH 8.8、過硫酸アンモニウム 0.1% 10% アクリルアミド、0.1 %sds、0.001 %temed)12。
	<ol>
<li>スタッキングのゲルを注入後 10 よく櫛を挿入します。ゲルが重合したときページ装置を組み立てるし、十分な SDS-PAGE 実行バッファー (25 mM トリス、グリシン 192 mM、0.1 %sds) を追加します。</li>
		<li>各サンプルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。16.5 V/cm 染料フロント約 60 分のゲルの底に到達するまで実行します。</li>
		<li>ゲル板を分解し、ゲルをプラスチック製の浴槽に転送します。Coomassie ブリリアント ブルー染色液 (0.1 %coomassie 鮮やかな青い R-250、40% メタノール、10% 酢酸) 惜しみなくゲルをカバーし、室温で 20 分間染色を追加します。</li>
		<li>染色液を注ぐことによって削除し、置換後の文字列は、ソリューション (40% メタノール、酢酸 10%) をすすぐバンドがすぐに表示されるまで。注ぐことによって脱染め色液を削除し、脱イオン水で置き換えます。PFV の後誘導サンプルで簡単に識別されます。PFV hexahistidine タグと持ち 47374 Da の分子量。</li>
		<li>PFV でが表示されない場合は、変換プレートの 1 つから別のコロニーから始まる誘導を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
<ol><li>氷の上の 1 つの細菌ペレットを解凍します。 注: これは重要な時間 (約 2-3 時間) かかります。ペレットは、セル スラリーを解凍して、追加の 500 μ M PMSF (100 mM 原液) を追加します。</li>
	<li>氷のスラリー菌 50 mL のチューブをしてください。30 の 30% 振幅で細菌を超音波 s (1 s、1 オフ s)、超音波発生装置を用いた 0.125 インチ直径 0.5 インチ直径バイオ ホーン 1 L 文化から派生したペレットあたりテーパ陰極、周波数 20 kHz、最大電力 400 W</li>
	<li>冷たい遠心チューブに細胞サンプルを転送します。ポリカーボネート ボトル アセンブリ (直径 25 mm、高さ 89 mm) タイプ 60 Ti 固定角ロータと互換性があるを使用します。同じ引力力が達成された場合は、代替管とローターを使用できます。4 ° C で 60 分スピン 120,000 x g明白なペレットがあります。上清は黄色の色にあります。</li>
	<li>注ぐまたは冷たい 50 mL の円錐管にピペットで上澄みを転送します。ボリュームに注意してください。このボリュームは、約凍結スナップ前に使用される再懸濁バッファーのボリュームをする必要があります。粘性上清の場合は、クロマトグラフィー コラムを詰らせることができる細菌の DNA によって汚染される可能性があります。この場合は、バクテリアの DNA をペレットに遠心を繰り返します。</li>
	<li>
500 ml (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M PMSF) をバッファーと 500 mL バッファー B (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、500 mM の NaCl、500 μ M 200 ミリメートル イミダゾール, PMSF)。 このプロトコルの注意: タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム、すべてのバッファー、サンプルで寒い部屋 4 ° C。<ol>
<li>滅菌フィルター バッファー A と B 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニット。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と A のバッファーとバッファー B ポンプ B を洗います。導電率、UV 測定値が安定するまでシステムをフローと 10% 90% バッファー A バッファー B。最大流量、道具に依存します。5 mL/min の流量、最大圧力 1.0 MPa まで使用です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>110 mm 長く、5 mm 径 FPLC 列 1.5 mL ニッケル充電樹脂の準備 (最大結合容量 50 mg/mL、最大圧力 1 MPa)。列は、精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。</li>
	<li>FPLC 計測器にカラムを接続します。0.5 MPa の最大圧力リミットを 10% バッファー B (20 mM イミダゾール) 0.5 mL/min の流速で 90% バッファー A の 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。</li>
	<li>
0.5 MPa の最大圧力制限で 0.15 mL/min の流量で列に蛋白質のサンプル (ペレットあたり 〜 10 mL) をロードします。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL のチューブの流れを収集します。
	<ol>
<li>コラムを洗浄 20 ml の 10% と 90% のバッファーはバッファー B. 収集 50 mL のチューブで、洗浄。20 mL 線形グラデーション 10 ~ 100% のバッファー B (20 mM 200 mM のイミダゾールから) とタンパク質を溶出します。</li>
		<li>5 mL 100% のバッファー B (イミダゾール 200 mM) を最後に、洗い流します。グラデーションと最終的な洗浄を収集0.27 mL 分数。
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れ、洗浄、およびピーク A280分数の 15 μ L と 2 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 15 μ L を組み合わせます。3 分のサンプルを沸騰させます。
	<ol>
<li>SDS ページのゲル 1.6 ステップを除く 15 よく櫛で前述 2 つの 10% を準備します。各サンプルをゲルの 10 μ L と prestained 蛋白質の標準の 4 μ L を読み込みます。実行、汚れ、および 1.6 の手順で説明するように、ゲルを分析します。</li>
		<li>ほぼ純粋な PFV の目視検査に基づくを含む表示分数を組み合わせます。通常 8-10 mL のピペットで、量を測定します。</li>
		<li>分光光度計を使用すると、結合された分数の A280を測定し、PFV のタンパク質の総量を計算私たちの典型的な収量は、誘導文化の L あたり 〜 10 mg です。Hexahistidine タグと PFV での消散係数は 59360 cm-1 M-1です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hexahistidine タグを削除するには、PFV の 10 mM ジチオトレイトール (DTT、1 M 原液) と 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 (0.5 M 原液) を補足します。4 ° C で一晩 mg PFV インチ加温当たりライノ (HRV) 3 C プロテアーゼの 15 μ g を追加します。胸の谷間と 44394 Da 47374 Da から PFV の分子量が低減され 10 %sds-page 解析による検証可能性があります。</li>
</ol>3. ヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
<ol><li>
250 ml バッファー C (50 mM トリス-HCl, pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M PMSF) と 250 mL のバッファー D (50 mM トリス-HCl、pH 7.5、10 mM DTT、0.1 ミリメートルの EDTA、500 μ M, PMSF 1 M NaCl)。 注意: このプロトコルで FPLC システム、バッファー、およびサンプルが保管 4 ° C で寒い部屋。<ol>
<li>滅菌フィルター バッファー C と 0.2 μ m ディスポーザブル フィルター ユニットと D。FPLC システムに応じてそれぞれポンプ A と C バッファーとバッファー D ポンプ B を洗います。導電性、紫外線測定値が安定するまでバッファー C 80% と 20% のバッファー D システムを介してを流れ。最大流量、道具に依存します。我々 は、最高圧力 1.0 MPa までと 5 mL/min の流速を日常的に使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
80 mm 長く、5 mm 直径 FPLC 列 1 ml のヘパリン セファローズ樹脂 (最大吸着容量 2.0 mg ウシのアンチトロンビン III の 1 mL あたりの樹脂; 最大圧力 1.4 MPa) を準備します。列を精製前に、の日に準備、4 ° C で保存されている可能性があります。FPLC 計測器にカラムを接続します。
	<ol>
<li>1 mpa 最大圧力制限付きバッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl) 0.5 mL/min の流速で 20 mL でコラムを平衡させ。楽器は、導電性、紫外線吸光度 280 のリアルタイム データを集めるべき nm (280)。導電率と UV 測定値が安定するはず。これらの測定値が安定しない場合は、彼らが安定するまでフロー バッファーの列に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 ボリューム c. バッファーを追加することによって PFV のサンプルで 200 mM の NaCl 濃度を減らすたとえば、バッファー C の 15 mL を 10 mL PFV インチ追加します。合計ボリュームは通常 ~ 25 mL です。</li>
	<li>
負荷最大圧力 0.5 mL/分の流量でヘパリン セファローズ列に希薄 PFV のサンプルは、1.0 MPa を制限します。流量とカラム圧力は浄化を通じて変わらない。50 mL の円錐管に流れを収集します。
	<ol>
<li>洗浄バッファー C 80% と 20% のバッファー D (200 mM の NaCl)、20 mL の列は 50 mL の円錐管に洗浄を収集します。(1 M の NaCl を 200 mM)、30 mL の線形グラデーション 20 ~ 100% のバッファー D 列を溶出します。</li>
		<li>0.37 mL の一部分で 100% 収集バッファー D. グラデーションと最終的な洗浄の 5 ml カラムを洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>8 割負荷、流れ、洗浄、および分数を分析 SDS-PAGE 2.9 に記載。PFV の次の hexahistidine タグの胸の谷間が 44394 Da の分子量と消散係数 59360 cm-1 M-1 hexahistidine タグなしのまま。ヌクレアーゼの分析が完了するまで 4 ° C ですべての分数を格納します。</li>
</ol>4. ヌクレアーゼ アッセイ
<ol><li>
分画ヘパリンと 50 のほぼ純粋な PFV インチを組み合わせる 3 μ L が含まれるヘパリン セファローズ分数を識別する 3 kb の ng スーパー プラスミド DNA 反応バッファー (10 mM HEPES、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4、4 μ M ZnCl2、10 mM DTT) 15 μ L の最終巻で。ない PFV インチで 90 分含む陰性対照の 37 ° C で孵化させなさい
	<ol>
<li>1 mg/mL, プロテイナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) と 0.5 %sds を停止 (10% 原液)。1 h. サンプルは、後で分析のための-20 ° C で保存されるかもしれないのは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイド (10 mg/mL 原液)13で 1 x TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose あたり 1% の重量のジェル 125 mL を準備します。アガロース溶液を溶融し、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイに注ぐ。5 mm、幅 0.75 mm 厚井戸と 15 も櫛を挿入します。細い井戸には、1.5 mm 厚井戸と比較してより良いバンド解像度が得られます。常温で固化するゲルを許可します。
	<ol>
<li>1 のゲルを浸す 0.1 μ G/ml エチジウム ブロマイドで x TAE。ヌクレアーゼ アッセイ反応にローディングの染料 (50% のグリセロール、0.15% オレンジ G 染料) x 6 の 3.5 μ L を追加します。ゲルに全体のボリュームをロードします。常温 1 時間またはオレンジ G 染料前ゲルの端に達するまで cm (100 V)/10 v 定電圧でゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
すぐにエチジウム ブロマイドを検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。3 kb で線形 DNA サイズに該当する実行、スーパー コイル DNA を高速 (~ 2 kb) を実行し、リラックスした環状 DNA が遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。
	<ol>
<li>画像解析ソフトを使用して、各レーンのスーパー、線形、およびリラックスした円のプラスミッドのピクセル量を計算します。これらの 3 つの DNA フォーム"総 DNA"ボリューム値し、線形とリラックスしたサークルの割合を計算を使用してピクセルの合計を呼び出します。たとえば、リラックスしたサークルのピクセル量は車線の合計 DNA ピクセル値で分割、この数を 100 パーセントを決定するために掛けます。汚染ヌクレアーゼを含む分数は、陰性対照と比較して線形とリラックスの円のより高いパーセントを表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>汚染のヌクレアーゼ活性を表示しないヘパリン セファローズ分数を組み合わせます。6-8 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 透析チューブ 50 mM トリス-HCl、pH 7.5、200 mM の NaCl、50 μ M ZnCl2、10 mM DTT、20% のグリセロールの 1 L に対して一晩 4 ° C で 10 mm の dialyze します。</li>
	<li>ヌクレアーゼ フリー PFV のサンプルを透析チューブから回復します。A280を測定し、最終的なタンパク質濃度を計算します。因数とスナップは、液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

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DNA 修復タンパク質 1 分子顕微鏡アプリケーション、またはレトロ ウイルス integrases の酸素スカベン ジャーなど DNA と相互作用する組換えタンパク質は汚染細菌核酸2,3の無料する必要があります。これらの汚染物質は、一括生化学的または単一分子アッセイ中に結果の解釈を混乱させるかもしれません。
我々 は、細菌のヌクレ...

蛋白質 DNA 相互作用の生化学的および単一分子の研究は、非常に純粋な組換えタンパク質を必要とします。これらのアッセイの結果を隠すことが汚染細菌の核酸分解酵素。汚染ヌクレアーゼは、組換えタンパク質酸素スカベン ジャー プロトカテク酸--3, 4-ジオキシゲナーゼ (PCD) とエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌)1から分離したプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) インテグラーゼ (IN) の準備で発見されています。,2,3。
レトロ ウイルスの統合の試金は、活動4の対策としてスーパー コイル DNA の刃こぼれしたりリニア製品への変換に依存します。細胞の感染ではウイルスの cDNA の 2 つの端をホスト クロマチン5に結合します。反応に参加する各端は、ストランドの転送と呼ばれます。アッセイの組換えの活動参加 2 つの DNA オリゴマー協調統合反応4,5,6,7,8でターゲット DNA に終了ウイルスの cDNA を模倣しました。また遺伝子組換えでは、非生理関連の半分サイト統合反応9,10で一端のみの DNA を結合するかもしれない。スーパー プラスミッド DNA のターゲットである統合、共同統合製品は、線形 DNA と半分のサイト統合製品は、リラックスしたサークル。これら反応生成物は agarose のゲルの電気泳動の1中の相対移動によって識別されます。遺伝子組換え汚染ヌクレアーゼ持ち、スプリアスのリラックスしたサークルや実験結果を混乱可能性線形プラスミッドがあるでしょう。ウイルスの DNA オリゴマーは、決定的ヌクレアーゼ製品ではなく、統合製品を識別するために蛍光に分類することがあります。ただしで大きくスーパー DNA ターゲットを支持します。スーパー プラスミドをリラックスしたサークルや汚染ヌクレアーゼによる線形 DNA の損失は結果とデータ11の解釈を歪めます。こうして準備でレトロ ウイルスから細菌の核酸を削除することが不可欠です。
PFV では、ヘパリン セファローズ細菌ヌクレアーゼ1と比較して、異なる親和性を持ってください。PFV とヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズから線形勾配溶出によって切り離されるかもしれない。ヌクレアーゼは、280 nm のピーク時に紫外線 (UV) 吸収すること分析ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって容易には検出されません。代わりに、ヌクレアーゼ スーパー プラスミドのリラックスしたサークルやリニア製品への変換を用いたヌクレアーゼ活性検出します。各分画ヘパリン セファローズ クロマトグラフィーを次のヌクレアーゼ活性テストされます。PFV とヌクレアーゼ汚染モノ Q 陰イオン樹脂の親和性には違いがあります。モノ S 陽イオン樹脂の親和性の差があります。しかし、細菌のヌクレアーゼと PFV のモノ S 解像度はタンパク質の効率的な分離を許さなかった。最終的には、ヘパリン セファローズ親和性の浄化は PFV IN から細菌ヌクレアーゼの最高の分離を提供して無制限の量の利点をいます。
ヌクレアーゼ活性の汚染のためのテストは、他の蛋白質に適応させること。興味の蛋白質は PFV の; より代替親和性特性に可能性が結合の関心とヌクレアーゼ汚染タンパク質の特性の違いは経験的に決まります。ヌクレアーゼの混入を識別するためのこの方法はモノ S 陽イオンまたはモノラル Q 陰イオン交換樹脂を含むその他の樹脂に適応させること。親和性とイオン交換樹脂クロマトグラフィー中タンパク質の量に制限のない核酸の汚染からの興味の組換えタンパク質を分離するための信頼できる方法があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

レトロ ウイルス プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) のインテグラーゼ (IN) タンパク質は、レトロ ウイルスの統合のメカニズムを研究するためのモデル酵素です。他のレトロ ウイルスからのに比べて、PFV ではより水溶性と実験操作に向いています。さらに、臨床的に関連するひと免疫不全ウイルス (HIV-1) の阻害剤、PFV での触媒機構がウイルス相補的 DNA (cDNA) ターゲットの共有結合に参加する HIV 1 インチのすることに似ていることを示唆しているに敏感です。プロセスの DNA では、ストランドの転送と呼ばれます。この鎖転移反応は、ターゲット DNA にニックを紹介します。統合反応生成物の分析は、同様にニック DNA 核酸の存在によって混同することができます。細菌ヌクレアーゼは、組換え PFV のエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 単位で共同浄化するために示されています。ここでヘパリン親和性クロマトグラフィーによる汚染のヌクレアーゼから PFV を分離する手法について述べる。分数は、スーパーのプラスミドと agarose のゲルの電気泳動のヌクレアーゼの混入のため簡単に上映されます。PFV および汚染のヌクレアーゼは、ヘパリン セファローズ統合の一括生化学的または単一分子解析に適した遺伝子組換え PFV のヌクレアーゼ フリーの準備を許可するため代替の親和性を表示します。

組換え PFV でしばしば細菌ヌクレアーゼ1で汚染されています。生化学的統合の試金はスーパー プラスミド DNA のリラックスした円とリニア製品への変換の量子化によって異なります。これらのアッセイのスプリアス定量汚染ヌクレアーゼの存在可能性があります。Hexahistidine タグを持つ PFV での式はエシェリヒア属大腸菌(図 1) に誘導される、ま?...

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K ビュー.  The Ohio State University College of Medicine. 組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼ タンパク質は精製時に細菌ヌクレアーゼと頻繁に汚染されています。このメソッドは、ヌクレアーゼの混入を識別し、酵素の最終的な準備から削除します。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去