テクニカル サポート、レイチェル B. チャニンとアレハンドロ リャノス Chea に感謝します。本研究で使用される系統、アンソニー ・ t. Maurelli、ブライアン p. ハーレー、アレッシオ ファザーノ、ブレット E. Swierczewski とボビー Cherayil に感謝します。この作品は、国立研究所のアレルギーと感染疾患グラント K22AI104755 (C.S.F.) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

1. 試薬の調製
<ol><li>胆汁酸塩培地: トリプシン大豆スープ (TSB) 0.4% の胆汁酸塩 (重量/体積) を含むを準備、50 mL の胆汁酸塩 200 mg を再懸濁しますオートクレーブ TSB。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。毎週新鮮な媒体を作る。 ノート: 定期的に使用される胆汁酸塩は、コール酸ナトリウムと羊や牛の胆嚢から分離されたデオキシ コール酸ナトリウムの 1:1 混合物です。先ほど説明した4グルコースの存在が胆汁酸塩によるバイオ フィルムの形成のため必要でした。TSB がルリア ベルターニカミラ (LB) のスープを基準にしてグルコースを追加します。したがって、赤痢菌分析その他の腸内の病原体のバイオ フィルム形成を誘導するのに十分だったし、。分析する細菌によって別グルコース濃度または別の砂糖の要件が必要な場合があります。</li>
	<li>0.5 水に %w/v クリスタル バイオレット: 500 ml の蒸留水でクリスタル バイオレットの 2.5 g を溶かします。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。</li>
	<li>コンカナバリン A (ConA) かに (FITC) に共役: 1 × PBS で株式を再構成します。集中 10 mg 株式を 25 μ G/ml の最終的な集中に 1 × PBS の 400 μ l を希釈し、光から保護します。</li>
	<li>PBS + ブドウ糖: 10 mL の 1x PBS (最後の血糖値 2 w/v) で 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。</li>
	<li>PBS + 胆汁酸塩: 溶解 10 mL の 1x PBS で 40 mg (0.4% 胆汁酸塩最終的な w/v)。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。</li>
	<li>PBS + グルコースと胆汁酸塩: 40 mg 胆汁酸塩と 10 mL の 1x PBS (0.4 %w/v 胆汁酸塩および 2 %w/v グルコース最終) の 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。</li>
	<li>LB 寒天培地プレートを準備します。</li>
	<li>ホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド修正: 追加 810 μ L のホルムアルデヒド (37% 原液、最終濃度 3%) および 125 の μ L グルタールアルデヒド (25% 原液、最終濃度 0.25%) 14 mL の 1x PBS。徹底的にミックスし、4 ° C で保存修正プログラムは、適切な使用のため寒いはずです。 注意: この修正プログラムは毒性があり有害廃棄物処理が必要です。</li>
	<li>Antifade フィルターとフィルター ソリューション: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 汚れを含む antifade フィルターとフィルター ソリューションを使用して、細菌の DNA を蛍光染色しながら蛍光顕微鏡観察試料の変質を阻害します。</li>
</ol>2. 細菌の準備
<ol><li>無菌培養管の単一、独立した植民地と TSB の 3 mL を接種によってテストする細菌の緊張の一夜の文化を育てます。37 ° C で一晩インキュベート (16-24 h) の 225 rpm で振とうしながらインキュベートします。 注: 系統必要がありますされる restreaked 冷凍庫株からすべて 2 4 週間とに上で保持板にない 2 週間以上古い。</li>
</ol>3. 固相付着試験
注: このアッセイは、96 ウェル プレート法を用いた細菌の付着を定量化します。細菌は、底が平らなプレートに静的に栽培しています。洗濯を行って非付着細菌を排除して細菌付着がクリスタル バイオレットで染色します。水晶バイオレットの汚れは細菌の細胞壁のペプチドグリカンをバインドし、エタノールを用いた可溶化します。付着性細菌の数は、クリスタル バイオレットの保持に基づいて決定されます。
<ol><li>2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + 胆汁酸塩 (BS) とラベルを付けます。</li>
	<li>それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。</li>
	<li>一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。</li>
	<li>滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。3 つのコントロール井戸 (TSB、TSB + BS) テストする各メディアの種類の設定します。</li>
	<li>3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。</li>
	<li>静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。</li>
	<li>プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。</li>
	<li>プレートを軽く傾斜して井戸の下の端にある媒体をゆっくり吸引真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチックの表面に位置する付着性細菌の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。EPS の行列は、培養時間の間に作り出されたマトリックスが白い沈殿として視覚化されます。EPS マトリックスを操作不可します。</li>
	<li>軽く 200 μ L 滅菌 PBS で 1 回洗浄します。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。</li>
	<li>乾燥するプレートを反転します。乾燥する 20 分の最小値を許可します。 注: バイオ フィルムを染色する前に完全に乾燥する必要がありますので、プロトコルは、数時間のこの段階で一時停止また更に夜通し。不完全な乾燥結果と再現性の定量化に影響を与えます、追加乾燥時間は汚損プロシージャに変わりません。</li>
	<li>まあ 150 のそれぞれ実験的に 0.5% クリスタル バイオレットの μ L とコントロールを追加します。</li>
	<li>室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>一度蒸留水 400 μ L で洗浄します。追加されたボリュームは、井戸の側面から残留クリスタル バイオレット染色を削除するのに役立ちます。真空ラインの洗浄を削除します。</li>
	<li>蒸留水を 200 μ l 添加で 5 回洗浄します。真空ラインの洗浄を削除します。 メモ: 徹底的に洗浄は、定量化のため重要です。空白の井戸が蒸留水から明らかが、任意の残留クリスタル ・ バイオレットの汚れが含まれていないときは、次の手順に進みます。</li>
	<li>光から保護、乾燥するプレートを反転します。前述のようにプレートの完全乾燥を確認します。</li>
	<li>95% エタノール 200 μ L で井戸をすすぐ。30 分間、シェーカーでプレートを孵化させなさい。特に高温で蒸発を避けるために 4 ° C でこの手順を実行します。</li>
	<li>プレート リーダーを使用して、外径540を記録します。 注: クリスタル ・ バイオレットの最大吸収波長は近く 590 nm。文献報告から外径540 - 外径5954,13,14,15,16クリスタル バイオレット吸光度の範囲このようにプレート リーダーに基づいて使用可能な波長を選択します。</li>
</ol>4. EPS マトリックス検出
注: これらの無料試定量化し、EPS を可視化します。どちらも、多糖類をバインドするレクチンを用いた EPS が検出されました。蛍光共役タンパク質により定量化 (手順 4.1) か (ステップ 4.2) の可視化ができます。
<ol><li>EPS の半定量的検出<ol>
<li>2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。</li>
		<li>それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。</li>
		<li>一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 希釈)。</li>
		<li>滅菌、黒、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。接種した培の 130 μ L/ウェルを井戸に追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。</li>
		<li>静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。</li>
		<li>培養液を理想的にマルチ チャンネル ピペット ピペットを明確 96 ウェル プレートに転送します。付着性の人口および/またはプラスチックの表面に位置する EPS を中断させることがなくすべての培養液を収集するために慎重になります。脇を設定します。</li>
		<li>1x PBS で 200 μ L/ウェルのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒドを用いた常温 15 分用黒色プレートを修正します。</li>
		<li>付着性の人口を固定すると、ステップ 4.1.6 から上清画分と評価します。プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。<ol>
<li>また、黒い透明な底板の全体の分析を実行できます。このような状況で OD600の値を記録することができ、4.1.7 をステップに進む前にその後培養液を破棄できます。外径600値をデータの正規化に使用できます、場合に菌株間成長率に有意差があります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。</li>
		<li>200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。プレートを軽く傾斜して井戸の下の端では、洗浄をゆっくり吸引真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。</li>
		<li>25 μ g/mL、ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート</li>
		<li>200 μ L の PBS で 2 回やさしく洗います。</li>
		<li>150 μ L の PBS を各ウェルに加えます。488 で蛍光を記録 nm。</li>
	</ol>
</li>
	<li>共焦点顕微鏡可視化 EPS 生産とバイオ フィルムの厚さの計算<ol>
<li>2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。</li>
		<li>それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。</li>
		<li>一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。</li>
		<li>滅菌ガラス coverslips ラウンド 12 mm 滅菌 24 ウェル プレートを設定します。空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 400 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。</li>
		<li>、重複での井戸に接種文化の 400 μ L を追加し、すべての実験条件をメッキまで繰り返します。</li>
		<li>静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。</li>
		<li>TSB 条件、成長および EPS 沈殿物 (白) TSB + BS 状態で成長ない成長および滅菌コントロール ウェルズに白い沈殿物を視覚的に確認します。培養上清を削除します。</li>
		<li>1x PBS でのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド溶液 200 μ L/ウェルを使用して RT で 15 分を修正しました。</li>
		<li>修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。</li>
		<li>200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。</li>
		<li>25 μ g/mL ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート</li>
		<li>軽く 200 μ L/ウェルの PBS で 2 回洗います。</li>
		<li>DAPI と antifade フィルターとフィルター ソリューションをマウントします。 注: ソリューションは、同時に、対比染色として、可視化細菌の細胞内の DNA を染色しながら蛍光ラベルを保持するために DAPI を含む既製、グリセリン ベース マウント ソリューションです。イメージングのサンプルの前にインキュベーション時間のキットの方向と推奨事項に従ってください。DAPI が含まれていない antifade フィルターとフィルター ソリューションを適用する前に、プロシージャを汚す DAPI を実行できます。</li>
		<li>共焦点顕微鏡による評価します。共焦点顕微鏡レーザーを 495 nm/519 nm 励起/蛍光 FITC 可視化のために設定します。2 番目のレーザーを 360 nm/460 nm 励起/蛍光 DAPI を視覚化するために設定します。DAPI チャネルに焦点を当て、バイオ フィルムを探します。DAPI と FITC の両方のチャンネルを使用して完全な厚さを判断して上限を設定し、罫線を下部イメージングします。Z スタックの上下に境界を設定した後すべての 0.25 μ m の画像をキャプチャすることにより完全な厚さ Z スタック画像を記録します。共焦点顕微鏡の詳細についてを参照してください文書パドックらによって17,18,19,20
</li>
		<li>ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) によるバイオ フィルム形成を視覚化し、バイオ フィルムの厚さを計算で 3 D 画像を再構成します。S. 菌胆汁酸塩によるバイオ フィルムの取得平均厚さ 14 μ m4であった。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 分散分析
注: このアッセイでは、バイオ フィルム細菌の分散性を介しての逆アセンブリが検出されます。ここでは、成熟したバイオ フィルムが確立され、その後 (通常翌日)、メディア、PBS に置き換えられますまたは PBS を添加しました。培養上清中のコンポーネントをバイオ フィルムから分離した細菌の数を量的に評価します。
<ol><li>2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。</li>
	<li>それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。</li>
	<li>一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。</li>
	<li>滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類のための 3 つのコントロール井戸を設定します。</li>
	<li>3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、すべての実験条件が 3 通でメッキまで繰り返します。</li>
	<li>37 ° C で 4 24 h のプレートを静的にインキュベートします。</li>
	<li>前に、PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩 + 37 ° C にグルコースを暖めるこれらの試薬の新鮮な毎日を準備します。</li>
	<li>プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。</li>
	<li>真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチック表面に付着性の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。</li>
	<li>200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。</li>
	<li>3 つの井戸に次の 130 μ L/ウェルで洗浄を置き換えます: PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩ブドウ糖。これらの試薬は、あらかじめ 37 ° C に加温する必要があります。</li>
	<li>37 ° C で 30 分の版を孵化させなさい</li>
	<li>37 ° C の定温器からプレートを慎重に取り外します。新鮮な生殖不能の 96 ウェル プレートに培養上清を転送します。</li>
	<li>96 ウェルのプレートまたは希釈のブロックを使用して準備を 10 倍 (1:10) 滅菌 PBS に上澄みのシリアル希薄。 注: 希釈系列ではテストする菌株によって 10-6原液から範囲する必要があります。パイロット実験は、最適な希釈範囲を決定する実行できます。</li>
	<li>スポットは、マルチ チャンネル ピペットを使用して LB 寒天培地の上にそれぞれの希釈の 5 μ L をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。回復コロニー (CFU) の単位を形成を決定する際、翌日と希釈倍率のアカウントにコロニーを数えます。(100% で設定) PBS コントロール x 1 基準 % 分散を計算するには、1 × PBS コントロールのサンプルから CFU の回復によって各処理条件から回復 CFU を割ります。 注: 興味の細菌の緊張のためのルーチン メディア プレートを使用もできます。たとえば、赤痢菌は、コンゴ赤板にめっきすることが。プレートが適切なスポットめっき技術の乾燥を確認します。</li>
</ol>

著者の開示があります。

バイオ フィルム形成の分析は、バイオ フィルムとアッセイ研究所、材料株間変動の動的な性質のために挑戦です。ここでは、再現性を促進するために提供される実験的洞察力と胆汁酸塩の露出に続く腸管病原体のバイオ フィルム形成を決定するいくつかの方法が掲載されています。再現性を確保するための追加の考慮事項があります。第一に、それぞれの観測と発生する変動の統計的有意?...

バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件の中に誘起される重要な細菌の生存戦略です。殺菌の化合物への露出のように抗生物質や栄養の変化または酸素可用性がバイオ フィルム形成によって軽減することができます細菌のストレス状態を誘導します。バイオ フィルムは、サーフェスまたは他の細菌に細菌の付着によって特徴付けられるし、多糖類1,2,3の主にで構成される EPS 行列の分泌を伴います。バイオ フィルム形成はダイナミックなプロセスでイベントのカスケード成熟した付着性を有する細菌群集1,2,3の形成で絶頂に達する。細菌アドヘシン成熟バイオ フィルムの中に添付ファイルを強化する付着性遺伝子発現プロファイルをシフトさせながら初期添付ファイルを容易にするを生成します。同時に、EPS の生産は初期のストレスから細胞を保護するために行列に細菌群集のコートに発生します。バイオ フィルム内の細菌は、成長が遅い。そのため、レンダリングのほとんどの抗生物質は効果がないと。さらに、低成長は、細菌の増殖1,2,3を支持する条件を変更するまで、エネルギーを節約します。過酷な条件が過ぎた後、細菌はバイオ フィルムを分散し、浮遊性ライフ スタイル1,2,3を再開します。従来、バイオ フィルムは表面に観察される、感染貯水池カテーテルと住居のデバイス1,2,3に存在のための永続的な臨床的課題を表します。
バイオ フィルム形成最近述べたいくつかの腸病原体;小腸または結腸4感染細菌。赤痢菌種、の感染は人間のコロンの消化管の大部分を通過後に発生します。小腸を通過、中に赤痢菌が胆汁; にさらされています。同時にほとんどの細菌5を殺しながら、脂質の消化を容易にするために腸に分泌される脂質分解洗剤です。腸内の病原体は、胆汁6の殺菌の効果に抵抗するユニークな能力を持っています。私たちの最近の分析は生体内で活用-グルコースとs. 菌で堅牢なバイオ フィルム形成を示すため胆汁酸塩の組み合わせだけでなく、赤痢菌、病原性大腸菌、およびの他の種のようにサルモネラ4。以前は、サルモネラ血清型慢性感染症7,8,9,中に胆嚢のユニークな植民地化のため胆汁によるバイオ フィルムを形成する発疹チフスを示した10.11ビブリオカンピロバクター12先行研究が胆汁に対するバイオ フィルム形成を実証するさらに、します。したがって、分析は他の病原体に胆汁によるバイオ フィルム形成観察を拡張、胆汁に保存された腸内病原体応答のデモを確立するのに役立ちます。慢性的なバイオ フィルム細菌の遺伝子の転写は限られているし、細胞老化は1,2,3を発生することが, とは異なり腸胆汁によるバイオ フィルムがより本質的に一時的である提案します。この過渡病原性バイオ フィルムはように品質証明され急速な分解 (分散分析で見られる) と、バイオ フィルムの人口4,6で観察された病原性遺伝子発現を強化します。 
バイオ フィルム形成は多面的なダイナミックなプロセス、および胆汁酸塩の使用開始因子が最近最も腸内病原体の説明だけされて、ツールやテクニックを使用は、従来の方法のユニークで創造的なアプリケーションです。したがって、ここでは胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成、バイオ フィルムから細菌付着、EPS 行列の生産と生菌数の分散を含むいくつかの重要な特徴を定量化するための 3 つの無料戦略。これらのテクニックは、赤痢菌の研究に主に利用されています。したがって、他の腸管病原体の評価が最適化を必要とします。それにもかかわらず、3 つすべてのアッセイから肯定的なデータはバイオ フィルムの識別をサポート、胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の再現可能なプロトコルを確立します。

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件やストレスの時代下で細菌が発生するダイナミック ・多段階のプロセスです。胃腸管内輸送中と胆汁の露出、人間の消化の法線成分に腸内病原体の重要なストレス反応が誘起されます。胆汁の殺菌効果を克服するためには、多くの腸病原体は、小腸を通過するときに生存を許可するいると仮定バイオ フィルムを形成します。固相の付着試金と同様に細胞外高分子物質 (EPS) マトリックス検出と可視化によるバイオ フィルム形成を定義するための方法論をご紹介します。さらに、バイオ フィルム分散評価が感染プロセス中に細菌のリリースをトリガーするイベントの解析を模倣するように表示されます。クリスタル バイオレット染色、高スループット 96 ウェル プレートの付着試験で付着性細菌を検出するために使用されます。EPS 生産評価、すなわち 2 つの試金によって決まります顕微鏡 EPS 行列と多糖類の蛍光共役結合レクチンと半定量分析の染色します。最後に、コロニー カウントとめっきによるバイオ フィルムの分散を測定します。複数のアッセイから肯定的なデータは、バイオ フィルムの特性をサポートし、他の菌株による胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を識別するために利用することができます。

図 1、胆汁酸塩を含んでいる媒体で六つの腸病原体テスト次の成長のほとんどのバイオ フィルム形成が誘導されます。付着性細菌の胆汁酸塩の露出はほぼすべての株で観察される後の大幅な増加をテストしました。例外は絋エシェリヒア属大腸菌(EAEC);ただし、Δaaf変異4の誘導の観察。結果を示すこと追加接...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を分析するリーダー分散。

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K ビュー.  Massachusetts General Hospital. このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を分析するリーダー分散。

ビデオ: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

免疫・感染学

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

結腸上皮細胞の 赤痢 菌感染を分析するためのプロトコル

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

著者スポットライト: 赤痢 菌感染症の理解と闘いの進歩

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

赤痢菌による上皮細胞感染解析

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

生物学

アシネトバクターのバイオフィルム形成の評価とバイオフィルムの特性評価

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

著者スポットライト:アシネトバクターバイオフィルムの定量化、評価、および視覚化のための包括的なプロトコル 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法

要約

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オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

赤痢菌による上皮細胞感染解析

赤痢菌による上皮細胞感染解析

赤痢菌による上皮細胞感染解析

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

要約

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オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

赤痢菌による上皮細胞感染解析

赤痢菌による上皮細胞感染解析

赤痢菌による上皮細胞感染解析

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法