Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

(1) induzieren PFV im Ausdruck in E. Coli
<ol><li>
20 μL der E. Coli BL21(DE3) pLysS 1 μL des PFV IN Expressionsplasmid (10 ng/μl) hinzufügen (20 μl aliquoten von kommerziell verfügbaren Zellen hat > 2 x 106 KBE/µg Plasmid) in einer 1,5 mL Tube. Mit dem Finger tippen oder streichen das Rohr mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 5 min auf Eis.
	<ol>
<li>Hitze-Schock für genau 30 s in einem 42 ° c Wasserbad und dann sofort um zu Eis für 2 min zurück.</li>
		<li>Fügen Sie 80 μl Raumtemperatur super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien. Inkubation für 1 h bei 37 ° c mit 225 Umdrehungen pro Minute (u/min) schütteln.</li>
		<li>Platte 25 μL der Mischung auf einer 100 x 15 mm Petrischale mit 25 mL Brühe (LB) Agar Luria (1 L LB-Agar: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g Agar) und 100 μg/mL Ampicillin (100 mg/mL Stammlösung).</li>
		<li>Die verbleibenden 75 μL der transformierten Zellen auf eine zweite identische Platte-Platte. Inkubieren Sie die Platten mit Deckel über Nacht bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Abrufen der Platten der transformierten E. Coli. Verwenden Sie eine einzige Kolonie 3 mL LB impfen (1 L LB: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g Hefe Extrakt) mit 100 μg/mL Ampicillin in einem Rohr 14 mL Rundboden Polypropylen Kultur ergänzt. ~ 8 h bei 37 ° c mit schütteln 225 u/min inkubieren.
	<ol>
<li>50 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol (34 mg/mL Stammlösung) in einen 250-mL-Erlenmeyerkolben ergänzt fügen Sie die 3 mL Kultur hinzu. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C mit schütteln 225 u/min.</li>
		<li>Übertragen Sie 53 mL Kultur auf 1 L LB, 100 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol in einem 4 L-Erlenmeyer-Kolben. Inkubation bei 37 ° C mit 225 u/min schütteln.</li>
		<li>Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Kultur in regelmäßigen Abständen. Zunächst prüfen der Kultur OD600 alle h. Da die Kultur der gewünschten OD600erreicht, überprüfen Sie alle 15 min nicht überwuchern. Wird die Kultur eines OD600 zwischen 0,9 und 1,0. Übertragen Sie die Flasche auf ein Eisbad und wirbeln um die Temperatur der Kultur zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Übertragen Sie 1 mL der Kultur auf eine 1,5 mL-Tube für eine spätere Analyse von denaturierenden SDS-PAGE-Analyse.
	<ol>
<li>Pellet-Zellen in der 1,5 mL Tube durch Zentrifugation für 1 min in einem Microfuge bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet in 150 μL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Pipettieren aufzuwirbeln. Die PBS kann mit oder ohne CaCl2 und MgCl2sein.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μL 2 x Probenpuffer SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2 % SDS, 30 % Glycerin, 15 % β-Mercaptoethanol (βME), 0,0018 % Bromophenol blue) durch Pipettieren oder Vortex mischen. Kochen für 3 min. Store bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Bakterienkultur hinzufügen: eine Endkonzentration von 0,25 mM Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M Stammlösung) und 50 μM ZnCl2 (50 mM Stammlösung). IPTG induziert die Expression des Gens PFV IN aus dem T7-Promotor und ZnCl2 wird als eine Ergänzung für die korrekte Faltung einer amino terminal Zink-Finger-Domäne im PFV IN. Incubate die Kultur bei 25 ° C mit Schütteln bei 225 u/min für 4 Std. sofort hinzugefügt übertragen Sie den Kolben auf ein Eisbad. 1 mL der Kultur für die SDS-PAGE-Analyse nach dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben in 1.3 zu retten.</li>
	<li>
Übertragen Sie die Bakterienkultur auf entsprechend großen Zentrifuge Flaschen. Beispielsweise kann eine 1 L-Kultur auf vier sterile Einweg-250 mL konischen Boden aus Polypropylen Flaschen übertragen werden. Drehen Sie die Flaschen in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge bei 3000 X g für 20 min bei 4 ° c. Verwerfen Sie Überstände durch Gießen.
	<ol>
<li>Aufschwemmen Sie aller die Pellets aus einem 1 L Bakterienkultur in einem Gesamtvolumen von 25 mL (6,25 mL pro Flasche) kaltem PBS (mit oder ohne CaCl2 und MgCl2) durch pipettieren. Kombinieren und die bakterielle Suspensionen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Drehen Sie in einer gekühlten Zentrifuge bei 3.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand durch Eingießen oder Pipettieren zu verwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, und 500 μM Phenylmethylsulfanoxide (PMSF) Protease-Hemmer) durch pipettieren. Snap freeze das Pellet indem man das Rohr in eine Dewar-Flasche mit flüssigem Stickstoff ausreicht, um die 50 mL-Tube zu tauchen. Sorgfältig entfernen Sie das Rohr aus flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C. Hinweis: Bakterielle Pellets können für mehrere Monate bei-80 ° c gelagert werden Wir haben gesehen, kein Verlust des aktiven Proteins nach-80 ° C Lagerung für zwei Jahre.</li>
	<li>
Die Pre-Induktion und Post-Induktion Proben analysieren von 8,3 cm breit, 7,3 cm hoch, 0,75 mm dick SDS-PAGE Gelen mit 1,5 mL 6 % Polyacrylamid Stapeln Schicht (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED) und 3,5 mL 10 % Polyacrylamid-Schicht zu lösen (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 % Acrylamid, 0,1 % SDS, 0,1 % Ammonium Bleichen, 0,001 % TEMED)12.
	<ol>
<li>Fügen Sie nach dem Gießen des stapelnden Gels, 10 gut Kamm. Wenn das Gel polymerisiert hat, montieren Sie die Seite Apparat, und fügen Sie ausreichend SDS-PAGE laufenden Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS hinzu).</li>
		<li>Last 10 μL jeder Probe und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie mit 16,5 V/cm bis Farbstoff vorne den Boden des Gels, ca. 60 min erreicht.</li>
		<li>Zerlegen Sie die Gel-Platten und übertragen Sie das Gel auf eine Plastikwanne. Fügen Sie Coomassie Brilliant Blue Färbelösung (0,1 % Coomassie brilliant blue R-250, 40 % Methanol, 10 % Essigsäure) großzügig bedecken das Gel und Flecken für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Durch das Gießen der Färbelösung zu entfernen und ersetzen mit destain Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure) bis Bands gut sichtbar sind. Entfernen Sie die destaining Lösung durch Gießen und mit entionisiertem Wasser ersetzen. PFV IN sollte leicht in der Post-Induktion Probe identifiziert werden. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag hat ein Molekulargewicht von 47374 Da.</li>
		<li>Wenn PFV IN nicht angezeigt wird, wiederholen Sie die Induktion, beginnend mit einer unterschiedlichen Kolonie von einem der Transformation Platten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Nickel Affinitätschromatographie
<ol><li>Eine bakterielle Pellet auf Eis auftauen. Hinweis: Dies dauert viel Zeit (ca. 2-3 h). Wenn die Tablette für eine Zelle Gülle aufgetaut ist, fügen Sie eine zusätzliche 500 μM PMSF (100 mM Stammlösung).</li>
	<li>Halten Sie die 50 mL-Tube von Bakterien Gülle auf Eis. Beschallen die Bakterien bei 30 % Amplitude für 30 s (1 s, 1 s aus) pro Kugel abgeleitet von 1 L Kultur mit einem Sonikator mit einem 0,5 Zoll Durchmesser Bio Horn mit 0,125 Zoll Durchmesser verjüngt, Mikrospitze, einer Frequenz von 20 kHz und maximale Leistung von 400 w.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellprobe auf einem kalten Ultrazentrifugen Rohr. Verwenden Sie Polycarbonat Flasche Baugruppen (Durchmesser 25 mm, 89 mm Höhe) mit einem festen Winkel Rotor Typ 60 Ti kompatibel. Alternative Röhren und Rotoren können verwendet werden, wenn die gleiche Kraft der Gravitation erreicht wird. Spin-120.000 x g für 60 min bei 4 ° C. Es sollte eine offensichtliche Pellet. Der Überstand haben eine gelbe Farbe.</li>
	<li>Den Überstand durch Eingießen oder eine kalt 50 mL konische Röhrchen pipettieren zu übertragen. Beachten Sie die Lautstärke; Dieses Volumen sollte etwa das Volumen der Wiederfreisetzung Puffer vor dem Snap Einfrieren verwendet werden. Wenn der Überstand zähflüssig ist, kann es durch bakterielle DNA kontaminiert sein die die Chromatographiesäule verstopfen könnte. Wiederholen Sie in diesem Fall die Ultrazentrifugation um die bakterielle DNA pellet.</li>
	<li>
Bereiten Sie 500 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) und 500 mL Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol). Hinweis: In diesem Protokoll halten Sie das schnelle Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System, alle Puffer und die Probe bei 4 ° C in einem kalten Raum.<ol>
<li>Sterilfilter Puffer A und B mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer A und Puffer B bzw.. Durchfluss 90 % Puffer A und 10 % Puffer B durch das System bis zur Stabilisierung der Leitfähigkeit und UV-Lesungen. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Verwenden Sie einen Durchfluss von 5 mL/min mit maximalem Druck maximal 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 110 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1,5 mL Nickel-geladene Harz (maximale Bindungskapazität 50 mg/mL, max. Druck 1 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert.</li>
	<li>Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument. Equilibrate der Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B (20 mM Imidazol) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.</li>
	<li>
Laden Sie die Protein-Probe (~ 10 mL pro Kugel) in die Spalte mit einer Durchflussrate von 0,15 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 0,5 MPa. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Sammeln der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
	<ol>
<li>Waschen Sie die Spalte mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B. sammeln die Wäsche in einer 50 mL-Tube. Die Proteine mit einer 20 mL lineare Steigung von 10 % bis 100 % Puffer B (20 mM bis 200 mM Imidazol) eluieren.</li>
		<li>Schließlich waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer B (200 mM Imidazol). Sammeln die gradient und letzte Wäsche in 0,27 mL Fraktionen.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kombinieren Sie 15 μl Probenpuffer 2 X SDS-PAGE mit 15 μl der Strömung durch Waschen und Peak A280 Brüche. Kochen Sie die Proben 3 min.
	<ol>
<li>Bereiten Sie zwei 10 %, die SDS-PAGE Gelen bereits in Schritt 1.6 außer mit 15 gut kämmen beschrieben. Last 10 μL jeder Probe, die Gele und 4 μL prestained Protein-Standards. Laufen Sie, färben Sie, und analysieren Sie die Gele zu, wie unter Punkt 1.6 beschrieben.</li>
		<li>Kombinieren Sie Brüche, die scheinbar fast reine PFV IN basierend auf visuelle Inspektion enthalten. Messen Sie das Volumen durch pipettieren, in der Regel 8 bis 10 mL.</li>
		<li>Mit einem Spektralphotometer, Messen Sie A280 der kombinierten Fraktionen und berechnen Sie die Gesamtmenge des PFV IN Protein; unsere typische Ausbeute ist ~ 10 mg / L der induzierten Kultur. Der vom Aussterben bedroht-Koeffizient der PFV IN mit dem Hexahistidine-Tag ist 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den Hexahistidine-Tag entfernen, ergänzen Sie die PFV IN mit 10 mM Dithiothreitol (DTT, Stammlösung 1 M) und 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M-Stammlösung). Fügen Sie 15 μg des menschlichen Rhinovirus (HRV) 3C Protease pro mg PFV IN. Incubate bei 4 ° c über Nacht. Spaltung verringert das PFV IN Molekulargewicht von 47374 Da 44394 da und durch 10 % SDS-PAGE-Analyse überprüft werden kann.</li>
</ol>(3) Heparin Affinitätschromatographie
<ol><li>
Bereiten Sie 250 mL Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF) und 250 mL Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DVB-t, 0, 1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). Hinweis: In diesem Protokoll werden die FPLC System, Puffer und Probe in einem Kühlraum bei 4 ° c gehalten.<ol>
<li>Sterilfilter Puffer C und D mit 0,2 μm Einweg Filtereinheiten. Je nach System FPLC waschen Sie Pumpe A und B Pumpe mit Puffer C und Puffer D bzw.. Fließen Sie 80 % Puffer C und 20 % Puffer D durch das System, bis die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren. Die maximale Durchflussmenge hängt das Instrument; Wir verwenden routinemäßig einen Durchfluss von 5 mL/min mit einem maximalen Druck Grenzwert von 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine 80 mm lange, 5 mm Durchmesser FPLC Spalte mit 1 mL Heparin-Sepharose-Harz (maximale Bindungskapazität 2,0 mg Rinder antithrombin III pro mL Harz; max. Druck 1,4 MPa). Die Spalte kann am Vortag Reinigung vorbereitet und bei 4 ° c gelagert Schließen Sie die Spalte an das FPLC Instrument.
	<ol>
<li>Equilibrate der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min mit einem maximalen Druck-Limit von 1 MPa. Das Instrument sollte sammeln von Echtzeit-Daten von Leitfähigkeit und UV-Absorption bei 280 nm (ein280). Die Leitfähigkeit und UV Lesungen stabilisieren sollte. Wenn diese Werte nicht stabilisiert haben, weiterhin fließen Puffer durch die Spalte bis sie stabil sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reduzieren Sie die NaCl-Konzentration der Probe PFV IN bis zu 200 mM durch Zugabe von 1,5 Volumen Puffer C. Fügen Sie beispielsweise 15 mL Puffer C bis 10 mL PFV Zoll Die Gesamtmenge ist in der Regel ~ 25 mL.</li>
	<li>
Belastung der verdünnten Probe der PFV IN der Heparin-Sepharose-Spalte bei 0,5 mL/min Durchflussmenge mit einem maximalen Druck 1,0 MPa zu begrenzen. Der Fließdruck Rate und Spalte bleibt unverändert während der Reinigung. Der Durchfluss in einem 50 mL konische Röhrchen zu sammeln.
	<ol>
<li>Waschen der Spalte mit 20 mL 80 % Puffer C und 20 % Puffer D (200 mM NaCl), sammeln die Wäsche in einem 50 mL konische Röhrchen. Die Spalte mit einer 30 mL lineare Steigung von 20 % bis 100 % Puffer D (200 mM bis 1 M NaCl) eluieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte mit 5 mL 100 % Puffer D. sammeln die Steigung und endgültige Wash in 0,37 mL Fraktionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Last, Durchströmung, waschen und Brüche zu analysieren, um 8 % SDS-PAGE wie in 2,9 beschrieben. PFV IN nach Spaltung des Hexahistidine Tags hat ein Molekulargewicht von 44394 Da und die vom Aussterben bedroht-Koeffizient bleibt 59360 cm-1 M-1 ohne den Hexahistidine Tag. Speichern Sie alle Fraktionen bei 4 ° c bis zur Fertigstellung eines Nuklease-Assays.</li>
</ol>4. Nuklease-assay
<ol><li>
Identifizieren von Heparin-Sepharose-Fraktionen, die scheinbar fast reine PFV Zoll kombinieren 3 μl Heparin Bruchteil und 50 enthalten ng 3 kb supercoiled Plasmid-DNA in Reaktion Puffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) mit einem Endvolumen von 15 μl. Inkubation bei 37 ° c für 90 min. Include eine Negativkontrolle mit keine PFV IN.
	<ol>
<li>Stoppen Sie die Reaktion mit 1 mg/mL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,5 % SDS (10 % Stammlösung). Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde Proben bei-20 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Gel 125 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose in 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid (10 mg/mL Stammlösung)13. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung und gießen Sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15 gut Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Wells. Dünne Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen.
	<ol>
<li>Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 µg/mL Interkalation Bromid. Die Nuklease Assay Reaktionen fügen Sie 3,5 μl 6 x laden Farbstoff (50 % Glycerin, 0,15 % Orange G Farbstoff hinzu). Laden Sie das gesamte Volumen, das Gel. Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 Volt pro cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner Interkalation Bromid überschreitet. Lineare DNA sollte maßhaltig bei 3 kb laufen, supercoiled DNA laufen schneller (~ 2 kb) und entspannten Kreis DNA läuft langsamer (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Berechnen Sie Bildanalyse-Software verwenden, die Pixel Volumen des Plasmids in jeder Bahn supercoiled, lineare und entspannten Kreis. Rufen Sie die Summe des Pixels Bände für diese drei DNA-Formen der "Gesamt-DNA" schätzen und es verwenden, um den Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise berechnen. Z. B. gliedert sich die Pixel-Lautstärke entspannt Kreise durch DNA-Pixel den Gesamtwert in dieser Spur, multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um einen Prozentsatz zu ermitteln. Brüche, die kontaminierenden Nuklease enthalten zeigen einen höheren Prozentsatz der linearen und entspannt Kreise im Vergleich zu der negativen Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie Heparin-Sepharose-Fraktionen, die nicht kontaminierenden Nuklease Aktivität angezeigt werden. Dialyse in 10 mm 6-8 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) Dialyse Schläuche bei 4 ° C über Nacht gegen 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20 % Glycerin.</li>
	<li>Der Nuklease-freie PFV IN Sample von Dialyse Schläuche zu erholen. Messen Sie die A280 und berechnen Sie die endgültigen Proteinkonzentration. Aliquoten und Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems.">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li><li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases.">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration.">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li><li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+reaction+pathway+and+critical+intermediates.">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li><li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells.">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li><li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase.">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li><li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration.">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.
Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV Zoll reinigt PFV IN zeigt jedoch eine Affinität für Heparin-Sepharose, die leicht von der bakteriellen Nuklease Verunreinigung1zu unterscheiden ist. Der Schlüssel zur Vorbereitung der Nuklease-freie PFV IN ist die sorgfältige Quantifizierung der Nuklease Aktivität in jedem Bruchteil nach Gradienten Elution von Heparin Sepharose. Das Gefälle muss ausreichend flach, um die Trennung von PFV IN von der Nuklease Schadstoff zu ermöglichen; eine steile Steigung wäre nicht kompatibel mit effizienten Trennung. Darüber hinaus muss das Plasmid DNA Substrat einen niedrigen Anteil an entspannt Kreise um den Hintergrund des Nuklease Assays zu reduzieren. Wenn das Plasmid DNA Substrat einen hohen Hintergrund entspannt Kreise hat, sollte eine neue Reinigung von Plasmid DNA durchgeführt werden. Der Nuklease-Aktivität-Test zeigt die Anwesenheit von kontaminierenden Nuklease und Brüche, die verworfen werden sollte.
In einigen Fällen möglicherweise Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) eine wirksame Methode zur Entfernung von kontaminierenden Nuklease2. Vorherigen Gruppen nutzten während der Reinigung des PFV IN4SEC. SEC hat eine begrenzte Ladevolumen und neigt dazu, die endgültige Proteinkonzentration zu reduzieren. Der große Vorteil, Affinität und Ionenaustausch-Chromatographie ist die Fähigkeit, ein wesentlich größeres Volumen als Sek. Laden
Tests für Nuklease Aktivität kann an verschiedenen Proteinen angepasst werden, die mit einer bakteriellen Nuklease Co reinigen. Hier erkennen wir IN PFV und kontaminierenden Nuklease durch Heparin Sepharose Chromatographie getrennt werden. Wir haben bereits gezeigt, dass PFV IN einem ähnlichen Profil zu Nuklease mit Mono-S-kation und Mono-Q Anion-Austausch-Chromatographie machen diese Harze ungeeignet für dieses Protein hat. Je nach Affinität Eigenschaften des gewünschten Proteins in Bezug auf die Nuklease kann dieses Protokoll mit Affinität oder Ionenaustausch Harze und Gradienten Elution verwendet werden. Der Schlüssel zur effektiven Entfernung von Nuklease Kontamination aus einem Protein des Interesses ist ein Unterschied in der Affinität für ein Harz. Jede Fraktion muss für Nuklease Aktivität untersucht werden. Die Chromatographie-Harze dieses Protokolls können nicht direkt auf alle Proteine angewendet werden, die mit bakteriellen Nukleasen Co reinigen. Jedoch kann das Gesamtkonzept der Verwendung eine Affinität oder Ionenaustauschharz schieden die Nuklease aus einem Protein von Interesse und testen Brüche für Nuklease Aktivität breit anwendbar sein.

Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)1 isoliert , 2 , 3.
Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA, geklaut oder lineare Produkte als Maß für die Aktivität4. Im zellulären Infektion tritt IN die beiden Enden der viralen DNA an die Host-Chromatin-5. Jedem Ende Beitritt Reaktion wird als Strang Transfer bezeichnet. Assays von rekombinanten IN Aktivität kann beitreten zwei DNA-Oligomere imitiert die virale cDNA zu einem Ziel DNA in einem abgestimmten Integration Reaktion4,5,6,7,8endet. Alternativ kann rekombinante IN nur einem DNA-Ende nicht physiologisch relevanten halbe Seite Integration Reaktion9,10teilnehmen. Wenn supercoiled Plasmid-DNA das Ziel der ist Integration, abgestimmte Integration sind Produkte linearisiert DNA und eine halbe Seite Integrationsprodukte sind entspannt Kreise. Diese Reaktionsprodukte sind durch ihre relative Mobilität während Agarose-Gel-Elektrophorese1identifiziert. Wenn die rekombinante IN einen kontaminierenden Nuklease verfügt, werden falsche entspannt Kreise oder eine möglicherweise linearisierten Plasmid verwirrend die experimentellen Ergebnisse. Virale DNA-Oligomere können Eindringmittel markiert werden, um schlüssig Integrationsprodukte, im Gegensatz zu Nuklease Produkten identifizieren. Jedoch bevorzugt stark supercoiled DNA Ziele; der Verlust von supercoiled Plasmid entspannt Kreise oder lineare DNA von kontaminierenden Nuklease Labelling Ergebnisse und Interpretation von Daten11. So ist es zwingend notwendig, um bakterielle Nukleasen von Retroviren IN Vorbereitungen zu entfernen.
PFV IN hat eine unterschiedliche Affinität zu Heparin-Sepharose im Vergleich zu den bakteriellen Nuklease-1. PFV IN und der Nuklease können durch einen linearen Farbverlauf Elution von Heparin Sepharose abgetrennt werden. Die Nuklease ist nicht ohne weiteres durch eine ultraviolette (UV)-Extinktion auf 280 nm Höhepunkt oder analytische Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erkannt. Stattdessen wird der Nuklease durch eine Nuklease Aktivität Assay beschäftigt die Umwandlung von supercoiled Plasmid zu entspannt Kreise oder lineare Produkte erkannt. Jede Fraktion nach Heparin-Sepharose-Chromatographie wird für Nuklease Aktivität getestet. PFV IN und der Nuklease Verunreinigung haben keinen Unterschied in der Affinität für Mono-Q Anion Harz. Es gibt einen kleinen Unterschied in Affinität für Mono-S kation Harz. Jedoch würde die Mono-S-Auflösung der bakteriellen Nuklease und PFV IN effiziente Trennung der Proteine nicht zulassen. Letztlich bietet die beste Trennung von bakteriellen Nuklease aus PFV IN Heparin Sepharose Affinitätsreinigung und hat den Vorteil der unbegrenzten Ladevolumen.
Tests für kontaminierende Nuklease Aktivität kann an andere Proteine angepasst werden. Das Protein des Interesses haben wahrscheinlich alternative Affinität Eigenschaften als PFV IN; der Unterschied in der bindenden Eigenschaften des Proteins des Interesses und der Nuklease Verunreinigung muss empirisch ermittelt werden. Diese Methodik zur Ermittlung der Nuklease Kontamination kann an anderen Harzen einschließlich Mono-S kation oder Anion Austausch Harze Mono-Q angepasst werden. Affinität und Ionenaustausch Harze können eine zuverlässige Methode um eine rekombinante Protein des Interesses von kontaminierenden Nukleasen ohne Grenzen auf dem Datenträger des Proteins während der Chromatographie isolieren anbieten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BL21/DE3 Rosetta E. coli</td>
			<td style="width:180px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70956-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB broth</td>
			<td style="width:180px;">EMD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CI8280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure</td>
			<td style="width:180px;">Gojira Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSF&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT&#160;</td>
			<td style="width:180px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure EDTA</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CA3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA Superflow</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0998-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRV14 3C protease&#160;</td>
			<td style="width:180px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">71493-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.

Rekombinante PFV IN ist oft mit einer bakteriellen Nuklease1kontaminiert. Biochemische Integration Tests hängen die Quantifizierung der Umwandlung von supercoiled Plasmid DNA zu entspannten Kreisen und lineare Produkte. Das Vorhandensein von kontaminierenden Nuklease könnten falsche Quantifizierung dieser Assays. Ausdruck von PFV IN mit einem Hexahistidine Tag in E. Coli (Abbildung 1) induziert und zuerst gereinigt durch Nickel-Affinitätschromatographie (Abbildung 2). Die Fraktionen mit fast reinem PFV IN kombiniert und das Hexahistidine-Tag ist durch eine Protease gespalten. Wir haben festgestellt, dass PFV IN und die kontaminierenden Nuklease unterschiedliche Affinitäten für Heparin Sepharose Chromatographie (Abbildung 3)1. PFV IN Sekundenbruchteilen nach Heparin Sepharose Chromatographie sind mit ein supercoiled Plasmid, für entspannte Kreise assay und linearisierten Plasmid, die Produkte der Nuklease Aktivität (Abbildung 4) inkubiert. Dieser Test ermöglicht die Identifikation von Proteinfraktionen ohne Nuklease (Abbildung 5). Diese Brüche können kombiniert, dialysiert und für zukünftige Experimente eingefroren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> Abbildung 1: Induktion von PFV IN E. coli . Zellen aus Kulturen vor (Bahn 2) und nach (Bahn 3) Induktion werden auf das Vorhandensein von PFV IN, 47374 da Proben analysiert wurden getrennt, um 10 % SDS-PAGE und mit Coomassie brilliant blau gefärbt. Bahn 1, Molekulargewicht Marker (kDa). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> Abbildung 2: Nickel-Affinität Chromatographie Brüche. Lösliche bakterielle Lysates wurden durch Nickel Affinitätschromatographie getrennt. PFV IN mit einem Hexahistidine Tag wurde mit einem linearen Farbverlauf von 20 mM bis 200 mM Imidazol eluiert. Fraktionen wurden um 10 % SDS-PAGE und mit Coomassie brilliant blau gefärbt. PFV IN, 47374 Da ist deutlich erkennbar in der Probe in der Spalte (Last) geladen, aber ist weniger offensichtlich in der Durchströmung oder waschen. Brüche, die häufig schon früh im Verlauf Imidazol eluieren anzeigen eine langsamere Mobilität Verunreinigung in der Nähe von 75 kDa sowie einige schnelleren Mobilität Verunreinigungen an oder unter 25 kDa. Bei höheren Konzentrationen von Imidazol gibt es nicht ohne weiteres ersichtlich Verunreinigungen und PFV IN scheint relativ reines sein. In diesem Beispiel wurden Brüche #33 bis #84 kombiniert und weiter gereinigt. Molekulargewicht Marker (kDa) sind auf der linken Seite jedes Gel. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> Abbildung 3 : Heparin-Sepharose-Chromatographie von PFV IN 1 . Nach Nickel Affinität und Protease entfernen der Hexahistidine Tag war PFV IN (44394 Da) durch Heparin Sepharose fraktioniert. Proteine wurden mit einem linearen Farbverlauf von 200 mM auf 1 M NaCl eluiert. Auch Brüche #12 und #44 wurden von 8 % bewertet, die SDS-PAGE mit Coomassie Blau gefärbt. Molekulargewicht Marker (kDa) sind auf der linken Seite jedes Gel. Diese Fraktionen wurden für Nuklease Aktivität getestet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> Abbildung 4: Nuklease Assay der Heparin-Sepharose-Fraktionen 1 . Jede Heparin-Sepharose-Fraktion wurde supercoiled Plasmid DNA hinzugefügt. Bruchteil Zahlen beziehen sich auf die in Abbildung 3dargestellt. Nach Inkubation der Nuklease Reaktionen waren Deproteinated und getrennt durch 1 % Agarose mit Interkalation Bromid. Negativkontrollen gehören Plasmid-DNA mit kein Protein (nur Ziel) und eine vorherige Reinigung des Wildtyp PFV IN bekannt von Nuklease (PFV IN WT) zu befreien. Positivkontrolle für kontaminierende Nuklease Aktivität ist eine vorherige Reinigung von katalytisch inaktive PFV, die bekanntermaßen kontaminierenden Nuklease (PFV IN D128N). DNA-Markern Größe werden in kb angezeigt. Supercoiled Plasmid (SC), linear Plasmid (L) und entspannt Kreise (RC) sind angegeben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> Abbildung 5 : Quantifizierung der Nuklease Assays 1. Agarose Gele wurden gescannt und Pixelwerte für supercoiled (SC), lineare (L) und entspannten Kreis (RC) Bands in jeder Bahn quantifiziert wurden. Bruchteil Zahlen beziehen sich auf diejenigen in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Die Prozentsätze linear und entspannt Kreise wurden mit der Pixelwerte und der Gleichung berechnet. Zum Beispiel das Pixel Werte für Bruchteil #12-Bänder sind: 817636 supercoiled Plasmid, 50467 linear Plasmid und 112052 entspannt Kreisen. Der gesamte DNA Pixelwert für Bruchteil #12 ist die Summe dieser Werte, 980155. Der Prozentsatz der linearen DNA ist 50467 100 für den Prozentsatz multipliziert und dividiert durch die DNA-Gesamtwert entspricht 5,1 %. Der Anteil der entspannten Kreisen ist 112052 mit 100 multipliziert und dividiert durch die DNA-Gesamtwert entspricht 11,4 %. Die Summe der Prozentsätze linear und entspannten Kreis beträgt 16,5 %. Negativkontrolle Plasmid DNA mit kein Protein (keine IN, untere Grafik) zeigt, dass dieses Präparat von Plasmid 4,4 % der Gesamt-DNA als lineare oder entspannt Kreise enthalten. Eine zweite negative Kontrolle wurde eine vorherige Reinigung des Wildtyp PFV IN (WT), die 8,6 % der Gesamt-DNA als lineare oder entspannt Kreise angezeigt. Diese beiden Fahrspuren geben Sie den Hintergrund von geklaut oder linearisierten Plasmid mit dem Substrat allein und mit PFV Zoll vorhanden Positivkontrolle ist eine vorherige Reinigung von katalytisch inaktive PFV IN (D128N), die 23 % der Gesamt-DNA als linear und entspannt Kreise hatten. Die DNA ausgesetzt Heparin Sepharose Brüche #12 durch #22 führte > 10 % der DNA als linear und entspannt Kreise. In diesem Beispiel Brüche #24 bis #42 angezeigt < 10 % Umwandlung in linearen und entspannt Kreise. Diese Fraktionen wurden kombiniert und dialysiert. Aliquote wurden eingefroren und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.0K Aufrufe.  The Ohio State University College of Medicine. Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Serie: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...