우리가 단일 분자 분석 종류 그들의 지원을 위해 장 바티스트 Sibarita와 다니엘 Choquet (IINS, CNRS/보르도의 대학) 감사합니다. 우리는 특히 닉 Valmas 감사와 비디오와 그들의 도움에 대 한 제시카 Mcgaw (QBI, 퀸즐랜드의 대학) 녹음, 음성으로 그래픽 디자인을 그림. 이 작품은 호주 연구 협의회 (AR) 검색 프로젝트에 의해 지원 되었다 (F.A.M. DP170100125), 호주 연구 협의회 (F.A.M. LIEF 그랜트 LE0882864), 미래 친교 (FT100100725 B.V.S.), 호주 연구 협의회 (LIEF 부여 F.A.M에 LE130100078입니다.) 그리고 NHMRC 프로젝트 부여 (B.V.S.에 APP1103923). F.A.M. NHMRC 수석 연구원 (ONT1060075)입니다.

1. 유전자 변형 초파리 mEos2 태그 단백질 표현 디자인
<ol><li>태그 mEos2 단백질와 단백질을 선택 합니다. 이미징 성공률을 높이기 위해 선택 도메인 막 횡단 단백질 신경 원형질 막14 (예를 들어, Syntaxin-1A), 시 냅 스 소포 또는 autophagosomes26,27 (예를 들어, 단백질 Synaptobrevin-2), 또는 cytosolic 단백질 신경 플라즈마 막 단백질 (예를 들어, Munc18-1)와 가까운 상호 작용을.</li>
	<li>MEos2 태그 단백질 (그림 1) 인코딩 transgenes를 생성 합니다. 단백질 및 mEos2에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인. 참고: mEos2 코딩 순서는 관심사의 단백질의 C-말단에 융합 하도록 설계 되었습니다 pmEos2 N1 플라스 미드에서 증폭 될 수 있다. 복제 예 수행할 수 vivo에서 재결합 Saccharomyces cerevisiae 사용 하는 pFL44S에에서 의해-attB-MCS-w + 벡터14,28, 깁슨 등 다른 복제 메서드를 사용할 수 또는 어셈블리 프로토콜29<ol>
<li>BamHI 및 XbaI 벡터를 선형화 하 고 공동 인코딩 mEos2 및 관심사의 단백질 PCR 파편 함께 ura3- 효 모 세포로 변환. 유전자 변형 플라이 라인30를 생성 하는 구문으로 초파리 배아를 주사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후방 표준 효 모와 당 밀 매체 또는 플라스틱 튜브에 포함 된 다른 어떤 적당 한 대체에 유전자 변형 비행 문화. 건강 하 고 상당히 큰 시 냅 스 boutons31, 튜브, 인구 과잉 파리 방지 고 계란-누워;의 매일 후 새로운 튜브에 파리를 플립 이렇게 세 번째 탈피 애벌레는 먹이 잘 하면 그들은 매체에 방황 시작 시간에 의해 적절 한 크기를 도달 합니다. 실 온 (25 ° C)에서 유전자 변형 비행을 올립니다. 참고: 큰 시 냅 스 boutons 이미징 동안 구상 단백질의 큰 수량을 산출 하는 경향이 있다.</li>
</ol>2입니다. 유 충 탈피 3의 해 부
<ol><li>지름 및 적절 한 실리콘 엘라 스토 머 키트 (그림 2A)를 사용 하 여 높이에 mm ≤20 mm 원통형 또는 semicylindrical 모양된입니다 (PDMS) 기본 ≤20을 확인 합니다. 실리콘 엘라 스토 머는 실리콘 경화제 10: 1의 비율로 믹스.<ol>
<li>철저 하 게 5 분 부는 dimsensions와 금형에 혼합물 위에 나열 된에 대 한 혼합물을 저 어. 오븐에서 45 분 동안 100 ° C에서 강화 하자. PDMS 기본 해 부를 실시 하는 재단 될 것입니다. PDMS 자료 유리 바닥 문화 접시의 우물에 맞는 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리병 벽에서 방황 하 고 세 번째 탈피 애벌레를 선택 합니다. 4.5 확대 광학 스테레오-현미경을 사용 하 여 시각화를 지 면 PDMS 원통형 기지에 배치 하는 유 충.</li>
	<li>곡선 및 minutien 핀 입 걸 앞쪽 spiracles, 확장 하는 2 사이 머리에 그리고 두 후부 spiracles 사이의 항문에 꼬리에 붙어 핀셋을 각도 사용 합니다. 고정된 유 충에 실 온에서 슈나이더의 곤충 매체의 40 µ L를 추가 합니다. 참고: Hemolyph 같은 솔루션 (HL3 또는 HL6) 또한 슈나이더의 솔루션32,33대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Minutien 핀 벽의 중간에 incise을 사용 하 여 유 충의 복 부 체 벽의 지 면을 통해 액세스를 제공 합니다.</li>
	<li>체 벽을 사용 하 여 봄이 위 절 개 포인트에서 엽니다. 이전 후부 방향34에서 중간을 따라 자릅니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 고 사람은 유 충을가 위 봄: 침 샘, 기관, 창 자 등 내장을 제거. 슈나이더의 곤충 매체와 두 번 유 충을 씻어.</li>
	<li>좋은 집게 두 체 벽 날개를 잡고, 부드럽게 그들을 밖으로 기지개와 각 측면에 2 개의 minutien 핀을 스틱. 이 육각형 모양의 준비 (그림 2A)을 생산 한다.</li>
	<li>봄이 위를 사용 하 여 이미징; 동안 근육 움직임의 가능성을 감소 하 고 복 부 신경 코드에서 뇌를 분리 이 또한 평면 이미징 요리에 대 한 준비를 제공 합니다. PDMS 베이스에 모든 6 개의 minutien 핀을 밀어 곡선된 핀셋을 사용 합니다. 참고: 핀의 단지 작은 부분 복 부 벽 안에 포함 한다.</li>
	<li>유 충 해 부 절차 살아있다 확인, 약간 복 부 신경 코드를 찌 르 지,이 유 충 복 부 벽의 연동 수축을 유도 한다.</li>
</ol>3. 약간 비스듬한 조명 단일 입자 추적 현미경
<ol><li>유리 바닥 문화 접시에 해 부 유 충-PDMS 기지 반전. 실내 온도 슈나이더의 곤충 매체 (그림 2B)의 2 개 mL로 이미징 접시를 채우십시오.</li>
	<li>복 부 근육 6 및 735 63 x를 사용 하 여 시 냅 스와 함께 두 번째 및 세 번째 세그먼트에 모터 뉴런을 찾습니다 / 1.2 형광 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 나 물 침수 목표.</li>
	<li>해 부 유 충;를 사용 하는 현미경의 접 안경 밝은 분야 조명 사용 하 여 근육 6를 식별 합니다.</li>
	<li>현미경 수집 소프트웨어를 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 구성에 TIRF에 침투 깊이 증가, 그렇지 않으면 간접 조명 달성 TIRF 중요 한 각도에서 이동 1 °를 겨냥 틀 카메라 각도 밀어.</li>
	<li>녹색에서 mEos2를 시각화 하는 488 nm 레이저를 켠다. 낮은 레이저 파워를 사용 하 여 (22.8의 5% 미만 mW)을 피하기 위해 녹색 형광 표백. (어떤 문자열에 구슬 처럼 보이는) 신경 근육 접합 찾아서 낮은 해상도 TIRF 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>동시에 405 nm 레이저에 전환 (빨간 종 녹색에서 photoconverts mEos2)와 확률론 단일 mEos2 형광 단백질을 지역화 하려면 561 nm 레이저 (이미지 빨간 photoconverted mEos2). 참고: 낮은 405 nm 레이저 힘의 사용은 권장 (4.78의 0.9%를 0.005 mW)이 영화 중 비교적 일정 photoconversion 속도 대 한 수 있습니다. 50와 75 %561 nm 레이저의 사용 (20.1 mW), 이것이 신경 근육 학 교차로 주변 근육 조직의 형태에 부정적인 영향을 주지 않고 빨간 mEos2 종에서 형광을 확보 하기에 충분.</li>
	<li>각 신경 근육 접합 체인 시리즈 이상으로 구성 15000 프레임 33 Hz.에 as.czi 형식 저장 가능한 참조에 대 한 함께 메타 데이터를 보존 하기 위해 한 번 취득.</li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여 '.tiff' 파일을 '.czi' 동영상 파일을 변환.</li>
	<li>추적 분석 소프트웨어11,14,36 TrackMate 같은 피지/ImageJ37 에 적합 한 단일 분자와 인수 영화 분석 ( 재료의 표참조). 'X' 및 'y' 강도 포인트의 가우스 맞는 각 지역화의 좌표 확산 기능 (PSF). 참고: 문제 해결: 녹색 형광 관찰 되지 않거나 488 nm 레이저에 노출 되 면 신경 근육 학 교차로에서 너무 희미, 짧게는 photoconverting 및 레이저 이미징에 스위치 (405 nm 및 561 nm),이 레드의 더 생산 하는 데 도움이 mEos2의 종입니다. 다음 488 nm 레이저로 다시 전환 하 고 TIRF 이미지.</li>
</ol>4. 단일-분자 지역화 고정된 애벌레에
<ol><li>팜 통해 단백질 nanocluster 크기를 측정 해 부 고정 제-4 %paraformaldehyde 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석 된 후 슈나이더의 곤충 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 유 충을 품 어.</li>
	<li>제거 해 부 핀 고 고정된 유 충 1.7 mL에 스냅 잠금 microcentrifuge 튜브를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>해 부 및 다른 많은 애벌레 필요에 따라 다음 그들 3 회로 씻어 PBS로 수정.</li>
	<li>블록 버퍼 (PBS, 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 3% 정상 염소 혈 청의 솔루션)에 PBS를 바꿉니다.</li>
	<li>PBS와 애벌레 세 번 세척 후 필요한 기본 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.</li>
	<li>4 oc.에서 밤새 품 어</li>
	<li>3 회와 함께 PBS, 애벌레를 세척 후 필요한 이차 항 체 (블록 버퍼 솔루션에 희석)으로 품 어.</li>
	<li>세 번 PBS와 애벌레를 씻고, 다시 PDMS 기지, 앞에서 설명한 단일 분자 추적에 대 한 이미지에 유 충을 첨부.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 3 탈피 초파리 애벌레의 신경 근육 학 교차로에서 단백질 mEos2 태그의 단일 분자 추적을 설명합니다. -표현의 유전자 변형 단백질을 피하기 위해, Syntaxin-1A-mEos2 식 생 Syntaxin-1A 발기인에 의해 주도 되었다. 시 냅 스 단백질 이동성의 연구는 대부분 체 외에서 배양된 세포와 대뇌 피 질의 뉴런9,11,,1213의 조사 제한 되었습니다. 이 단백질 전시 살아있는 동물에서 비슷한 이동성 서명 여부를 하는 것은 크게 알려져 있다입니다. 단일 단백질 이동성에 vivo에서시각화 하 등 광학 투명성, 접근성, 그리고 침투 깊이 한계 극복할 수 있다. 애벌레 준비를 해 부하 고 시각화 하는 근육의 표면에 포함 된 신경 근육 접합부, 우리 광 투명성과 접근성의 문제를 피할. 일반 TIRF 구성에서 이미지 단일 분자 이동성 시도 실패 입증. 그러나, 약간 비스듬한 조명 사용 증가 여기 레이저 깊이 침투 수 있습니다. 또한, 유 충을 무력화 하는 데 사용 하는 minutien 핀을 단백질 이동성에 마 취 사용의 어떤 가능한 부정적인 영향을 피하기 위해 도움이. 그것은 기름 침수 목표, x 100 같은 높은 배율 목표를 사용 하 여 단일 분자 비보를 시각화 수 있습니다. 그러나, 증가 확대 초점 드리프트의 발생을 증가할 수 있습니다. 또한, 우리는 낮은 강도 (~ 30%) 사용 모터 신경 맨끝에 단일 분자 이미지를 성공적으로 561 nm 레이저. 추가 테스트 하는 것은 저전력 레이저를 사용 하 여 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경 원형질 막의 근접 내의 시 냅 스 단백질의 이동성을 시각화 적당 하다. 이 방법을 사용 하 여, 작은 단백질-Syntaxin-1A 및 바인딩 단백질 Atg18a autophagosome-의 이동성 성공적으로 이미지 비보14,26되었습니다. 모터 신경 축 삭도 수에 단백질의 이동성27조사. 그러나, 뇌 또는 복 부 신경 코드에 단백질의 이동성의 기본 조직을; 제작한 높은 배경 신호 때문에 평가 하기 어려운 증명할 수 있습니다. 또한, (replicability 되도록) 뇌 구조를 태그 붙일 필요 합니다 같은 뇌 구조에 단백질 이동성을 시각화 하 고 듀얼 카메라 이미징의 사용을 필요한 것.
보다 더 많은 개발 3 탈피 애벌레38,39 초파리 에서 슈퍼 해상도 현미경에 대 한 현재 사용할 수 있는 방법은 주로 이미징 배아, 제한 됩니다. 이러한 프로토콜 주요 문제는 그들은 몇 군데, 지역에서 궤도의 낮은 수를 산출 하 고 그러므로 이동성 상태22,40의 심층 분석을 방지. 우리의 vivo에서 단일 분자 프로토콜 추적 궤적의 높은 번호를 생성 하는 능력 있으며 따라서 Caenorhabiditis 선 충 , 제 브라 등 다른 동물 모델에서 사용 될 수 있습니다. 실제로, 모든 NMJ 체인 생성 ~ 2400 궤도 다른 모바일 상태와이 상태14,27사이 전환 분석을 위해 적당 한 만들기. 또한, 많은 비보에 단일 분자 이미징 전략은 동물20,22는 이미징 이루어집니다 physiologic 기능을 변경할 수 있는 무력화 하는 마 취약의 사용에 의존 합니다. 여기 우리는 minutien 핀을 사용 하 여 애벌레를 무력화 하는 ' 마 취 무료 ' 프로토콜을 최적화.
이 프로토콜의 사용 가능성은 3 개 차원에 있는 단백질의 이동성을 시각화에 대 한 있을 수 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경에 최근 발전 있도록 단백질 이동성 시각화 된 체 외에 'x', 'y', 그리고 'z' 차원41,42. 우리의 현재 메서드의 'z' 축에 있는 단백질의 이동성에 대 한 고려 하지 않습니다. 그러나 터미널 초파리 모터 신경 구형 구조 이며 귀중 한 미래의 접근 3 차원 볼륨43단백질 이동성을 계량 하는 것. Z-차원에서 이미징은 난시 렌즈를 사용 하 여 가능 합니다. 또는, TIRF 모드44,45, z-해상도 증가 된다. 그러나, 우리의 실험에서 난시 렌즈 없이 syntaxin1A mEos2의 단일 분자 시각화에 약간 비스듬한 조명을 사용 했습니다.
결론적으로, 두 유전자 변형 초파리 비행 재고 표현 하는 단백질의 유전자 변형 유 충으로 변화의 가능성을 갖춘 TIRF 현미경을 해 부하는 photoconvertible 단백질, PDMS 기본 태그로 조명의 각도이 프로토콜에 설명 된 대로 단일 단백질을 시각화 하는 데 필요한 가장 중요 한 도구입니다.

신경 통신 원형질 막1시 냅 스의 소포를 포함 하는 신경 전달 물질의 규제 융합을 통해 발생 하는 신경 전달 물질 방출에 의존 합니다. Exocytosis2,,34,,56 라고 하는이 프로세스는 매우 동적 이며 업 또는 다운-통제 자극7의 속도 변동에 따라 될 수 있습니다. 이러한 프로세스에 관련 된 단백질 브라운 모션 적용 되며 따라서 전체 조직 유지 하는 다양 한 바인딩 이러한 생리 기능을 보강 하는 작업의 수를 표시. 플라즈마 막 단백질은 매우 동적, 원형질 막7,,89,10,11에 nanoclusters로 분자의 측면 트래핑을 허용 12. 따라서, 이러한 단백질의 이동성 조사 작업8의 그들의 모드를 명료 하 데 도움이 됩니다. 지금 알려진 다 측면 빠른 기동성을 전시 하 고 옆쪽으로 분자 제공할 수 있다 nanoclusters 내에서 트랩핑 녹는 N-ethylmaleimide 민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (SNAREs), 예를 들면 Syntaxin-1A, 같은 시 냅 스 단백질 창 고 그리고 소포 융해9,13,,1415에 대 한 사이트.
Photoconvertible 형광 단백질 단위체 (m) Eos16,17 가18, 등의 최근 개발 허용 했다 접근의 사용을 통해 신경 플라즈마 막 단백질의 전체 해상도 등 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 및 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)14,,1519. 이러한 발전 성과 교양된 라이브 세포와 신경 생물학 단백질의 nanoclustering에 대 한 조사를 활성화 했습니다. 최근에, 연구는 실시 되었습니다 명료 (비슷한 높은 해상도)에서 역학과 라이브 그대로 생물의 신경에 있는이 막 단백질의 조직 같은 생쥐, 꼬마 선 충, 및 를 초파리 melanogaster14,20,,2122.
하지만 또한 같은 hindrances를 극복 하는 능력 뿐만 아니라 (예: 팜, 폭풍우, 및 photoconvertible fluorophores), 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 이미징 도구를 사용 해야 역학과는 단백질에서 생체 내에서 의 조직 조사 단백질 및 이미징 레이저의 침투 깊이 접근으로 그대로 동물에 세포내 단백질 이미징 본질적으로 이미지 그대로 마우스의 해 마 같은 그대로 동물의 생활 조직 내의 깊은 포함 하는 구조 단백질으로 도전 이다. 따라서, 단백질 또는 직물의 표면 가까이는 몇 군데 더 쉽게. Vivo에서 화상 진 찰과 다른 어려움은 동물에서 재현성 보장 이다. 로 해부학 한 샘플에서 다른 다를 수 있습니다, 다른 그대로 동물 샘플에서 복제의 용이성과 구조를 선택 하면 증명할 수 있는 또한 도전. 틀에 박힌 구조를 사용 하 여 같은 synapses, 이러한 어려움 들을 극복에 도움이.
최근 연구 결과 다른 조사 예는 조직/기관의 표면에 단백질 조직 몇 군데 있다 하는 동안 꼬마 선 충22, 같은 광학 투명 한 표 피와 동물에서 단백질 이동성을 몇 군데 있다 살아있는 마우스21의 두개골을 통해 대뇌 피 질의 뉴런에 걸 이미지입니다. 경우에 따라 마 취약 사용 되었습니다 움직이지; 동물 유지 그러나, 특정 마 취약 관심사의 단백질을 저하 수 있습니다. 따라서 오류를 최소화 하기 위해 vivo에서 화상 진 찰 동안 동물을 움직이기 힘 드는 유지 하는 대체 수단을 탐험 한다.
슈퍼 해상도 이미징 vivo에서 다른 경고는 관심사의 단백질을 조명 하는 데 사용 하는 레이저 부정적인 주변 조직에 영향을 미칠 수 및 따라서 여기 강도 가능한 한 낮게 유지는 것이 좋습니다. 레이저에 의해 주변 조직의 조명 또한 배경 신호를 증가 경향이 있다. 낮은 자극 강도 사용 하 여 백그라운드를 줄이는 데 도움이 됩니다, 그리고 그것은 되 고 경고는 또한 형광 단백질 광자 수확량에서 감소 이어질 수 있습니다. 분석 하는 동안 배경 빼기 대안 이미지 분석 전에 배경 신호를 줄이기 위해 수단으로 사용 될 수 있습니다.
초파리 는 vivo에서 특정 단백질 기능 조사에 대 한 기초가 튼튼한 유전 도구 제공 이미징에 대 한 이상적인 유기 체를 선물 한다. 상류 활성화 순서 (UAS)-Gal4 시스템 단백질의 시간적, 공간적 표현 가능 하 고 따라서 neurotransmission23, 조작 하는 데 사용 될 그런 초파리 과도 사용 하 여 열 유전자 자극 수용 체 잠재력 하위 가족 A1 (dTRPA1)24 또는 광학 유전자 자극 훨씬 red 이동 CsChrimson25 를 사용 하 여 이미징14와 결합 될 수 있다. 우리는이 시스템에서 수행 하는 단일 분자 이미징 vivo에서 의 합병증의 많은 극복 하 고 지금 설명 하는 방법 단일 입자 추적 실시 될 수 있습니다 초파리 melanogaster 3 탈피 애벌레에서.

<table><tbody><tr><td>PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed Culture Dish</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Optical Stereo-microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Curved Tweezers (Style 5/45)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins (0.1mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black acquisition software</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly strain</td><td></td><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo single-molecule tracking at the drosophila presynaptic motor nerve terminal

최고 해결책 현미경 검사 법 기술의 증가 수는 나노 세포 세계 지배 메커니즘을 밝히기를 돕고 있습니다. 살아있는 세포에 개별 분자의 시각화에 대 한 특별 액세스 제공 단일 분자 이미징 기세를 얻고 있다. 여기, 우리가 초파리 애벌레에 단일 입자 추적 사진 활성화 지역화 현미경 (sptPALM)을 수행 하기 위해 개발 하는 기술을 설명 합니다. 도킹, 프라이 밍, 및 포함 하는 신경 전달 물질의 융합을 추진 하는 주요 연 접 단백질에 의존 하는 시 냅 스 통신 플라즈마 막으로 소포. 단백질 지질 및 단백질-단백질 상호 작용의 범위는 밀접 하 게 이러한 프로세스 조절 및 연 접 단백질 따라서 이동성 각 이러한 키 이벤트와 관련 된 변화를 전시. 이 단백질의 이동성 그대로 살아있는 동물에 그들의 생리 기능으로 연결 하는 어떻게 조사 하 고 행동의 그들의 정확한 메커니즘을 이해 하는 데 필수적 이다. 높은 해상도 vivo에서 단백질 이동성 추출 광학 투명성, 접근성, 등 침투 깊이 한계 극복 필요 합니다. Photoconvertible 형광 단백질 Syntaxin-1A를 약간의 간접 조명을 통해 시각 및 모터 신경 터미널에서 또는 제 3의 모터 신경 축 삭을 따라 추적 수 연 접 단백질에 초파리 를 탈피 하는 방법 설명 유 충입니다.

위에 나열 된, Syntaxin-1A-mEos2 유전자 변형 Drosophilamelanogaster 했다 프로토콜을 사용 하 여 생성 (그림 1). 유전자 변형 3 탈피 초파리 애벌레 PDMS 원통형 자료 (그림 2A-F)에 해 부 했다. Syntaxin-1A의 단일 분자를 시각화 하려면 우리는 약간 비스듬한 레이저 조명14TIRF 현미경에 팜 사용.
Syntaxin-1A의 단일 분자는 두 번째 복 부 세그먼트의 6 근육에 모터 신경 연 접 맨끝에 추적 했다. MEos2의 녹색 형광 형식 1b boutons 488 nm 레이저 (그림 3A)를 사용 하 여 흥분 하는 경우에 Syntaxin-1A-mEos2의 저해상도 이미지와 같이 검출 될 수 있었다. 이미징 실험, 405 nm 및 561 nm 여기 레이저 이미징 깊이 했다 133.5 및 165.6 nm, 각각. 녹색 이미지는 16 개별 프레임의 평균으로 인수 되었다. 이 녹색 이미지는 photoconverted 동영상 혼자 연 접 모터 신경 맨끝을에 지 방화의 분석을 제한 하는 데 사용 하는 관심의 영역을 만드는 사용 되었다.
취득된 photoconverted sptPALM 영화 분석 슈퍼 해결된 강도, 확산 계수, 생성 및 궤적 지도 (그림 3A). Syntaxin-1A-mEos2 이동성 개별 궤적 (그림 3B)의 제곱 변위 (MSD)의 분석에 의해 정량 추가 되었다. 통계 비교를 할 수 있는 엠 곡선 (그림 3B)에서 영역을 사용 하 여. 이동성의 추가 분석 Syntaxin-1A-mEos2의 확산 계수 분포 있고이 부동 인구 (그림 3C)을 모바일의 비교에서 통계적으로 계산 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> 그림 1 : MEos2 태그 구문을 생성. pFL44S-attB-MCS-w + 벡터 BamHI 및 XbaI 오는지. 겹치는 연쇄 반응 (PCR) 관심 (POI)의 단백질을 인코딩 조각 그리고 mEos2, 각각, 수 복제 될, 예를 들어 ura3- 효 모 세포에서 vivo에서 재결합 또는 깁슨 어셈블리. 참고 Syntaxin-1A-mEos2 transgene 생성, 우리는 구조 복제 어귀 생 Syntaxin-1A 발기인 및 종결자 시퀀스. 결과 구문 이후에 표현 관심 (POI)의 mEos2 융합 단백질 유전자 변형 플라이 라인을 만들 초파리 배아에 주입 수 있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> 그림 2 : 초파리 유 충 해 부 및 간접 조명입니다. (A) 스키마 초파리 유 충 절 개 반 원통형 PDMS 기지에 실시를 보여주는. 모 깎기 애벌레에 열렸다는 PDMS의 minutien 핀을 사용 하 여 젤. (B-C) 유 충 PDMS 준비 슈나이더의 곤충 매체를 포함 하는 유리 바닥 문화 접시 안에 배치 했다. 약간 비스듬한 조명 구성에 TIRF 현미경 모터 신경 맨끝에서 Syntaxin-1A-mEos2를 시각화 하기 위해 사용 되었다. (D F) 해 부 초파리 애벌레는 반 원통형 PDMS 기지. 유 충은 팜 슈퍼 해상도 현미경에 몇 군데와 애벌레 PDMS 준비 슈나이더의 중간, 가득 이미징 접시에 배치 되었다. 스케일 바, 10 m m. (이 그림 수정 되었습니다14에서). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> 그림 3 : Vivo에서 Syntaxin-1A-mEos2 연 접 모터 신경 터미널에서 추적. (A) A 저해상도 TIRF의 이미지 Syntaxin-1A-mEos2 형식 1b 모터 신경 맨끝에. Photoconversion 영화 분석 33 Hz 생성 된 sptPALM 초 해결, 확산 계수, 강도와 궤적에서 지도 몇 군데. 5,309 개별 궤적 군데 이상의 16000 프레임 영화 수집 했다. 스케일 바, 3 μ m입니다. (B-C) Syntaxin-1A-mEos2의 제곱 변위 (MSD) 6 다른 모터 신경 맨끝;에서 플롯은 MSD 곡선 (AUC) 지역 이동성의 수준을 계량에 사용 되었다. 확산 계수 분포 보여;의 비율으로 양이 정해질 수 있는 모바일 및 부동 Syntaxin-1A 인구 모터 신경 터미널 당 ~ 2400 궤도의 평균 가져온 (n = 3 애벌레). 데이터의 평균 표준 오차로. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

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An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

8.4K 조회수.  The University of Queensland. 여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

비디오: In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

연구

신경과학

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

발생학

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

생물학

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

초파리 뉴런 개발시 빠른 수지상 분지 역학의 시간 경과 라이브 이미징 및 정량화

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Observation Microtubule networks in Drosophila Neuromuscular junctions and muscle cells(초파리 신경근 접합부 및 근육 세포의 미세소관 네트워크 관찰)

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

저자 스포트라이트: Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

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