Atp seviyesi ve oksijen tüketim oranları gibi alanın bir fonksiyonu nda da sahip olduğunuz önemli bir soruya cevap veren bir karmaşadır. Yeni ya da bir sayfa eski, bu teknik gerçekleştirmek kolay ve hücresel mitokondriyal fonksiyonun özel bir değerlendirme için çok şey var. Bu deneyi başlatmak için, tohum 20, 000 HepG2 hücreleri bir cam alt Petri çanak.
24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de kuvözde beta-hekzachlorcyclohexane veya B-HCH ekleyin. DMEM hücre kültürü ortamına susuz DMSO ekleyerek bir milimolar mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisi hazırlayın. Sonra cam alt Petri kapları hücrelere bu çözeltinin çanak başına bir mililitre ekleyin.
Ve 45 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, hücrelerden mitokondriyal yeşil floresan prob çözeltisini çıkarın. Taze hazırlanan çanak başına bir mililitre ekleyin 37 santigrat derece DMEM hücre kültürü orta.
Mitokondriyeşil floresan tespit etmek için, bir konfokal mikroskop altında hücreleri gözlemlemek. Hücresel ATP düzeylerini değerlendirmek için, tohum 20, 000 HepG2 hücreleri altı kuyu plakaları. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede beta-HCH ve kuluçka ekleyin.
Her kuyudaki hücrelere 200 mikrolitre lysis tamponu ekleyin. Santrifüj 12, 000 kez G dört derece santigrat beş dakika için, ve metin protokolü açıklandığı gibi supernatant toplama ile devam edin. Plakaya 100 mikrolitre ATP algılama tamponu ekleyin.
Oda sıcaklığında 96 kuyu plakasına toplanan hücre süpernatant 100 mikrolitre ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi bir luminometre ile hücresel ATP tespit etmeye devam etti. Mitokondriyal membran potansiyelinin değerlendirilmesi için, daha önce açıklandığı gibi, beta-HCH ilavesi ile altı kuyu plakaları HepG2 hücreleri büyümek. Hücreleri 0,5 mililitre 0,25% EDTA ile 37 santigrat derecede bir dakika sindirerek toplayın.
Sindirimi durdurmak ve sindirilmiş hücreleri 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için bir mililitre DMEM ekleyin. Tüpleri 1000 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve sonra süpernatant'ı atın. Hücre kültürü orta 0.5 mililitre ve 0.5 mililitre JC1 mitokondriyal membran potansiyel boya ile hücre pelet seyreltmek.
Ve 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, tüpleri 600 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin ve hücre peletini metin protokolüne göre yıkayın. Yıkanmış pelet santrifüj sonra, supernatant çıkarın.
Ve 0,5 mililitre JC1 boyama tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Yeşil ve kırmızı floresan tespit etmek için akış sitometri yoluyla JC1 lekeli hücreleri analiz. JC1 monomer algılandığında, uyarma ışığını 490 nanometreye, emisyon ışığını ise 530 nanometreye ayarlayın.
JC1 polimeri algılandığında, uyarma ışığını 525 nanometreye, emisyon ışığını ise 590 nanometreye ayarlayın. Oksijen tüketim oranını analiz etmek için, tohum HepG2 hücreleri bir 96 iyi hücre kültür plakası bir yoğunlukta 4, 500 hücre başına 100 mikrolitre başına. 37 santigrat derece kuluçka 24 saat sonra, her kuyuda hücrelerin orta ile kaplı olduğundan emin olun.
OCR yazılımını çalıştırmadan önce, mikro plakayı kartuşla ve hücre kültürü plakasını metin protokolünde açıklandığı gibi hücre dışı akı analizörüne yükleyin. OCR yazılımını açın ve uygulamalar menüsünü bırakın, hücre mito stres test kitini seçin ve başlat uygulaması düğmesine tıklayın. Ardından, çalıştır stres testi düğmesine tıklayın.
Hücre strestest ekranı göründüğünde, hücre tohumlama sayısı kutusuna iyi başına tohumlama hücre sayısını ve bazal hücre oCR kutusunda ortalama OCR ortalama oCR girin. Her reaktif için son çalışma konsantrasyonu girin ve sonra reaktifler enjekte. Sonraki düğmeye tıklayın.
Grup bilgi ekranı göründüğünde, bir renk seçerek ve bir ad vererek atanmamış kuyulara bir grup atayın. Sonra uygun kuyular tıklayın. Sonraki düğmeyi tıklatın ve görünen stres testi enjeksiyon düzeni ekranında, çözümleyici üzerinde stres testi çalıştırmak için başlat'a tıklayın.
Tamamlanan çalışmadan sonra, yazılımdaki istemleri izleyin ve ardından kartuş ve hücre plakasını çıkarıp atın. Beta-HCH'ye maruz kalan HepG2 hücrelerinde mitokondriyal yeşil floresan boyamanın ortalama yoğunluğu azalmıştır. Bu, mitokondriyal sayıda azalma ve pestisit konsantrasyonundaki artışla tutarlı hasarlı mitokondride artış olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, HepG2 hücrelerindeki ATP düzeyleri beta-HCH maruziyetinin artmasıyla azalmış ve bu hücrelerde mitokondrinin azalmış işlevini göstermektedir. Mitokondriyal membran potansiyeli için JC1 boyama sonra, veya MMP, akış sitometresi bozulmamış HepG2 hücrelerinde yüksek kırmızı yeşil JC1 floresan gösterdi. Bu yüksek MMP bir işareti olan kırmızı floresan JC1 agregalar, varlığı nedeniyle oldu.
Beta-HCH ile tedavi edilen hücrelerde, kırmızı yeşil JC1 floresan yeşil floresan JC1 monomerler varlığı nedeniyle azaldı, düşük MMP bir işareti. Son olarak, oksijen tüketim oranı da beta-HCH maruz kalma artan konsantrasyonları ile azaldı, daha fazla bu pestisit uygun mitokondriyal fonksiyon bozduğunu gösteren. Bu prosedürü denemeye çalış, bu hücreleri test etmek için uygun olarak görmeyi unutmamak çok önemli.
Gelişiminden sonra, bu kesinlikle onunla ilişkili tıbbi rolü ilgili organizmalar keşfetmek için temel fonksiyon alanında araştırmalar için bir yol açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, bir miktar veya kalite, kapasite, şimdi üye veya potansiyel spoutage levha fonksiyonu altında tespit etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
