以下のプロトコル、マウス、研の分離を参照してください、まだ DC サブセット、他の細胞と同様に全体的な原則があります。12-16 週齢の c57bl/6 j マウスは実験動物ケアの認定-認定動物施設協会で維持されました。すべてのプロトコルは、スタンフォード大学、テルアビブ大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 腫瘍の分離は、単球由来の DC を関連付けられています。
<ol><li>層流フードの CO2安楽死させたマウスから腫瘍を取り外し、ウシ胎児血清 (FBS) なし RPMI 培地で腫瘍。 注: マウスを剃るし、毛皮からの潜在的な汚染を最小限に抑えるため、腫瘍を削除する前にそれらの 70% エタノール スプレーそれ勧めします。大きい腫瘍が壊れ、細胞死を受けることになりやすい傾向がありますが少ない DC を持っているので、腫瘍が 25-40 mm2を超えていないことを確信します。DC の大きな数字が必要な場合各マウスは複数のサイトでの腫瘍細胞を注入することができます。</li>
	<li>滅菌の層流フードの下で小さな断片 (約 1 × 1 mm2) に外科はさみを使用して腫瘍を切る。<ol>
<li>追加 30 mL 滅菌平底チューブに電磁攪拌バーとハンクの 5 mL が含まれている 1 つのマウスからのすべての腫瘍片平衡塩溶液 (HBSS)、2 mg/mL コラゲナーゼ IV、および 0.01 mg/mL DNase 私。 注意: 骨髄細胞は定常状態下でも、糖鎖を通してエネルギーを作り出します。したがって、10-15 分ほどのグルコース飢餓として (例えば HBSS、RPMI、および DMEM)、グルコースが含まれているメディアだけを使用は細胞死と 24 時間使用のみ低エンドトキシン コラゲナーゼ IV コラゲナーゼとしてグラム陽性によって生成される内アポトーシスになります細菌 (クロストリジウム histolyticum)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20-30 分のマグネチックスターラー 37 oC のインキュベーターで約 200-400 rpm で攪拌します。</li>
	<li>完全なメディアの 5 mL を追加し、精力的に再停止します。</li>
	<li>70 μ m 携帯こし器を通って細胞をフィルターします。細胞のペレットを 5-10 分の 4 のoC 400 rcf の遠心分離機します。 注意: いくつかの腫瘍は壊死、細胞の残骸や細胞外マトリックスの比較的大量を含めると、消化酵素の直後のセルを隔離しようとしないでください。セルのみを取得する 15% 密度勾配媒体にセルを適用します。</li>
	<li>1 mL の 10 の x PBS、浸透圧を調整し、100 %percoll 原液を入手すると密度勾配媒体の 9 mL を中断します。ミックス 1.5 mL 密度勾配媒体は 8.5 ml HBSS ソリューションをストックし、腫瘍細胞ペレットを精力的にまぜます。軽くレイヤーの 15% 密度勾配媒体と 400 メーカで室温で 20 分間遠心する上に DMEM の 2 mL。チューブの下部にペレットを形成、細胞培養上清を破棄します。<ol>
<li>10 mL 2 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM EDTA (分離バッファー) と 4 oC 400 rcf 5-10 分間遠心分離細胞のペレットを含む HBSS に再懸濁し、2 回小球形にされた細胞を洗浄します。</li>
		<li>トリパン光学顕微鏡の下で青色を使用して検定上のセルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL 単独で 1 x 10 の8セルを再停止バッファーし、4 oC を CD11b 30 μ l インキュベートそれら+共役 15 分用の磁気ビーズ。 注意: これは DC をアクティブ化し、細胞死を誘導、CD11c 共役ビーズの使用を避けます。抗 CD16/32 抗体と FcγRII と FcγRIII をブロックしないでください。遮断抗体 FcγR を縛ると MAP キナーゼの強力なリン酸化を誘導して、DC をプライムします。<ol>
<li>4oc 以上で 5-10 分のための 400 のメーカで分離バッファーと遠心分離細胞の 9 つの mL を追加することによって余分な非連結ビーズを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上清を吸引し、再 1 mL 分離バッファー内セルを中断します。洗ってある磁気列にセルを適用します。3 mL の分離バッファーで 2 回コラムを洗浄します。<ol>
<li>磁石から列を削除します。分離バッファー列に 6 mL のピペット、プランジャーを押すことにより滅菌採取管に磁気標識細胞を洗い流します。4 oc 以上で 5-10 分のための 400 の rcf の遠心分離機セル</li>
		<li>再 1 x 10 の7セルあたり 100 μ L でセルを中断し、次の蛍光色素標識された抗体で染色: Ly-6 C、MHCII 家系の負 (TCRb、シグ F、B220、CD19、FceRI、Ly6G)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲート側方散乱 (SSC) を使用して、小さなセルでセルを並べ替えるし、散布 (FSC) と完全な培 5 ng/ml の GM-CSF の文化を転送します。3 7 1 時間インキュベート細胞oC プレートを遵守するマクロファージを可能にするため。その後、転送、疎と新しい培養皿に非付着性のセル。 注: マウス研 CD11b として定義されます+/CD11c+/MHCIIこんにちは/Ly6Clo/int 7,26,27。腫瘍モデルとは一部のモデル (例えば LMP) で Ly6C の表現が大幅に異なる場合があります MoDCs は、完全に Ly6C 式を欠いています。全体的に、1 つ 100 mm3 B16F10 腫瘍が 5 x 104 106合計セル x 約 4-5 の結果、DC の通常含まれています。これらの細胞の 10-15% が免疫細胞と 8-10%、研。DC の数の増加は、複数のサイトでの腫瘍マウスを注入することにより実現できます。並べ替えのみ小型の SSC/FCS の細胞、その他の骨髄性細胞として CD11c や Ly6C などのマーカーを表現できます。 オプション: 並べ替えエクスプレス Ly6CこんにちはMHCII の否定的な小型の SSC/FSC 細胞として腫瘍浸潤単球。その後、単球の in vitro DC を取得する 50 ng/mL GM-CSF と文化します。</li>
</ol>2. 末梢血単球由来の DC の分離
注: 成熟した MoDCs マウス血液中比較的まれであるので、以下のプロトコルはその派生の in vitro並べ替えられた単球からです。
<ol><li>血の単球の増加、4% イソフルランとマウスを麻酔し、それらを皮下注入 (サウスカロライナ) 50 μ L の PBS の GM-CSF の 1 μ g とします。</li>
	<li>1-2 時間後 CO2を用いたマウスを犠牲に。 注意: を犠牲にしないマウス頚部転位によって内部の出血の原因になります。</li>
	<li>Euthanization の直後にマウスを 70% エタノール スプレーし、滅菌の層流フードの下の外科はさみを使用して心臓を覆う皮膚を削除します。エタノールが付いているはさみをきれいにし、心臓の右心房を切る。ゆっくりと、20 mm EDTA HBSS 10 mL のシリンジ、25 G 針を使用して右心室を介して心をフラッシュします。<ol>
<li>ヘパラン硫酸と EDTA を含む生殖不能の管に胸腔内から滅菌注射器で血液を収集します。肝臓と肺になるピンクや白まで心をフラッシュし続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>低いブレーキで 15 分間室温で 400 メーカで密度勾配中程遠心分離機に血液を適用します。 注意: 使用エンドトキシン密度勾配媒体 (通常より小さい 0.12 mL あたり EU)。<ol>
<li>新しい管に単核細胞を収集します。10 mL 2 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 10 mM EDTA (分離バッファー)、および 4 oで、遠心分離を含む HBSS で再懸濁細胞ペレットに 5-10 分の C 400 メーカによってセルを洗浄してください。 注意: は、少なくとも 1 g/L ブドウ糖にはが含まれているメディアだけを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD11b 肯定的な選択のため再中断 1 mL 分離バッファーに 1 x 10 の8セルと 4 oc 以上での CD11b 共役の磁性体ビーズを 50 μ l 15 分間インキュベートします。<ol>
<li>9 mL の分離バッファーを追加し、培養上清 4 oC. 吸引で 5-10 分のための 400 の rcf の遠心分離によって余分なビーズを洗浄し、再 1 mL 分離バッファー内セルを中断します。製造元の指示に従って清ら磁気列にセルを適用します。</li>
		<li>磁石から列を削除、列に分離バッファーの 6 mL のピペット、プランジャーを押すことにより滅菌採取管に磁気標識細胞を洗い流します。3 mL の分離バッファーで 2 回列 4 oc. 洗浄で 5-10 分のための 400 のメーカで細胞を遠心分離機します。</li>
		<li>1 x 107セル/100 μ L 分離バッファーと次の蛍光色素標識された抗体で染色の細胞を再停止: 0.1 μ g CD115、0.25 μ g MHCII、および 0.1 μ g Ly-6 C/1 x 10 の6セル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>小さな側方散乱 (SSC) および小さい前方散乱 (FSC) 細胞のゲーティング セルを並べ替えます。 注: マウス炎症性単球は一般的に CD115 として定義+/MHCIIlo/指定、総额/Ly6Cこんにちはとパトロール中の単球は CD115 として定義されて+/MHCIIlo/指定、総额/Ly6Cneg 4, 5。2 つのサブセットの間の分離が不要の場合、合計 SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIloセルを並べ替えることができます。世間知らずと担癌マウスの両方を含む約 5-8 x 10 まで血液 1 mL あたり4研 4-5 105研次 x GM-CSF の注入。うち、約 70% の炎症性単球、30% をパトロールしている単球。</li>
	<li>20 ng/mL GM-CSF と補われる完全なメディアの 1 x 106セル/ml の濃度で細胞をプレートします。1 日後さらに 4-5 日間新しいプレートと文化に非付着と緩く付着性のセルを転送します。 注意: DC メディアは、ピルビン酸と補われないする必要があります。</li>
</ol>3. 腫瘍 IgG 免疫複合体の作製
<ol><li>完全な DMEM メディアで 70% コンフルエントまでに 75 cm2培養用フラスコで培養腫瘍細胞。<ol>
<li>0.25% トリプシン/過剰 trypsinization を避けるために顕微鏡下で培養フラスコとモニター細胞の形態から細胞をデタッチする EDTA の 2 mL を追加します。</li>
		<li>トリプシンの消化力を阻害し、4 oC、セルをペレットに 5-10 分の 400 の rcf の遠心分離機に 8 mL の完全培 (トリプシン 2 mL) あたりを追加します。 注:マイコ プラズマ市販 PCR キットを使用して腫瘍細胞を確認するを確認します。グラム陰性菌とカブトガニ含まライセート(ラル) を使用して菌のエンドトキシンの存在をテスト分析28)。血清を 0.22 μ M で濾過し、9 の連邦規制のコード ウイルスをテストする必要があります。さらに、37 oc 以上で 2 日間の文化やスープ、LB 寒天培地に 100-200 μ L をドロップすることによって、培養培地および血清をテストします。</li>
		<li>もう一度セルを洗浄再 10 mL の PBS で 400 メーカで 5 ~ 10 分間遠心するそれらを停止することによってトリプシンと血清の遺跡から上清を吸引し、洗浄を 2 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 10 分間バッファリング 1.8% パラホルムアルデヒドでセルを修正します。<ol>
<li>セルを洗浄して再 10 mL の PBS で 4 oC 400 メーカで 5-10 分間遠心するそれらを停止することによって。</li>
		<li>吸引清と繰り返し、さらに 2 回を洗ってください。 オプション: 腫瘍取り込みアッセイ用細胞ラベル付けできますがそれらを 37 oC 1 μ M carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を含む PBS 中で 5 分間インキュベートし。CFSE は氷で 10 分間の完全なメディアとしてクエンチしました。セルは、残留色素を削除する 2% 血清を含む PBS で広範囲洗浄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再潜在的な非特異的タンパク質間相互作用をブロックするために FACS バッファー (2% の FCS + 5 mM EDTA を添加した PBS) と抗 CD16/32 の 0.5 μ g/mL のセルを中断します。100 μ L あたり 1 x 10 の5セルの濃度で U 字型 96年穴/プレートのプレート。<ol>
<li>腫瘍-結合の抗体は 5 μ g ・ 10 の5セル × 5 ng/1 からまでの異なる希釈率を追加します。15 〜 20 分のための氷の板を孵化させなさい。 注: IgG 抗体が説明24としてプロテイン A 列に素朴な 20-24 週齢の雌マウスの血清から分離されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 μ L の PBS を追加し、5-10 分の 4 のoC 400 メーカでプレートを遠心分離によって細胞を洗浄します。<ol>
<li>培養上清を破棄し、洗濯を 2 回繰り返します。蛍光標識二次抗体を含む 100 μ L FACS バッファー内セルを再停止します。20 分間氷の上プレートを孵化させなさい。</li>
		<li>FACS バッファーの 200 μ L を追加し、5 ~ 10 分 400 メーカでプレートを遠心分離によって洗浄細胞培養上清を破棄し、洗浄を繰り返します。</li>
		<li>フローサイトメトリーによる腫瘍バインディングを分析し、セルを塗るに必要な最低限の濃度を決定します。 注: 以降の機能アッセイに増加しない平均蛍光強度 (MFI) による腫瘍細胞の少なくとも 5 倍アイソタイプ コントロール上の抗体を使用しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 腫瘍 IgG IC と研の活性化
<ol><li>3.1 3.4.3 ~ のセクションで説明するように最小の IgG 濃度と腫瘍細胞をコートします。<ol>
<li>腫瘍 IC、研を起動する前に 1 日交換研文化メディアは、GM-CSF が含まれています。これを行うには、優しくメディアを吸引、予め温めておいた完全培地で細胞を洗浄します。 注: 少なくとも 2-3 時間 (またはも一晩) 並べ替え後完全なメディアの GM-CSF なしと IC でそれらをアクティブ化する前に、隔離された成熟した腫瘍関連研を培養する必要があります。</li>
		<li>腫瘍の取り込み解析 1:5 (IC:MoDC) の割合で研に CFSE 分類腫瘍 IC を追加し、12-16 h 1 × 106 DC あたり完全なメディアの 1 つの mL で一晩インキュベートします。</li>
		<li>FACS 解析研活性化実験では、1:1 (IC:MoDC) 比で腫瘍 IC を追加し、12-16 h 一晩インキュベートします。 注: 強くお勧めも、肯定的な制御を含めるどの研では 1 μ g/ml の LPS または他 TLR アゴニストの刺激。</li>
		<li>次の一晩活性化培養上清を吸引、洗浄細胞 3 回優しく分離バッファーまたは 10 ミリメートルの EDTA HBSS。</li>
		<li>プレートから DC を外す、1 mL 10 mM EDTA を含む HBSS で 2 〜 3 分のための細胞を孵化させなさい、積極的なピペッティングにより細胞をデタッチします。</li>
		<li>400 メーカで細胞を遠心し、再 1 × 106 2% の FCS、5 mM EDTA (FACS バッファー) および遮断抗体の 0.5 μ g を添加した 90 μ L の PBS DC を中断します。氷上で 5-10 分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞に抗体の混合物を染色の 10 μ L を追加し、15 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>2 mL FACS バッファーを追加すると、セルと 4 oC 400 メーカで 5-10 分間遠心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 μ L FACS バッファー内セルを再停止します。<ol>
<li>追加 0.5 ~ 1 μ g/mL DAPI の解析から死んだ細胞を除外するのには、サンプルを実行する前に 1-2 分。過剰を孵化しないで DAPI、研は 10-15 分以内を取ること。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+SHP-1+are+DC-intrinsic+checkpoints+for+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity.</a> JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).</li>
<li>Kenkel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunosuppressive+Dendritic+Cell+Subset+Accumulates+at+Secondary+Sites+and+Promotes+Metastasis+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li>
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<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inhibitory+receptor+%28ILT3%29+expressed+on+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+involved+in+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing.</a> J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).</li>
<li>Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+limits+TNF-alpha+production+in+CD16-activated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).</li>
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<li>Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+CD11b+and+CD11c+beta%282%29+integrins+by+antibodies+or+soluble+CD23+induces+macrophage+inflammatory+protein+1alpha+%28MIP-1alpha%29+and+MIP-1beta+production+in+primary+human+monocytes+through+a+pathway+dependent+on+nuclear+factor-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB.</a> Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).</li>
</ol>

すべての著者は、彼らは利益相反があるし、開示するものがあることを宣言します。

マウスを予防接種に必要な DC の数が多いを与えられた (10 x 約 2-46 DC ごとに 1 つのマウス)、マウスの戦略は BM とex vivo活性化に続いて脾臓から DC の分離に基づく予防接種のほとんど。ただしアクティブ化腫瘍 DC生体内で、活性化する脾臓と BM DC の同じ条件を使用して、多くの場合、効果的な免疫の生産に成功したとされているしようとします。2 つのそれに続く出版物?...

彼らの発見以来、樹状細胞 (DC) は、T 細胞分化1をスキューするユニークな能力のための広範な研究の焦点をされています。過去数十年にわたって広範な研究努力は腫瘍の進行および免疫2中様々 な DC サブセットとその機能の定義を求めています。パターン認識受容体、組織分布の異なる異種細胞集団から成る Dc や渡り鳥と抗原提示機能3,4,5。他の DC サブセットに比べると、単球由来 DC (研) がはるかに多い腫瘍で、循環から簡単に生成することができますまたは腫瘍浸潤単球6,7。したがって、彼らの相対的な感染率の活用を求めている多くの臨床試験は、T 細胞免疫8,9を引き出す自己研の体内と体外の操作に基づいています。
同様に、実験的腫瘍モデルの DC ベースの予防接種が必要です 2-3 シリアル注射、離れて 1-2 × 10 の 5-7 日間6アクティブ DC パルスと腫瘍抗原。したがって、DC のこの大規模な数を達成するためにほとんどのマウスの研究が主に研 (IL-4 マウスの設定不要) 7-9 日間 GM-CSF の骨髄 (BM) 前駆体から培養を使用10,11。それにもかかわらず、全体的に通常 DC コンパートメント12,13マウスが GM-CSF knockout を与えられ、その文化から得られた混合集団を与えられた14これらの DC の生理学的な関連性を質問に呼ばれてきた。
また、DC は、脾臓細胞から日常的に分離することが。ただし、DC 構成は約 0.3 0.8% (約 7 × 105 DC/脾臓の結果)、合計の脾細胞と CD103 のみ、これらの細胞の+ DC と研戻るリンパ器官に移行できます。MoDCs 脾 DC 集団15,16の約 10-15% を構成する、のでほとんどの隔離のプロトコルは約 1 × 105研脾臓あたりをもたらします。研の拡大は、GM-CSF、脾研17100 増加を分泌する transfected の B16 細胞を注入することにより実現できます。しかし、研の DC ワクチンを開発するための使用は限られた人間で得られたこの手順が行われることはできませんので研は既に高度に活性化します。
DC の十分な番号を取得、に加えて自家癌細胞に対して効果的な DC ワクチンの開発の別の課題は、完全に DC をアクティブに腫瘍の設定で十分な危険信号の不足を含みます。共刺激シグナルの誘導は通常パターン認識受容体 (PRR)、または c 型レクチン シグナリング細道18,19,20,21の活性化を介して実現されます。DC の活性化のためのさらなるアプローチは、表面 Fcγ 受容体 (FcγR) との相互作用によって抗原を取る能力を悪用します。確かに、重要な写本の多くを示している予防的設定で、腫瘍の増殖を防ぐことができます BM 前駆体の活性化から研の注入腫瘍-IgG ・ IC と確立された腫瘍22,23の撲滅につながることができます.
2 つの最近の論文で、 Carmi らは、腎不全、脾 DC とは対照的血と腫瘍から研に応答できません IgG IC 追加刺激のないを発見しました。FcγR24,25をシグナル伝達を調節するチロシン脱燐酸化酵素の高い細胞内レベルの存在に起因するとこれが見つかりました。、DC の重要なチェックポイントの定義によっては、この作品は成功した DC ベースの予防接種についての重要な洞察を提供しました。FcγR シグナル伝達とおそらく同様のリン酸化カスケードを利用した他のレクチン受容体から信号を有効にする追加の刺激のための要件はこうして分離中に DC のプライミングを回避する必要性を強調します。
したがって、この議定書は研の血および骨髄および脾臓 DC から著しく異なる、腫瘍からの隔離を記述する、プロセス中に検討に値するの注意を強調します。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>StemCell Technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Monocyte Isolation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19861</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C9697-50MG</td><td>Test each lot for endotoxin</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td>Test each lot for endotoxin</td></tr><tr><td>PE-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117307</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101211</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 MHCII</td><td>Biolegend</td><td>107641</td><td></td></tr><tr><td>AF48- CD86</td><td>Biolegend</td><td>105017</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-Ly-C6</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-CD15</td><td>Biolegend</td><td>135523</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation protocol of mouse monocyte-derived dendritic cells and their subsequent in vitro activation with tumor immune complexes

樹状細胞 (DC) が、細胞膜マーカー、移行パターン分布と抗原提示、T 細胞活性化能力で異なる異種細胞集団です。実験腫瘍モデルのほとんどの予防接種は、DC の数百万人を必要とするので、彼らは広く骨髄や脾臓から分離されます。ただし、これらの DC は免疫複合体 (IC) に、おそらく他の Syk 結合レクチン受容体に血および腫瘍 DC の応答から大きく異なります。重要なは、危険準の分子に DC の感度を与え、また内毒素や手順を特定の 1 つの架橋活性化受容体抗体の存在が DC のプライミングにおける結果し、パラメーター影響を及ぼします少なくとも投与量は、それらをアクティブにする必要があります。したがって、ここでは血液・腫瘍からの早期活性化を回避しながら研を分離するための詳しいプロトコルを記述します。さらに、腫瘍 IC、研の活性化とそれに続く分析のためのプロトコルが提供されます。

当初、腫瘍細胞に結合する世間知らずと同種同系マウスからの抗体能力を比較しました。このため、B16F10 LMP 腫瘍細胞はパラホルムアルデヒドで固定され広範囲洗浄します。B16F10 はもともと c57bl/6 マウス肺転移から分離された悪性黒色腫のセルラインです。LMP は KrasG12D から分離した膵腫瘍細胞/+、LSL-Trp53R172H/+、および Pdx 1 Cre マウスと 129F1 マウスで着実に成長しま?...

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Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

単球由来 DC (研) は危険性関連分子のマイナーな量を感じることができるし、簡単にプライミング、したがって。血液、腫瘍、彼らの早期活性化を避けるために考慮すべき重要注意事項を強調しながら免疫複合体とその活性化から研の隔離のための詳しいプロトコルを提供します。

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

isolation-protocol-mouse-monocyte-derived-dendritic-cells-their

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

11.4K ビュー.  Tel-Aviv University. 単球由来 DC (研) は危険性関連分子のマイナーな量を感じることができるし、簡単にプライミング、したがって。血液、腫瘍、彼らの早期活性化を避けるために考慮すべき重要注意事項を強調しながら免疫複合体とその活性化から研の隔離のための詳しいプロトコルを提供します。

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Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

免疫・感染学

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

原発腫瘍から免疫細胞の分離

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

生物学

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

シアリダーゼ処理を用いた単離PBMCからの脱シアル化単球誘導型DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

著者スポットライト:細胞表面のシアリダーゼベースの酵素処理を使用した樹状細胞の成熟 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

要約

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マウス肺樹状細胞の分離

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

単離とマウスリンパ球の活性化

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル

原発腫瘍から免疫細胞の分離

生理学的免疫原性樹状細胞を生成するための新規プロトコル

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

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