ジャン = バティスト ・ Sibarita とダニエル ・ ショケ (会社の IIN、CNRS/ボルドー大学) の単一分子解析とフレンドリーな対応感謝します我々 は特に、ニック Valmas を感謝し、ジェシカ Mcgaw (下さい QBI、クイーンズランド大学) ビデオの録画、ナレーションと同様、グラフィック デザインを図します。この仕事に支えられたオーストラリアの研究評議会 (AR) 発見プロジェクト (F.A.M. DP170100125)、オーストラリアの研究評議会 (F.A.M にリーフ グラント LE0882864)、未来の交わり (B.V.S.、FT100100725)、オーストラリア研究会議 (リーフ グラントF.A.M に LE130100078。)・ NHMRC プロジェクト (B.V.S.、APP1103923) を付与します。F.A.M NHMRC 主任研究員 (ONT1060075) であります。

1. mEos2 付けられた蛋白質を表現する遺伝子組換えショウジョウバエのデザイン
<ol><li>MEos2 タンパク質とタグに蛋白質を選択します。画像処理の成功率を上げるには、膜貫通ドメインを持つタンパク質で選択神経膜14 (例えば、変異シンタキシン 1 a)、シナプス小胞またはオートファゴソーム26,27 (例えば、蛋白質Synaptobrevin-2)、または神経の膜蛋白質 (例えばMunc18 1) と密接な相互作用と細胞質蛋白質。</li>
	<li>MEos2 タグ付きタンパク質 (図 1) をエンコードする遺伝子を構築します。蛋白質および mEos2 のための前方および逆のプライマーを設計します。 注: mEos2 コーディング シーケンスは興味の蛋白質の C 末端に融合するように設計された pmEos2 N1 プラスミッドから増幅することができます。クローニングなど、酵母pFL44S を使用して体内組換えによって行うことが-attB-MCS-w +14,28のベクトル、ギブソンなど他のクローンの作成方法を使用できる代わりにアセンブリ プロトコル29。<ol>
<li>病原と XbaI ベクトルを線形化し、共同ura3 mEos2 および興味の蛋白質を符号化する PCR のフラグメントと酵母細胞に変換します。トランスジェニック フライ ライン30を生成する構築とショウジョウバエの胚を注入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リアの標準酵母、糖蜜培地またはプラスチック バイアルに含まれているいくつか他の適切な代替のトランスジェニック フライ文化。確実に健康的なかなり大規模なシナプス研究31をバイアル、過密のハエや毎日産卵; の後新しい瓶にハエを反転これにより第 3 齢幼虫も供給し、彼らは媒体の徘徊開始時間によって適切なサイズに達する。室温 (25 ° C) でトランスジェニック フライを上げます。 注: 大きなシナプス ボタン イメージの中に可視化蛋白質の大きい量を生成する傾向があります。</li>
</ol>2. 第 3 齢幼虫の郭清
<ol><li>円柱状または凹形ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基本引時間: 20 mm 径と引時間: 20 mm の高さの適切なシリコーン エラストマー キット (図 2 a) を使用して。硬化剤 10:1 の比率でシリコーンとシリコーン ・ エラストマーをミックスします。<ol>
<li>5 分、dimsensions と金型に混合物が上記を注ぐのため徹底的に混合物をかき混ぜなさい。45 分間 100 ° C のオーブンで強化しましょう。PDMS のベースは、郭清を行う基盤として機能します。ガラス底培養皿のよく収まる PDMS ベースを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイアル壁から放浪の 3 令幼虫を選択します。4.5 倍率光学ステレオ顕微鏡を使用して、幼虫を背側と PDMS 円筒底面配置を視覚化します。</li>
	<li>使用する曲線し、口フック、前気門を拡張する 2 つの頭と 2 つの後部気門の間、肛門の上尾 minutien ピンを固執するピンセットします。固定化の幼虫に室温でシュナイダーの昆虫媒体の 40 μ L を追加します。 注: (HL3 または HL6) Hemolyph のようなソリューションは、シュナイダーのソリューション32,33の代わりにも使用可能性があります。</li>
	<li>壁の正中に切開に minutien ピンの使用によって幼虫の腹部体壁の背側でアクセスを提供します。</li>
	<li>体壁を切るに使用春はさみを切開ポイントから開きます。前後方向34で正中線に沿ってカットします。</li>
	<li>微細鉗子を使用し、春の幼虫を独特にはさみ: 唾液腺、気管や腸など内臓を削除します。シュナイダーの昆虫の中で 2 回幼虫を洗います。</li>
	<li>微細鉗子で 2 体壁フラップを保持、穏やか、それらをストレッチして、それぞれの側に 2 つの minutien ピンをスティックします。これは六角形の準備 (図 2 a) を生成する必要があります。</li>
	<li>イメージ投射; 中に筋肉の動きの可能性を減少する春のはさみを使用して腹側神経索から脳をデタッチします。これはまた平らなイメージングの料理準備を保持するために提供しています。PDMS ベースにすべての六つの minutien ピンをプッシュするのに、ピンセットを使用します。 注: 腹壁内のピンの小さな部分だけを埋め込む必要があります。</li>
	<li>幼虫が、術を生存していることを確認は、やや腹側神経索を突く、これは幼虫の腹部壁の蠕動収縮を引き出す必要があります。</li>
</ol>3. やや斜め照明単一粒子追跡顕微鏡
<ol><li>ガラス底培養皿に切り裂かれた幼虫 PDMS ベースを反転します。室温シュナイダー昆虫媒体 (図 2 b) の 2 mL でイメージングの皿を満たし。</li>
	<li>腹筋 6 と 735 63 x を使用してシナプスの 2 番目と 3 番目のセグメントの運動ニューロンを検索/1.2 蛍光の全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡の NA 水浸対物レンズです。</li>
	<li>顕微鏡の接眼レンズを使用して切り裂かれた幼虫; を検索明視野照明の使用によって筋 6 を識別します。</li>
	<li>顕微鏡取得ソフトウェアを使用 (材料の表を参照)、全反射構成で浸透深さを増加する、それ以外の場合全反射臨界角から斜めの照明を達成するために移動を 1 ° コリメータ カメラ アングルまでスライドさせます。</li>
	<li>緑の mEos2 を視覚化する 488 nm レーザーをオンに。低いレーザー力を使用 (22.8 の 5% 未満 mW) 緑の蛍光性を漂白を避けるために。(これは文字列のビーズのように見える) 神経筋接合部を検索し、全反射する、低解像度の画像を取得します。</li>
	<li>同時に 405 nm レーザーのスイッチ (緑から赤の種の photoconverts の mEos2) 561 nm のレーザー (画像 photoconverted 赤 mEos2) 確率的単一 mEos2 蛍光蛋白質を集中させる。 注: 405 nm レーザの低消費電力の使用は推奨 (4.78 の 0.9% に 0.005 mW) 映画集録時に比較的一定光電率のことができます。50 と 75 %561 nm レーザーの間 (20.1 mW)、これは周囲の神経筋接合部、筋肉組織の形態に悪影響せず赤 mEos2 種からの蛍光性を取得するための十分な。</li>
	<li>各神経筋接合部チェーン シリーズ以上で構成される 15,000 フレーム 33 Hz」下車 as.czi 形式保存可能な参照の付属メタ データを保存するために時間を取得します。</li>
	<li>'.Czi' 映画ファイルを「.tiff」ファイルに変換するのに ImageJ を使用します。</li>
	<li>フィジー/ImageJ37トラッキング解析ソフトウェア11,14,36 TrackMate など適切な分子を取得した映画を分析 (材料の表を参照してください)。'X' と 'y' を検索各ローカライズ強度ポイントのガウスのフィットでの座標分布関数 (PSF)。 注:トラブルシューティング: 緑色蛍光を観測されていないか、または 488 nm レーザーへの露出に神経筋接合部が暗すぎる場合は簡単に、photoconverting とレーザー イメージングをオン (405 nm と 561 nm) これは赤いのより多くを作り出すを助けるように、mEos2 の種。488 nm レーザーに切り替えてし、TIRF 画像を取る。</li>
</ol>4. 単一分子局在固定幼虫
<ol><li>パームを介してタンパク質ナノクラ スターのサイズを測定、定着剤 - リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈した 4% パラホルムアルデヒドで郭清後シュナイダーの昆虫媒体を交換してください。</li>
	<li>室温で 30 分間幼虫を孵化させなさい。</li>
	<li>削除解剖ピンし、固定の幼虫が、1.7 mL クリア スナップ ロック遠心チューブです。</li>
	<li>解剖し、修正は他の多くの幼虫、必要に応じて、それら 3 回 PBS で洗浄します。</li>
	<li>PBS をブロック バッファー (PBS、0.1% トリトン X-100 および 3% のヤギ血清のソリューション) に置き換えます。</li>
	<li>3 回は、PBS で幼虫を洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な一次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>4 oc. で一晩インキュベートします。</li>
	<li>PBS に幼虫を 3 回洗浄し、(ブロック緩衝液で希釈した) 必要な二次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>PBS に幼虫を 3 回洗いは、PDMS ベース、およびイメージの単一分子追跡のため前述のように幼虫を取り付けます。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、ショウジョウバエの 3 令幼虫の神経筋接合部で mEos2 タグ付きタンパク質の単一分子追跡について説明します。遺伝子組換え蛋白質の過剰発現を避けるためには、変異シンタキシン 1 a mEos2 式は内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターによって駆動されました。シナプス蛋白質の移動性に関する研究はほとんど体外培養細胞と大脳皮質ニューロン9,11,12,13の調査に限られています。これらの蛋白質が生きている動物のようなモビリティ署名を展示かどうかは、あまり知られていません。単一蛋白質の移動性生体内可視化するには、光学的透明性、アクセシビリティ、および浸透深さなど制限が克服しなければならないあります。幼虫の準備を解剖と神経筋接合部、筋肉の表面に埋め込まれたを可視化、光透過性とアクセシビリティの問題を避けてください。通常の全反射設定イメージ分子移動しようは失敗を証明しました。ただし、貫通深さ増加励起レーザーのやや斜めの照明の使用ができます。さらに、幼虫を固定するために使用 minutien ピンは蛋白質の移動性に麻酔使用の可能な影響を避けるために貢献。高い倍率の目的、油浸漬目標 × 100 などを使用して、単一分子の生体内を視覚化することが可能です。ただし、拡大率が焦点の外のドリフトの発生を高める可能性があります。さらに、我々 は低強度 (30%) を使用しています。561 nm レーザー画像単一分子運動神経終末に正常に。追加のテストより低いレーザー力を使用する必要があります。
このプロトコルは、神経細胞の細胞膜の近さ内のシナプス蛋白質の移動性を視覚化に適しています。このアプローチを使用する - 変異シンタキシン 1 a とタンパク質 Atg18a をバインドされたオートファゴソーム - スネア蛋白質の移動性は正常にイメージで vivo14,26をされています。運動ニューロン軸索することができます蛋白質の移動性は、27を検討しました。しかし、脳の腹側神経索蛋白質の移動性の調査により、基になる組織作り出された高いバック グラウンド信号を評価することは困難証明するかもしれないさらに、蛍光 (replicability ように) 脳構造のタグ付けが必要になります同じ脳構造の蛋白質の移動性の可視化とデュアル カメラ画像の使用が必要になります。
ショウジョウバエの超解像顕微鏡に使用できる現在の方法より開発第 3 齢幼虫38,39ではなくほとんどイメージング胚に限定。これらのプロトコルの主な問題は彼らがイメージ領域における軌道の数が少ないをもたらす、したがって移動状態22,40の詳細な分析を防ぐ。私たち生体内単一分子追跡プロトコルは軌道の数が多いを生成する能力を持っているし、 Caenorhabiditis 線虫ゼブラフィッシュなど他の動物モデルのため、可能性があります。確かに、すべて NMJ チェーンは、さまざまなモバイル状態やこれらの状態14,27間の遷移分析に適して 〜 2,400 軌道を生成しました。さらに、多く生体内単一分子イメージング戦略は、イメージングの実行される生理学的な機能を変更するか、動物20,22を動けなく麻酔薬の使用に依存します。ここで我々 は minutien のピンを使用して幼虫を固定する '麻酔無料' プロトコルを最適化されています。
このプロトコルの潜在的な使用は、3 つの次元で蛋白質の移動性を可視化するかもしれません。超解像顕微鏡の最近の進歩により蛋白質の移動性を可視化する生体外で'x' で 'y' と 'z' 寸法41,42。私たちの現在のメソッドは、'z' 軸の蛋白質の移動性については考慮しません。まだショウジョウバエモーター神経ターミナルは球状構造を三次元ボリューム43蛋白質の移動性を定量化する貴重な将来のアプローチになります。Z 次元のイメージングは、乱視のレンズを使用して実現可能です。また、全反射モード44,45, z 座標精度が増加もします。しかし、実験では、乱視のレンズなし syntaxin1A mEos2 の分子を可視化するのにやや斜めの照明を使用している私たち。
結論としては、両方を遺伝子組換えショウジョウバエはえ在庫の蛋白質を表現するが付いた蛍光タンパク質ベース PDMS の変更の可能性を搭載した全反射蛍光顕微鏡と同様、遺伝子組換えの幼虫を解剖する、照明の角度は、このプロトコルで説明されているように単一蛋白質を可視化するために必要な最も重要なツールです。

神経細胞のコミュニケーションは、伝達物質の放出、細胞膜1神経伝達物質を含むシナプス小胞の規制の融合による発生するに依存します。エキソサイトーシス2,3,4,5,6と呼ばれるこのプロセスは、非常にダイナミックな刺激7のレートの変動に従ってアップまたはダウンの調整をすることができます。これらのプロセスに関わるたんぱく質ブラウン運動、及びしたがってバインドこれらの生理機能を支える行動の範囲を維持できるナノ組織が表示されます。膜蛋白質は非常にダイナミックな細胞膜7,8,9,10、11、ナノクラ スターに分子の外側トラップを許可します。 12。など、アクション8の彼らのモードを明らかにすることができますこれらの蛋白質の移動性を調査します。可溶性 N-エチルマレイミド敏感な要因添付ファイル蛋白質の受容器 (スネア)、たとえば変異シンタキシン 1 a などのシナプス蛋白質が分子として役立つかもしれないナノクラ スター内のトラップを横し同様、横の高速移動を展示に現在知られています。デポと小胞融合9,13,14,15のためのサイト。
蛍光蛍光タンパク質、単量体 (m) Eos16,17楓18, などの最近の開発を許可しているアプローチを使用して神経細胞膜タンパク質のナノ分解能など光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率論的光再建顕微鏡 (嵐)14,15,19。これらの開発は、モビリティと培養細胞とニューロンの生物の蛋白質の nanoclustering 調査を有効にしています。最近では、研究を行ったこのようなハツカネズミ、線虫とダイナミクスとそのまま生物の神経細胞にこれらの膜タンパク質の組織 (と同様の高解像度) で明らかにするショウジョウバエ14,20,21,22。
しかこのような障害を克服するために能力も (やし、嵐、および蛍光 fluorophores) など最近開発された超解像イメージング ツールの使用だけでなく、蛋白質の生体内組織の動態・必要です。タンパク質とイメージングのレーザーの浸透深さのアクセシビリティとしてそのまま動物細胞内タンパク質のイメージングは、そのままマウスの海馬など、そのままの動物の生体組織内に深く埋め込まれた構造のタンパク質が、画像として本質的に困難です。それ故に、蛋白質または組織の表面近くにはイメージより簡単に。生体内イメージングと別の難しさは、動物間での再現性を確保するためにです。もう 1 つのサンプルから解剖学が異なることがありますとそのまま動物の異なるサンプルで複製の容易さと構造を選択するも挑戦を証明します。シナプスのようにステレオタイプの構造の使用、これらの問題のいくつかを克服するを助けます。
一方、他の調査は、たとえば組織・臓器の表面にタンパク質の組織をイメージして、最近の研究は動物線虫22など光学的に透明な表皮で蛋白質の移動性をイメージしてライブ マウス21の頭蓋骨を介して大脳皮質ニューロンにおけるアクチン画像。不動; 動物を維持するいくつかのケースで麻酔薬を使用されています。ただし、特定の麻酔薬が興味の蛋白質に悪影響を与える可能性があります。生体内でイメージ投射の間不動の動物を維持する代替手段は、エラーを最小限に抑えるため検討必要があります。
超解像イメージング体内に別の注意点は興味の蛋白質を照らすに使用されるレーザーが周囲の組織に悪影響を与える可能性したがって励起強度を可能な限り低く保つことをお勧めします。レーザーで周囲の組織の照明はまた背景信号を増加させる傾向があります。低励起強度の使用背景を減らすことができます、それをされていることに注意が蛍光タンパク質光子収率の減少につながる可能性も。イメージ分析の前にバック グラウンド信号を削減する代わりの手段として、分析中に背景差分をされる可能性があります。
ショウジョウバエは、生体内イメージング機能の特定の蛋白質の調査を提供する確立された遺伝的ツールとしての理想的な生物を提示します。上流活性化シーケンス (UAS)-Gal4 システムでタンパク質発現の時空と神経伝達23を操作するため、ことができますようなショウジョウバエ過渡熱遺伝的刺激受容体の潜在的な家族 A1 (dTRPA1)24または遠赤色シフト CsChrimson25を使用して光遺伝的刺激は14のイメージングと併用できます。我々 はこのシステムで生体内単一分子イメージングを実行する複雑さの多くを克服しているし、今ショウジョウバエ第 3 齢幼虫単一粒子追跡することができます実行する方法を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td colspan="2" style="width:253px;">000000000001064291</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass-bottomed Culture Dish</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D29-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optical Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Curved Tweezers (Style 5/45)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0208-5AC-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Minutien Pins (0.1mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma, Life Sciences</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ELYRA PS.1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>PS.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zen Black acquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss, 2012</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:163px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:87px;">7.7.8</td>
			<td>PALM Tracer Plugin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fly strain</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">w1118; HA-Sx1A-mEos2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

超解像顕微鏡技術の増加する数は、ナノスケールの携帯電話の世界を支配するメカニズムを明らかに貢献しています。単一分子イメージングは、生きている細胞の個々 の分子の可視化への例外的なアクセスを提供するので、勢いを増しています。ここでは、我々 はショウジョウバエ幼虫における単一粒子追跡写真活性局在顕微鏡 (sptPALM) を実行する開発手法について述べる。シナプスを通じてコミュニケーションはシナプス前の主要なタンパク質ドッキング、プライミング、および神経伝達物質含有の融合を推進して、活動するに依存している細胞膜と小胞。タンパク質間およびタンパク質-脂質相互作用の範囲は、しっかりとこれらのプロセスを調節してシナプス蛋白質は、したがって各キー イベントに関連付けられている移動性の変化を展示します。どのこれらの蛋白質の移動性がそのまま生きている動物の生理機能と関連の調査は、その正確な作用機序を理解することに不可欠です。高解像度生体内で蛋白質の移動性を抽出には、光透過性、アクセシビリティ、および浸透深さなどの制限事項を克服する必要があります。蛍光蛍光タンパク質変異シンタキシン 1 a を若干斜光を介して可視化およびモーター神経ターミナルまたは第三の運動ニューロン軸索に沿って追跡できるシナプス前のタンパク質にタグがショウジョウバエに齢期について述べる幼虫。

上記、変異シンタキシン 1 a mEos2 トランスジェニックキイロショウジョウバエされたプロトコルを使用すると、(図 1) が生成されます。遺伝子組換え第三令ショウジョウバエ幼虫は PDMS 円筒ベース (図 2 a-f) の解剖されました。変異シンタキシン 1 a の単一の分子を可視化、やや斜めレーザー照明14全反射顕微鏡にパームを使用しました。
変異シンタキシン 1 a の分子は、2 番目の腹節の筋 6 シナプスの運動神経終末に追跡されました。タイプ 1 b 研究 488 nm レーザー (図 3 a) を使用して興奮しているときに変異シンタキシン 1 a mEos2 の低解像度の画像で示すように、mEos2 の緑色の蛍光を検出できます。イメージングの実験、405 nm と 561 nm 励起レーザー イメージング深さ 133.5 であった nm と比 165.6 nm、それぞれ。緑のイメージは、16 の個々 のフレームの平均として買収されました。この緑のイメージは、単独でのシナプスの運動神経終末に photoconverted 映画のローカライズの極限解析に使用される対象地域を作成に使用されました。
取得 photoconverted sptPALM 映画の分析が超解像の強度、拡散係数を生成され、軌道マップ (図 3 a)。変異シンタキシン 1 a mEos2 モビリティのさらに個々 の軌道 (図 3 b) の平均二乗変位 (MSD) の解析による定量化を行った。統計上の比較を行うことができます (図 3 b) MSD 曲線下の領域を使用します。モビリティのさらなる分析シンタキシンがはたす-1 a-mEos2 の拡散係数の分布が得られます、これは統計的に不動の集団 (図 3) に携帯の比較によって評価できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> 図 1: MEos2 タグ構造を生成します。PFL44S-attB-MCS-病原と XbaI w + ベクトルが線形化されます。重複するポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の断片 (ポイ) の蛋白質を符号化と mEos2、それぞれ、クローンを作成できます、たとえば、 ura3 -酵母細胞の生体内での再結合、ギブソン アセンブリ。我々 の内因性変異シンタキシン 1 a プロモーターとターミネーター シーケンスが並ぶ構成クローン変異シンタキシン 1 a mEos2 遺伝子を生成するために注意してください。結果としての構築はその後 (ポイ) の mEos2 に融合蛋白を発現するトランスジェニック フライラインを作成するショウジョウバエの胚に注入することができます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> 図 2:ショウジョウバエ幼虫の郭清と斜光。ショウジョウバエ幼虫郭清の半円筒の PDMS ベースの実施を示す (A) スキーマ。フィレットの幼虫に開催されました、PDMS ゲル minutien ピンの使用によって。(B ・ C)幼虫 PDMS 準備は、シュナイダーの昆虫媒体を含んでいるガラス底培養皿の中に置かれました。やや斜めの照明構成で全反射顕微鏡は、運動神経終末における変異シンタキシン 1 a mEos2 を視覚化に使用されました。(D F)切り裂かれたショウジョウバエ幼虫の半円筒 PDMS ベース。シュナイダーの中でいっぱい画像皿に置かれた幼虫 PDMS 準備と幼虫を超解像パーム顕微鏡をイメージしました。スケール バー、10 mm。 (この図は、14から変更されている)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> 図 3:生体内でシンタキシンがはたす-1 a-mEos2 シナプス前のモーター神経ターミナルでの追跡をします。(A) A 低解像度全反射のイメージ変異シンタキシン 1 a mEos2 タイプ 1 b モーター神経ターミナルに。光電映画の分析はマップ生成 33 Hz sptPALM 超解像強度、拡散係数および軌道でイメージ。5,309 個々 の軌道がイメージ以上 16,000 フレーム取得。スケール バー、3 μ m。(B ・ C)6 別のモーター神経ターミナルからプロットした変異シンタキシン 1 a mEos2 の平均二乗変位 (MSD)(AUC) MSD 曲線下面積は、モビリティのレベルを定量化に使用されました。拡散係数の分布を明らかにする; 他の比として定量化することができます携帯電話や不動の変異シンタキシン 1 a 集団モーター神経ターミナルあたり 〜 2,400 軌道の平均値が得られた (n = 3 の幼虫)。平均の平均の標準誤差として表示されるデータ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここで我々 は説明の幼虫が 3 令単一分子光重合ローカリゼーション顕微鏡することができますライブキイロショウジョウバエのモーター神経ターミナルに実施されるどのように。

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

8.4K ビュー.  The University of Queensland. ここで我々 は説明の幼虫が 3 令単一分子光重合ローカリゼーション顕微鏡することができますライブキイロショウジョウバエのモーター神経ターミナルに実施されるどのように。

ビデオ: In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

神経科学

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...