Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

(1) induzieren PFV im Ausdruck in E. Coli
<ol><li>
20 μL der E. Coli BL21(DE3) pLysS 1 μL des PFV IN Expressionsplasmid (10 ng/μl) hinzufügen (20 μl aliquoten von kommerziell verfügbaren Zellen hat > 2 x 106 KBE/µg Plasmid) in einer 1,5 mL Tube. Mit dem Finger tippen oder streichen das Rohr mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 5 min auf Eis.
	<ol>
<li>Hitze-Schock für genau 30 s in einem 42 ° c Wasserbad und dann sofort um zu Eis für 2 min zurück.</li>
		<li>Fügen Sie 80 μl Raumtemperatur super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien. Inkubation für 1 h bei 37 ° c mit 225 Umdrehungen pro Minute (u/min) schütteln.</li>
		<li>Platte 25 μL der Mischung auf einer 100 x 15 mm Petrischale mit 25 mL Brühe (LB) Agar Luria (1 L LB-Agar: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g Agar) und 100 μg/mL Ampicillin (100 mg/mL Stammlösung).</li>
		<li>Die verbleibenden 75 μL der transformierten Zellen auf eine zweite identische Platte-Platte. Inkubieren Sie die Platten mit Deckel über Nacht bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Abrufen der Platten der transformierten E. Coli. Verwenden Sie eine einzige Kolonie 3 mL LB impfen (1 L LB: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefe Extrakt) mit 100 μg/mL Ampicillin in einem Rohr 14 mL Rundboden Polypropylen Kultur ergänzt. ~ 8 h bei 37 ° c mit schütteln 225 u/min inkubieren.
	<ol>
<li>50 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol (34 mg/mL Stammlösung) in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben ergänzt fügen Sie die 3 mL Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln 225 u/min.</li>
		<li>Übertragen Sie 53 mL Kultur auf 1 L LB, 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol in einem 4 L-Erlenmeyer-Kolben. Inkubation bei 37 ° C mit 225 u/min schütteln.</li>
		<li>Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Kultur in regelmäßigen Abständen. Zunächst prüfen der Kultur OD600 alle h. Da die Kultur der gewünschten OD600erreicht, überprüfen Sie alle 15 min nicht überwuchern. Wird die Kultur eines OD600 zwischen 0,9 und 1,0. Übertragen Sie die Flasche auf ein Eisbad und wirbeln um die Temperatur der Kultur zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Übertragen Sie 1 mL der Kultur auf eine 1,5 mL-Tube für eine spätere Analyse von denaturierenden SDS-PAGE-Analyse.
	<ol>
<li>Pellet-Zellen in der 1,5 mL Tube durch Zentrifugation für 1 min in einem Microfuge bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet in 150 μL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Pipettieren aufzuwirbeln. Die PBS kann mit oder ohne CaCl2 und MgCl2sein.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μL 2 x Probenpuffer SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2 % SDS, 30 % Glycerin, 15 % β-Mercaptoethanol (βME), 0,0018 % Bromophenol blue) durch Pipettieren oder Vortex mischen. Kochen für 3 min. Store bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Bakterienkultur hinzufügen: eine Endkonzentration von 0,25 mM Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M Stammlösung) und 50 μM ZnCl2 (50 mM Stammlösung). IPTG induziert die Expression des Gens PFV IN aus dem T7-Promotor und ZnCl2 wird als eine Ergänzung für die korrekte Faltung einer amino terminal Zink-Finger-Domäne im PFV IN. Incubate die Kultur bei 25 ° C mit Schütteln bei 225 u/min für 4 Std. sofort hinzugefügt übertragen Sie den Kolben auf ein Eisbad. 1 mL der Kultur für die SDS-PAGE-Analyse nach dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben in 1.3 zu retten.</li>
	<li>
Übertragen Sie die Bakterienkultur auf entsprechend großen Zentrifuge Flaschen. Beispielsweise kann eine 1 L-Kultur auf vier sterile Einweg-250 mL konischen Boden aus Polypropylen Flaschen übertragen werden. Drehen Sie die Flaschen in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge bei 3000 X g für 20 min bei 4 ° c. Verwerfen Sie Überstände durch Gießen.
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie aller die Pellets aus einem 1 L Bakterienkultur in einem Gesamtvolumen von 25 mL (6,25 mL pro Flasche) kaltem PBS (mit oder ohne CaCl2 und MgCl2) durch pipettieren. Kombinieren und die bakterielle Suspensionen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Drehen Sie in einer gekühlten Zentrifuge bei 3.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand durch Eingießen oder Pipettieren zu verwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, und 500 μM Phenylmethylsulfanoxide (PMSF) Protease-Hemmer) durch pipettieren. Snap freeze das Pellet indem man das Rohr in eine Dewar-Flasche mit flüssigem Stickstoff ausreicht, um die 50 mL-Tube zu tauchen. Sorgfältig entfernen Sie das Rohr aus flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C. Hinweis: Bakterielle Pellets können für mehrere Monate bei-80 ° c gelagert werden Wir haben gesehen, kein Verlust des aktiven Proteins nach-80 ° C Lagerung für zwei Jahre.</li>
	<li>
Die Pre-Induktion und Post-Induktion Proben analysieren von 8,3 cm breit, 7,3 cm hoch, 0,75 mm dick SDS-PAGE Gelen mit 1,5 mL 6 % Polyacrylamid Stapeln Schicht (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED) und 3,5 mL 10 % Polyacrylamid-Schicht zu lösen (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED)12.
	<ol>
<li>Fügen Sie nach dem Gießen des stapelnden Gels, 10 gut Kamm. Wenn das Gel polymerisiert hat, montieren Sie die Seite Apparat, und fügen Sie ausreichend SDS-PAGE laufenden Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS hinzu).</li>
		<li>Last 10 μL jeder Probe und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie mit 16,5 V/cm bis Farbstoff vorne den Boden des Gels, ca. 60 min erreicht.</li>
		<li>Zerlegen Sie die Gel-Platten und übertragen Sie das Gel auf eine Plastikwanne. Fügen Sie Coomassie Brilliant Blue Färbelösung (0,1 % Coomassie brilliant blue R-250, 40 % Methanol, 10 % Essigsäure) großzügig bedecken das Gel und Flecken für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Durch das Gießen der Färbelösung zu entfernen und ersetzen mit destain Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure) bis Bands gut sichtbar sind. Entfernen Sie die destaining Lösung durch Gießen und mit entionisiertem Wasser ersetzen. PFV IN sollte leicht in der Post-Induktion Probe identifiziert werden. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag hat ein Molekulargewicht von 47374 Da.</li>
		<li>Wenn PFV IN nicht angezeigt wird, wiederholen Sie die Induktion, beginnend mit einer unterschiedlichen Kolonie von einem der Transformation Platten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Nickel Affinitätschromatographie
<ol><li>Eine bakterielle Pellet auf Eis auftauen. Hinweis: Dies dauert viel Zeit (ca. 2-3 h). Wenn die Tablette für eine Zelle Gülle aufgetaut ist, fügen Sie eine zusätzliche 500 μM PMSF (100 mM Stammlösung).</li>
	<li>Halten Sie die 50 mL-Tube von Bakterien Gülle auf Eis. Beschallen die Bakterien bei 30 % Amplitude für 30 s (1 s, 1 s aus) pro Kugel abgeleitet von 1 L Kultur mit einem Sonikator mit einem 0,5 Zoll Durchmesser Bio Horn mit 0,125 Zoll Durchmesser verjüngt, Mikrospitze, einer Frequenz von 20 kHz und maximale Leistung von 400 w.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellprobe auf einem kalten Ultrazentrifugen Rohr. Verwenden Sie Polycarbonat Flasche Baugruppen (Durchmesser 25 mm, 89 mm Höhe) mit einem festen Winkel Rotor Typ 60 Ti kompatibel. Alternative Röhren und Rotoren können verwendet werden, wenn die gleiche Kraft der Gravitation erreicht wird. Spin-120.000 x g für 60 min bei 4 ° C. Es sollte eine offensichtliche Pellet. Der Überstand haben eine gelbe Farbe.</li>
	<li>Den Überstand durch Eingießen oder eine kalt 50 mL konische Röhrchen pipettieren zu übertragen. Beachten Sie die Lautstärke; Dieses Volumen sollte etwa das Volumen der Wiederfreisetzung Puffer vor dem Snap Einfrieren verwendet werden. Wenn der Überstand zähflüssig ist, kann es durch bakterielle DNA kontaminiert sein die die Chromatographiesäule verstopfen könnte. Wiederholen Sie in diesem Fall die Ultrazentrifugation um die bakterielle DNA pellet.</li>
	<li>
Bereiten Sie 500 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) und 500 mL Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol). Hinweis: In diesem Protokoll halten Sie das schnelle Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System, alle Puffer und die Probe bei 4 ° C in einem kalten Raum.<ol>
<li>Sterilfilter Puffer A und B mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer A und Puffer B bzw.. Durchfluss 90 % Puffer A und 10 % Puffer B durch das System bis zur Stabilisierung der Leitfähigkeit und UV-Lesungen. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Verwenden Sie einen Durchfluss von 5 mL/min mit maximalem Druck maximal 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 110 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1,5 mL Nickel-geladene Harz (maximale Bindungskapazität 50 mg/mL, max. Druck 1 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert.</li>
	<li>Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B (20 mM Imidazol) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.</li>
	<li>
Laden Sie die Protein-Probe (~ 10 mL pro Kugel) in die Spalte mit einer Durchflussrate von 0,15 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Sammeln der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
	<ol>
<li>Waschen Sie die Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B. sammeln die Wäsche in einer 50 mL-Tube. Die Proteine mit einer 20 mL lineare Steigung von 10 % bis 100 % Puffer B (20 mM bis 200 mM Imidazol) eluieren.</li>
		<li>Schließlich waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer B (200 mM Imidazol). Sammeln die gradient und letzte Wäsche in 0,27 mL Fraktionen.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kombinieren Sie 15 μl Probenpuffer 2 X SDS-PAGE mit 15 μl der Strömung durch Waschen und Peak A280 Brüche. Kochen Sie die Proben 3 min.
	<ol>
<li>Bereiten Sie zwei 10 %, die SDS-PAGE Gelen bereits in Schritt 1.6 außer mit 15 gut kämmen beschrieben. Last 10 μL jeder Probe, die Gele und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie, färben Sie, und analysieren Sie die Gele zu, wie unter Punkt 1.6 beschrieben.</li>
		<li>Kombinieren Sie Brüche, die scheinbar fast reine PFV IN basierend auf visuelle Inspektion enthalten. Messen Sie das Volumen durch pipettieren, in der Regel 8 bis 10 mL.</li>
		<li>Mit einem Spektralphotometer, Messen Sie A280 der kombinierten Fraktionen und berechnen Sie die Gesamtmenge des PFV IN Protein; unsere typische Ausbeute ist ~ 10 mg / L der induzierten Kultur. Der vom Aussterben bedroht-Koeffizient der PFV IN mit dem Hexahistidine-Tag ist 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den Hexahistidine-Tag entfernen, ergänzen Sie die PFV IN mit 10 mM Dithiothreitol (DTT, Stammlösung 1 M) und 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M-Stammlösung). Fügen Sie 15 μg des menschlichen Rhinovirus (HRV) 3C Protease pro mg PFV IN. Incubate bei 4 ° c über Nacht. Spaltung verringert das PFV IN Molekulargewicht von 47374 Da 44394 da und durch 10 % SDS-PAGE-Analyse überprüft werden kann.</li>
</ol>(3) Heparin Affinitätschromatographie
<ol><li>
Bereiten Sie 250 mL Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF) und 250 mL Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Hinweis: In diesem Protokoll werden die FPLC System, Puffer und Probe in einem Kühlraum bei 4 ° c gehalten.<ol>
<li>Sterilfilter Puffer C und D mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer C und Puffer D bzw.. Fließen Sie 80 % Puffer C und 20 % Puffer D durch das System, bis die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Wir verwenden routinemäßig einen Durchfluss von 5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine 80 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1 mL Heparin-Sepharose-Harz (maximale Bindungskapazität 2,0 mg Rinder antithrombin III pro mL Harz; max. Druck 1,4 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument.
	<ol>
<li>Equilibrate der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck-Limit von 1 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reduzieren Sie die NaCl-Konzentration der Probe PFV IN bis zu 200 mM durch Zugabe von 1,5 Volumen Puffer C. Fügen Sie beispielsweise 15 mL Puffer C bis 10 mL PFV Zoll Die Gesamtmenge ist in der Regel ~ 25 mL.</li>
	<li>
Belastung der verdünnten Probe der PFV IN der Heparin-Sepharose-Spalte bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit einem maximalen Druck 1,0 MPa zu begrenzen. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Der Durchfluss in einem 50 mL konische Röhrchen zu sammeln.
	<ol>
<li>Waschen der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl), sammeln die Wäsche in einem 50 mL konische Röhrchen. Die Spalte mit einer 30 mL lineare Steigung von 20 % bis 100 % Puffer D (200 mM bis 1 M NaCl) eluieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer D. sammeln die Steigung und endgültige Wash in 0,37 mL Fraktionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Last, Durchströmung, waschen und Brüche zu analysieren, um 8 % SDS-PAGE wie in 2,9 beschrieben. PFV IN nach Spaltung des Hexahistidine Tags hat ein Molekulargewicht von 44394 Da und die vom Aussterben bedroht-Koeffizient bleibt 59360 cm-1 M-1 ohne den Hexahistidine Tag. Speichern Sie alle Fraktionen bei 4 ° c bis zur Fertigstellung eines Nuklease-Assays.</li>
</ol>4. Nuklease-assay
<ol><li>
Identifizieren von Heparin-Sepharose-Fraktionen, die scheinbar fast reine PFV Zoll kombinieren 3 μl Heparin Bruchteil und 50 enthalten ng 3 kb supercoiled Plasmid-DNA in Reaktion Puffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) mit einem Endvolumen von 15 μl. Inkubation bei 37 ° c für 90 min. Include eine Negativkontrolle mit keine PFV IN.
	<ol>
<li>Stoppen Sie die Reaktion mit 1 mg/mL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,5 % SDS (10 % Stammlösung). Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde Proben bei-20 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Gel 125 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose in 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid (10 mg/mL Stammlösung)13. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung und gießen Sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15 gut Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Wells. Dünne Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen.
	<ol>
<li>Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid. Die Nuklease Assay Reaktionen fügen Sie 3,5 μl 6 x laden Farbstoff (50 % Glycerin, 0,15 % Orange G Farbstoff hinzu). Laden Sie das gesamte Volumen, das Gel. Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 Volt pro cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner Interkalation Bromid überschreitet. Lineare DNA sollte maßhaltig bei 3 kb laufen, supercoiled DNA laufen schneller (~ 2 kb) und entspannten Kreis DNA läuft langsamer (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Berechnen Sie Bildanalyse-Software verwenden, die Pixel Volumen des Plasmids in jeder Bahn supercoiled, lineare und entspannten Kreis. Rufen Sie die Summe des Pixels Bände für diese drei DNA-Formen der "Gesamt-DNA" schätzen und es verwenden, um den Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise berechnen. Z. B. gliedert sich die Pixel-Lautstärke entspannt Kreise durch DNA-Pixel den Gesamtwert in dieser Spur, multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um einen Prozentsatz zu ermitteln. Brüche, die kontaminierenden Nuklease enthalten zeigen einen höheren Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise im Vergleich zu der negativen Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie Heparin-Sepharose-Fraktionen, die nicht kontaminierenden Nuklease Aktivität angezeigt werden. Dialyse in 10 mm 6-8 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) Dialyse Schläuche bei 4 ° C über Nacht gegen 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20 % Glycerin.</li>
	<li>Der Nuklease-freie PFV IN Sample von Dialyse Schläuche zu erholen. Messen Sie die A280 und berechnen Sie die endgültigen Proteinkonzentration. Aliquoten und Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.
Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV...

Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)1 isoliert , 2 , 3.
Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA, geklaut oder lineare Produkte als Maß für die Aktivität4. Im zellulären Infektion tritt IN die beiden Enden der viralen DNA an die Host-Chromatin-5. Jedem Ende Beitritt Reaktion wird als Strang Transfer bezeichnet. Assays von rekombinanten IN Aktivität kann beitreten zwei DNA-Oligomere imitiert die virale cDNA zu einem Ziel DNA in einem abgestimmten Integration Reaktion4,5,6,7,8endet. Alternativ kann rekombinante IN nur einem DNA-Ende nicht physiologisch relevanten halbe Seite Integration Reaktion9,10teilnehmen. Wenn supercoiled Plasmid-DNA das Ziel der ist Integration, abgestimmte Integration sind Produkte linearisiert DNA und eine halbe Seite Integrationsprodukte sind entspannt Kreise. Diese Reaktionsprodukte sind durch ihre relative Mobilität während Agarose-Gel-Elektrophorese1identifiziert. Wenn die rekombinante IN einen kontaminierenden Nuklease verfügt, werden falsche entspannt Kreise oder eine möglicherweise linearisierten Plasmid verwirrend die experimentellen Ergebnisse. Virale DNA-Oligomere können Eindringmittel markiert werden, um schlüssig Integrationsprodukte, im Gegensatz zu Nuklease Produkten identifizieren. Jedoch bevorzugt stark supercoiled DNA Ziele; der Verlust von supercoiled Plasmid entspannt Kreise oder lineare DNA von kontaminierenden Nuklease Labelling Ergebnisse und Interpretation von Daten11. So ist es zwingend notwendig, um bakterielle Nukleasen von Retroviren IN Vorbereitungen zu entfernen.
PFV IN hat eine unterschiedliche Affinität zu Heparin-Sepharose im Vergleich zu den bakteriellen Nuklease-1. PFV IN und der Nuklease können durch einen linearen Farbverlauf Elution von Heparin Sepharose abgetrennt werden. Die Nuklease ist nicht ohne weiteres durch eine ultraviolette (UV)-Extinktion auf 280 nm Höhepunkt oder analytische Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erkannt. Stattdessen wird der Nuklease durch eine Nuklease Aktivität Assay beschäftigt die Umwandlung von supercoiled Plasmid zu entspannt Kreise oder lineare Produkte erkannt. Jede Fraktion nach Heparin-Sepharose-Chromatographie wird für Nuklease Aktivität getestet. PFV IN und der Nuklease Verunreinigung haben keinen Unterschied in der Affinität für Mono-Q Anion Harz. Es gibt einen kleinen Unterschied in Affinität für Mono-S kation Harz. Jedoch würde die Mono-S-Auflösung der bakteriellen Nuklease und PFV IN effiziente Trennung der Proteine nicht zulassen. Letztlich bietet die beste Trennung von bakteriellen Nuklease aus PFV IN Heparin Sepharose Affinitätsreinigung und hat den Vorteil der unbegrenzten Ladevolumen.
Tests für kontaminierende Nuklease Aktivität kann an andere Proteine angepasst werden. Das Protein des Interesses haben wahrscheinlich alternative Affinität Eigenschaften als PFV IN; der Unterschied in der bindenden Eigenschaften des Proteins des Interesses und der Nuklease Verunreinigung muss empirisch ermittelt werden. Diese Methodik zur Ermittlung der Nuklease Kontamination kann an anderen Harzen einschließlich Mono-S kation oder Anion Austausch Harze Mono-Q angepasst werden. Affinität und Ionenaustausch Harze können eine zuverlässige Methode um eine rekombinante Protein des Interesses von kontaminierenden Nukleasen ohne Grenzen auf dem Datenträger des Proteins während der Chromatographie isolieren anbieten.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.

Rekombinante PFV IN ist oft mit einer bakteriellen Nuklease1kontaminiert. Biochemische Integration Tests hängen die Quantifizierung der Umwandlung von supercoiled Plasmid DNA zu entspannten Kreisen und lineare Produkte. Das Vorhandensein von kontaminierenden Nuklease könnten falsche Quantifizierung dieser Assays. Ausdruck von PFV IN mit einem Hexahistidine Tag in E. Coli (Abbildung 1) induziert und zuerst gereinigt durch Nickel-Affinitätschromatographie (<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K Aufrufe.  The Ohio State University College of Medicine. Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Serie: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologie

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genetik

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Aufreinigung von AAV-Vektoren durch einstufige Heparin-Affinitätschromatographie

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Methode zur Herstellung und Reinigung von adeno-assoziierten viralen Vektoren

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

Isolierung der viralen Replikation Compartment angereicherte Teil nuklearen Fraktionen von Adenovirus-infizierten normalen menschlichen Zellen

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll